全 文 ：植 物 学 报 29 8 5, 2 7 ( 3 ) : 2 7 7一2 8呼
A e t 。 习匕t a ” i“ is n i e a
用毛地黄皂普分离异形胞及其对
光合和固氮的某些特性的影响 ’
钟泽璞 张慧苗 白克智
(中国科学院植物研究所 )
摘要 本文叙述一种从多变鱼腥藻 ( A o b二仰 。 厅ab “ 行 ) 中分离异形胞的简易方法 。 这
种新方法是用毛地黄皂昔和甘露醇的 T sE 缓冲液处理藻丝 ,破碎营养细胞 , 并结合分级离心
的方法获得异形胞 。 所分离异形胞的纯度 ,在显微镜下观察达到 90 % 左右 。 当提供 A IT , 和
N 朴 5 2 0 ; 时 ,能够测到所分离异形胞的固氮活性 ,其最大速率是 5 . 31 毫微克分子 C Z H , / 1 0 ` 异
形胞 /小时 , 为整体藻丝活性的 10 % 。 这种比活性 ,在 4 小时内 ,甚至更长的时间内 ,保持不变 。
但是 ,在氢气下和照光条件下 ,分离的异形胞缺乏受光促进的固氮活性 。 分离的异形抱在 7 7 “ K
下波长为 4 3 0n m 光激发的荧光光谱和完整藻丝的相比 ,它缺乏属于光合系统 1 的 6 8 5 n l 和
69 知。 的荧光发射峰 ,而仅具有光合系统 l 的 7 3 On m 荧光发射峰 。 当提供 D CI p 和抗坏血酸
时 ,被压碎的异形胞能够光还原甲基紫精 , 其活性为 36 0 消耗 o : 的微克分子 /毫克叶绿素 /小
时 。 上述结果表明用毛地黄皂昔法分离的异形胞具有较完整的 D CI PH Z一M v 的 SIP 活性 。
关键词 光合 ; 固氮 ;异形胞 ; 多变鱼腥藻 ;毛地黄皂昔
近几年来 ,固氮蓝藻的研究主要集中在蓝藻的光合 、 固氮和氢代谢的关系上 2[, ` , , , 。 而
固氮丝状蓝藻大多具有异形胞 , 它是固氮的主要场所 。 因此了解异形胞的性质对于阐明
蓝藻的光合 、 固氮和氢代谢的关系是十分重要的 。 研究异形胞的性质首先要从蓝藻中分
离出异形胞 。
在过去 , 已发表的分离异形胞的方法中 ,有物理的方法和超声波法 14j[ 和压榨法 13[] 。 也
有化学和生物化学的方法如溶菌酶法〔5J 、 甘油和 N on ide t p 40 相结合的方法切 。 它们为研
究异形胞生物化学性质提供所需的材料。 本文报告应用毛地黄皂昔和甘露醇从多变鱼腥
藻 中分离出异形胞的简易的新方法 , 并且对所分离的异形胞的光合和固氮特性进行了初
步研究 。
材 料 和 方 法
(一 ) 藻的来源及其培养条件
月: a乙a 。 。 a o a汀 a b i l i ; ( A T C C 2 9 4 1 3 ) 来自美国凯特林研究室 ( K e t e r r i n g L a b o r a t o r y ) ,
本文于 19 83 年 10 月收到 , 19 8斗年 3 月收到修改稿。
* 本工作得到周佩珍和王发珠同志的帮助 。 异形胞荧光光谱和吸收光谱由王淑芝协助完成 ,在此一并致谢 :
植 物 学 报 27卷
用 l Al en,s 无氮培养液培养〔幻 。 培养物置于装有 7 0 毫升培养液的 1 0 0 0毫升三角瓶中 ,
通人空气 , 在 28 一 30 ℃ 下 , 在 日光灯下连续照光培养 。
(二 ) 异形胞的分离
1
. 用毛地黄皂营法制备异形胞 取 2一 4 克湿藻丝 , 用 50 毫升 p H .7 2 的 ET s 缓冲
液 ( 10 m M ET s , l m材 gM C I Z , 10 m M E D T A N 。 , 用 o
.
IN N
a o H 调 p H 至 7 . 2 ) 洗涤
l一 2 次 。 洗涤过的藻丝按每克湿藻丝加人 10 毫升毛地黄皂昔溶液 , 其比例为 1 : 10 。 毛
地黄皂昔溶液的组成 : l o m从 ET S ; 10 m M E D TA N a ; l mM M g C 12 ; 0
.
3多 D ig i t o n i n ,
o
.
7M 甘露醇 , 并用 o . I N N a 0 H 调 p H 到 7 . 8。 和藻丝相混合的毛地黄皂昔溶液 ,在 自控
水浴摇床上 ,在 30 ℃ 下振荡 50 分钟 ,振荡次数为 1 0 一 12 0 次 /分钟。 然后 , 用 M s E G F -
8 型离心机离心 5 分钟 , (转速 2 0 0 0转 /分 )得到的上清液为营养胞破碎部分。 其沉淀部分
重新用 T E S 缓冲液离心洗涤二次 , 即为分离的异形胞部分 。 以上全部操作在厌氧条件
下完成 。 所使用的 ET S 缓冲液 , 每毫升含有 0
.
5 毫克 N a Z匀。 。
`
2
. 用溶菌酶法制备异形胞 1[ lo
(三 ) 乙炔还原分析
固氮活性的测定采用乙炔还原分析法1[] 。
(四 ) 叶绿素含量测定
按 rA on lne , 法进行。 或对每毫升中异形胞数进行计数。
(五 ) 光谱测定
吸收光谱测定用 日立 3 56 型双波长双光束分光光度计 。 荧光光谱测定用 日立 M P F 一 4
型荧光分光光度计进行。
曰 1 步父旦腥澡
a
.整体藻丝 b .用毛地黄皂昔法分离的异形胞 c .用溶菌酶法分离的异形胞
Fi g
.
a
。
I n t a e t f i l
` i n e n t s . b .
A刀 召 b“ 心陀 况 艺口 r了己 b i l i ` .
H e t e r o e y s t
e
.
H
e t e r o e y s t s i s o l a r e d b y Iv s o z e m e 川 e t h o d
i s o l a t e d b y D i g i t o n i n m e
Lh o d
·
o f P e t e r s o n
,
R
.
B
.
a n 〔1 W o l k , C
。
P
一川 1
钟泽璞等 :用毛地黄皂营分离异形胞及其对光合和固氮的某些特性的影响 27 9
按极谱法测定甲基紫精光还原的氧吸收圈 。 在 2, ℃ 下使用环式 q 电极 。
实 验 结 果
(一 ) 用毛地黄皂营法分离的异形胞以及与固氮活性的关系
用毛地黄皂营缓冲液破碎藻丝营养细胞的效果是和缓冲液的毛地黄皂昔 、 甘露醇的
浓度 , 缓冲液的 p H , 处理的温度和时间以及藻龄等诸因素有关 。 其 中以缓冲液的 p H 对
破碎营养胞的效果影响最大 ,其最适 p H 值为 7 . 8 。 当 p H 值低于 7 . 8 时 , 毛地黄皂营缓
冲液不能破碎营养胞 。
用毛地黄皂营法制备的异形胞和用溶菌酶法制备的异形胞的照像 (图 l )o
当反应系统中加人 N a Z凡q 和 A PT (包括 A开 发生系统时 ,用毛地黄昔皂法得到的
异形胞能够厕到固氮活性 ; 而在破碎的营养胞粗提物部份未能检测 出固氮活性 (表 l ) 。 以
上结果表明 ,所分离的异形胞具有固氮活性 ,但仅相当于藻丝体的固氮活性的百分之十 。
表 1
T a b l e
用毛地黄皂普溶液处理 后 , 多变鱼腥藻各部分的固氮活性 *
N i t r o g e n a s e a c t i v i t y
t r e a t e d w i t h
i
: :
f r a
e t i o n s o f A n a石a 心作 a 扩 a 尸i a bi li`
d i g i t o n in s o l u t i o n *
材 料
M
a t e r i a l
C ZH
Z 还原活性
(毫微克分子 C Z H ; / 1。“ 异形胞 /小时 )
C Z H
Z r e d u e t i o n
a e t i
v
i t y
(
n , n o l e s C
,
H
Z
/ 10
6
h e t e r o c y s t s / h )
整体藻丝
I n t a c t f i l
a
m e n t s
营养胞 部份
V e g e t a t i
v e c e l l
异形胞 部份
H e t
e r o e y s t s
* 整体藻丝的固氮活性是在光下完成的 , 反应时 , 不加人 N为 5 2 0 ; 和 A T P 等试 剂 ; 营养胞 部分和异形胞部分
的固氮活性是在暗中完成的 (和在光下测定的结果相同 ) , 反应系统组成 ( 2 毫升 :) 50 m M 磷酸肌酸 ;5 m M
A T p ; 0
·
s m g 磷酸肌酸激酶 ; s m M M gC 12 ; I Om M N a Zs Z o ` ; 5 0m M T E s
* T h
e n i r r o g e n a s e a e t i
v
i t y i n i n t a c t f i l a m e n t s w
e r e p e r f o r m e d u n d e r l i g h t w i t h o u t N a
Zs Z O
; 议 n d A T p
i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e
.
T h e m i t r o g e n a s e a e t i v i t y i n
v e g e t a t i v e e e l l a n d h e t e r o e y s t s w e r
e p e r f o r
, n e d i n
t h 。 d a r k (
t h e s a m e r e s u l t w a s d e t e r m i n e d u n d e r l ig h t )
.
T h e C o m p o s i r i o n o f t h
e r e a e t i o n s y s t e m
( Zm l ) w
a s : 5 0 o M 。 r e a t i n 。 p h o s p h a t e , 5 m M A T p , 5 m M M g C 12 , 10 m M N a ZS , 0 4 , 0
.
5 m g e r e a t i n e
k i n a s e
,
5 0 田M T E S
在不同量的 A PT 下 ,测定用毛地黄皂昔法分离异形胞的 C Z玩 还原活性 , 发现在提
供 A PT 发生系统时 ,异形胞的 q H ; 还原活性在 斗小时内 , 或更长的时间内是线性的 。
这表明用毛地黄皂昔法制备的异形胞尽管固氮活性较低但较为稳定 , 其固氮酶不容易丧
失其活性 。
在氢气和照光条件下 , 用毛地黄皂普法所分离的异形胞的 C Z H Z 还原活性低于用溶
菌酶法分离的异形胞 ,其数值还不足完整藻丝的活性的百分之一 ,而后者占完整藻丝活性
的 20 外 (表 )z 。 以上结果表明用毛地黄皂昔法分离的异形胞在 H : 条件下 , 缺乏受光促
进的固氮活性 。
2 80 卷植 物 字 报 27 是
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Q~ 下一打一一犷一介犷一一穿一一一小时 卜
图 2不 同量 AT P对异形胞固氮酶活性的影响
1
.
0
.
5毫克 T A P 2. 1 毫克 T A P3 . 3 毫克 AT P
4
.
3 毫克 T A P和 T A P发生 系统 。 反应条件和表 I 相同
Fi g
,
.
2 E f f e e t o f d i f f e r e
n t a m o u n t s
o
f A T P o n n i t r o g e n a s
e a e t i
v
i t y o f h e t e r o e y s t s
1
.
0
.
5 m g A T P
,
2
.
l m g A T P 3
.
3m g A T p 4
.
3 m g A T P a n d
A T p g e n e r a t i n g s y s t e m
.
R e a e t i o n e o n d i t i o n a s i n t a b l e l
表 2 多变鱼腥藻完整藻丝和异形胞在光下和氢气条件下的 C Z H , 还原活性 *
1
`
a (〕 l e Z e : H , r e ` lu e t i o n a e t i v i t y i n i n t a e t f i ] a m e n t s a l飞d i s o l a r e 毛{
h e t e r o e y s t s l z n d e r l ig h t
a n d u
, ;
d e r h y d r o g e n *
M
a t e f i a l
毛 地黄皂普法
D i g i t
o n i n m e t h o d
溶菌酶法
L y s o z e n l e m
e t h o d
材 料 C Z H : 还原活性
C Z H
Z r e d u e r i
o rt a e t i v i
`
y
(毫微克分子 C : H Z / 1。` 异形胞 /小时 )
( 。 m o l e C
z
H
Z
/ 1 0
`
h
e t e r o e y s一s / h )
完整 , 未经洗涤的
藻丝
I n t a e t f i l a m
e n Ls
(
u n w a sh e d )
在 A r 离心 , 并重
新悬浮的藻丝
I n t a e t f i l a m e n t s
(w
a s h e d )
制备的异形胞
l s o la t e d h e Le r o e y s t s
5 5
.
2 ( 10日) 1 02
,
6 ( 1 0 0)
2 3
.
4 ( 42 ) 6 8
.
4 ( 6 6)
0
.
6 ( l ) 2 1
.
0 (加)
* 反应在光下完成 。 照光强度 1 5 0 00一2 0 00 0 l x , 气相组成 9 0% H , 和 1 0% c Z H :
* T h e a s s a y s w e r e p e r for 衅 d u 二 d e r li g h t . L ig h t i n t e n s i t y 2 0 0 0 0 l x , g a s p h a s e 1 0% e : H Z i n H :
(二 ) 用毛地黄皂昔法制备的异形胞的光合特性
用毛地黄皂昔法制备异形胞的吸收光谱和荧光光谱 。 图 3 表明在 7 7 “ K 下完整藻丝
营养胞粗提物和异形胞的吸收光谱。
3 期 钟泽璞等 : 用毛地黄皂昔分离异形胞及其对光合和固氮的某些特性的影响 21 8
臼 uL弓工于一Q功 q招
夕ù-门一。川娜督蓄翼
波 长 wa 、 el e ng th( nm )波长 wa v el e ng r h( nm )
图 3 图 斗
图 3 多变鱼腥藻的完整藻丝 (功 , 营养胞粗提液 (2) 和异形胞 ( 3) 在
7 o7 K 下 的吸收光谱
F i g
.
3
.
A b s o r p Li o a : e c 、 r a o f i n t a e t f i l a m e n t s ( l )
, v o g o t a t i v e 。 e l l e x t r a e t
( 2 )
a n d i s o l a t e d h e t e r o e y s t s ( 3 ) f
r o m A o a b a , 。 a o a , , a b月 i` u n d o r 7 7 O K
图 4 多变鱼腥藻的完整藻丝 ( 1 ) , 营养胞粗提液 ( 2 )和异形胞
( 3) 的荧光光谱激发光波长 4 3Ol m )
F i g
.
4
.
F lu o r e s e e n e
。 e m i s s i o n sp e e t r a o f i n t a e t f i la m e n t s ( 1)
, v e g e t a t i v e 。 e l l e x t r a e t
( 2 )
a n d h e t e r o e y s t s ( 3 ) f
r o m 才。 a b a 。 , a t, a , i a b打i , ( E x c i t a t i o n w a v e l e n g t h 3斗0 n m )
从图中可以看 出在 5 50 一 6 50 毫微米藻胆色素吸收范围内 ,异形胞和完整藻丝 , 营养
胞不同 , 它的 6 20 mn 和 68 o n m 的吸收比例变大 。 这说明在异形胞分化后 , 它内部的藻蓝
蛋白的含量较营养胞为低 。
图 4 表明在 7 O K 下当用 4 30 毫微米光激发时 , 完整藻丝营养胞粗提物和异形胞的荧
光光谱 。 所得到的异形胞的荧光光谱显示出一个 7 30 毫微米的荧光发射峰 , 为光合系统
I 叶绿素 a 的特征峰 ,但缺乏和光合系统 n 有关的 6 85 和 6 95 毫微米的荧光发射峰。 营
养胞粗提物除在 7 30 毫微米处具有光合系统 I 的特征峰外 , 同时也具有 68 5 和 6 9 5n m 的
光合系统 n 的特征峰。 这表明经过毛地黄皂普处理后 , 营养胞和异形胞已很好地分离 。
也表明藻丝的二种细胞在光合系统上的组成存在着明显地区别。
在提供 D cI P 和抗坏血酸时 , 测定毛地黄皂昔和溶菌酶二种方法制备的异形胞和营
养胞破碎液的光还原 甲基紫精的能力时发现 , 两种方法制备的完整异形胞都不具有甲基
紫精光还原能力 (表 3) 。 而经 x 一压榨机处理后 , 两种方法所制备的异形胞 (已破碎 )具有
大致相同的甲基紫精的光还原能力。 这一结果表明在制备异形胞过程中毛地黄皂昔不影
响异形胞的 D C IP H :一M V 的光合系统 I 的活性 , 即对甲基紫精的光还原能力。
植 物 学 报 27卷
表 3 多变鱼腹藻的破碎营界胞 、 完整和破碎的异形胞的甲基紫精光还原能力 *
T a l b e3 T h eo
e t hy lv io log e nv ho to r od u e e eap a ei ty o fv eg e ta tiv e e el l (
r u n tur e )a nd
is o la t ed h e t er o ey s ts (
r up tr u eo r i n ta e t )o f A” a ba己 a n夕 a尹 ia b若11` s up p l i ed i w t ha n
eo xg e no us el e e tr o nd o n
o* r
材 料
毛地黄皂昔法 溶菌酶法
(消耗 0 2的微克分子 /毫克叶绿素小时 )
M
a t er ia l Dig i to ni nm
e t hod Ly s o z e
i n er n e t hod
(o
: eo ns um n t ed 二0 1 /m g C l h h )
破 碎 7 23 1 0 9
R up tur e
完 整 0 0
I n ta` t
破 碎 3 60
R up tur e
* 反应混合物的组成 3 (毫升 10 m MH E PE S缓冲液 p H 7 . 5): 2.s m M抗坏血酸 , 7火 10乃对 2 , 6 酚靛酚 , S K
1 0
一 ,
M甲基紫精 , 0 . 0 1 m M N a N 3 , 5一 3 0拜 g 叶绿素 , 温度 2 5 oC , 照光强度 2 5 , 00 0 Ix 。
* T h e e o m p
o s i t i o n o f t h
e r e a e 亡i o n m i x t u r e in 3 m l o f I D ; n M H E p E S 飞、 u f f e r , p H 7 . 5 , w a s : 2 . 5 m M
a s e o r b a t e , 7义 1 0一 , M Z , 6一 d i e h l o r o 一 p h e n o l i n d o p h e n o l ; S K 1 0一 SM m e t h y l v i o l o g e n , 0 . 0 1 m M N a N 3 , 5
一 3 0 拼9 C h l o r o p h y l l a · T h e t e m p e r a t u r e 2 5 oC , .I i g h t i n t e n s i t y 2 5 , 0 0 0 l x
讨 论
和其它制备异形胞的方法相比较 , 应用毛地黄皂昔的方法从多变鱼腥藻分离异形胞
较为快速和简便 。 用毛地黄皂昔破碎营养胞的碎片较其他方法为小 , 因此在低速离心时 ,
多数营养胞碎片保留在上清液部分 , 易于和完整的异形胞分离开来 。 另外此方法破碎营
养胞只在一个简单的容器中进行 , 因此厌氧操作也较其他方法更容易掌握 。
用毛地黄皂普法制备的异形胞在有 A仰 和 N 、 S Zq 存在时 , 具有固氮活性 , 其活性
仅相当于整体藻丝的 ,一 10 多。 但是它的固氮比活性在 4 小时 , 甚至更长的时间内 , 保持
不变 。 我们认为异形胞的固氮活性偏低的原因 , 可能是由于 A即 和 N 匆 5 2 0 ; 等试剂进
人异形胞受到限制的原故 , 而不是制备异形胞过程 中固氮酶的失活。 毛地黄皂普不影响
固氮酶活性 。 异形胞可以维持较长时间的固氮活性也说明异形胞的固氮酶不受毛地黄皂
昔的影响 。 用超声波制备的异形胞 〔9J , 其乙炔还原比活性仅在 20 分钟内是线性的 , 它的
固氮酶活性的稳定性不如用毛地黄皂昔法制备的异形胞 。
毛地黄皂昔法制备的异形胞几乎失掉在氢气条件下受光促进的固氮活性 , 这说明毛
地黄皂营在制备异形胞过程中损害了异形胞的光合固氮活性 。 毛地黄皂普是用于破碎高
等植物叶绿体光合膜的试剂〔 8J , 因此我们推测毛地黄皂普可能损伤异形胞的类囊体膜 , 从
而引起异形胞在 H Z 下受光促进的固氮活性的丢失 。
从毛地黄皂昔方法制备的异形胞的吸收光谱和荧光光谱的结果和 eP et sr C n 等 10[J 用溶
菌酶法制备的异形胞所获得的结果相同 。 这表明用毛地黄皂普法所分离的异形胞和其他
方法所分离异形胞相比较 , 是其构造比较完整 。 此外当异形胞的吸收光谱和荧光光谱和
3期 钟泽璞等 : 用毛地黄皂昔分离异形胞 及其对光合和固氮的某些特性的影响 2 83
营养胞粗提液的吸收光谱和荧光光谱相比较时 , 就更明显地表明分化后的异形胞在光合
特性上和营养胞十分不同 , 它不具有执行光合系统 n 的功能结构 。
用毛地黄皂营法分离的异形胞和用溶菌酶法制备的异形胞几乎具有相同的甲基紫精
光还原的能力 , 这表明毛地黄皂昔在制备异形胞过程中对异形胞的 D CI PH Z一 M v 的
SP I 活性影响很小 。 因而我们推测异形胞的 SP I 的 D CI P H Z一 M v 的光合电子传递部分 没有遭到毛地黄皂普的破坏 。 因此应用这个方法所制备的异形胞尽管在氢气条件下 ,
几乎失掉受光促进的固氮活性 ,但仍至少保留着 D CI P H Z一M v 的 SP I 活性 。
参 考 文 献
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J
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C
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P
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G e r ol a
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F
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M
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G alr
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b y id g it o n i n o f e h lo r叩 l a s t m em b r a n e s . 尸E刀5 L e zt e , s , 1 1 5: 3 9一42 .
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2 8 4植 物 学 报 7 2卷
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