全 文 ：蓝猪耳花粉管细胞壁超微结构的 FESEM和 AFM比较研究
吴娟子 (江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京 210014)
摘要 ［目的］比较场发射扫描电镜(FESEM)和原子力显微镜(AFM)观察蓝猪耳花粉管表面形貌和细胞壁中纤维素微纤丝排列的效
果。［方法］蓝猪耳花粉离体培养 2 h后，利用 FESEM和 AFM原位观察无损的花粉管表面形貌和细胞壁的精细结构。［结果］FESEM可
见花粉管表面粗糙的网状结构;AFM可获得花粉管的三维立体图像，并可见花粉管细胞壁物质的精细结构和纤维素微纤丝的排列情况。
［结论］AFM是一种观察花粉管表面结构和细胞壁中纤维素微纤丝排向的有效手段。
关键词 花粉管;蓝猪耳;纤维素微纤丝;AFM;FESEM
中图分类号 Q942． 4 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)35 －21802 －03
Ultrastructure of Pollen Tube Cell Wall in Torenia fournieri L． Observed by FESEM and AFM
WU Juan-zi (Institute of Animal Sciences，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014)
Abstract ［Objective］To compare the effects of FESEM and AFM observing the surface topography and cellulose microfibrils arrangement of
pollen tube cell wall in Torenia fournieri L． ．［Method］After 2 h culture，the surface topography and cellulose microfibrils arrangement of pollen
tubes were observed by FESEM and AFM．［Result］FESEM image revealed the rough network structure of pollen tube，AFM revealed the three-
dimensional images of pollen tubes and the fine structure of cell wall and the cellulose microfilaments orientation．［Conclusion］AFM was a pow-
erful technique for examining the surface topography and cellulose microfibrils arrangement of pollen tube wall．
Key words Pollen tube;Torenia fournieri L;Cellulose microfibrils (CMFs);AFM;FESEM
基金项目 江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(11)4048)。
作者简介 吴娟子(1977 － ) ，女，湖北京山人，助理研究员，博士，从事
牧草育种及其产业化关键技术研究，E-mail:wjz． ninghan@
gmail． com。
收稿日期 2011-10-13
植物细胞壁，尤其是纤维素微纤丝(Cellulose microfila-
ments，CMFs)是调节细胞生长和生长方向的主要因素［1］。虽
然已有研究报道花粉管生长过程中细胞壁的功能，如控制细
胞形态、抵抗细胞内膨压和外界机械压力、粘附通道细胞
等［2］，但对细胞壁调控花粉管形态的机制还知之甚少。细胞
壁中纤维素微纤丝的沉积和排列被认为是调节细胞形态和
伸展方向最重要的步骤之一［1］。在扩散型生长(Diffuse
growth)的细胞中，根细胞中微纤丝的排向已被广泛研究，结
果表明在快速伸长的细胞中 CMFs 近乎垂直于细胞伸长的
主轴方向［3 －4］。但是，对于顶端极性生长的花粉管，很少有
研究关注 CMFs排列与花粉管生长方向和形态之间的关系，
有关花粉管中 CMFs 排列的信息非常有限。在抽提的矮牵
牛和百合花粉管细胞壁中，CMFs与花粉管纵轴成 45°;在矮
牵牛花粉管顶端 CMFs呈随机排列［5 －6］。研究结果表明，极
性生长的花粉管中，CMFs调控细胞生长方向的机制可能与
其在扩散型生长细胞中的调节机制并不完全相同。
花粉管是一种细长的管状细胞，为典型的极性生长细
胞，其生长仅限于顶端区域，导致其细胞壁组分沿花粉管纵
轴方向呈不均一性分布［7］。采用传统的化学抽提方法，只能
得到花粉粒和整个花粉管细胞壁的混合样品。当仅对细胞
壁的一小块区域感兴趣时，样品的分离会是一个难题，而且
该方法对细胞壁具有极大的破坏性。因此，对花粉管细胞壁
的研究需要进行无损的原位观察和分析。场发射扫描电镜
(Field-emission scanning electron microscope，FESEM)和原子
力显微镜(Atomic force microscope，AFM)提供了有效的技术
支持。它们能够提供样品表面的高分辨率成像，已成功地用
于直接观察一些“完整”的细胞壁，如黄瓜下胚轴细胞和玉米
薄壁组织细胞等［8 －9］。
笔者比较了 FESEM 和 AFM 原位观察蓝猪耳(Torenia
fournieri L．)花粉管表面形貌和细胞壁中 CMFs排列的效果，
为进一步研究植物细胞壁，尤其是 CMFs对花粉管形态和生
长方向的调节机制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 蓝猪耳种植于温室内，光照 16 h，湿度
50%，室温 25 ～28 ℃。取开花第 2天的新鲜花粉用于试验。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 花粉管的离体培养。花粉采用液体培养的方式，以
改良 Nitsch培养基作为基本培养基(NH4NO3 80 mg /L、KNO3
125 mg /L、MgSO4 · 7H2O 125 mg /L、KH2PO4 125 mg /L、
Ca(NO3)2· 4H2O 50 mg /L、H3BO3 10 mg /L、MnSO4·4H2O 3
mg /L、ZnSO4·7H2O 0． 5 mg /L、CuSO4·5H2O 0． 025 mg /L、
Na2MoO4·2H2O 0． 025 mg /L、蔗糖 50 000 mg /L、酪蛋白 500
mg /L) ，培养基中添加 4 mg /L IAA，pH5． 8 ～ 6． 0。在 3 cm培
养皿中放置 2 ～ 3 块上表面涂有 0． 1% (w /v)多聚赖氨酸
(poly － l － lysine，Sigma 公司)的盖玻片上，室温风干。用微
针从花药中挑取适量的花粉洒入培养基中制成花粉悬液，取
1． 5 ml花粉悬液置于 3 cm培养皿中，再将培养皿置于湿盒
中，25 ℃暗培养，定时取出进行观察。
1． 2． 2 花粉管表面超微结构的场发射扫描电镜(FESEM)观
察。培养 2 h后，取花粉管在固定液(2． 5%多聚甲醛，5%蔗
糖，10 mmol /L PBS，pH 7． 2)中室温固定 1 h。10 mmol /L PBS
清洗 4 ～5次，分别置入 30%、50%、70%、85%和 95%乙醇中
逐级脱水各 25 min，然后在 100%乙醇中脱水 3 次，每次 20
min。干燥器中室温干燥。将盖玻片用双面胶带粘贴于铜台
上，真空条件下镀金膜，在 FESEM(Sirion 200，FEI，Eind-
hoven，the Netherlands)下观察。重复 3次，每次观察 3 ～ 4 根
花粉管。
1． 2． 3 花粉管表面超微结构的原子力显微镜(AFM)观察。
花粉管的固定方法同“1． 2． 2”。花粉管用 10 mmol /L PBS清
洗 4 ～5次后，再用去离子水清洗 4次;将样品置于冷冻干燥
仪(Maxi Dry Lyo，Heto － Holten，USA)中冻干。在 AFM
责任编辑 陈玉敏 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(35):21802 － 21804
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.35.006
(NanoScope IV Extended MultiMode AFM，Digital Instruments，
Inc．，Santa Barbara，CA)下，采用轻敲模式在大气中观察，相
对湿度 50% ～60 %，温度 20 ℃，探针为商品化的 Si探针，悬
臂的共振频率为 300 kHz，弹性系数为 42 N /m，所有图像分
辨率 =256 × 256 像素。利用专业软件 Nanoscope 5． 12进行
AFM操作和后续的图像处理。重复 3 次，每次 1 ～ 2 根花
粉管。
2 结果与分析
2． 1 蓝猪耳花粉管表面超微结构的 FESEM 观察 利用
FESEM观察蓝猪耳花粉管表面超微结构，结果发现花粉管
表面高低起伏，形成粗糙的网状结构(图 1A) ，未见其他更精
细的结构。
2． 2 花粉管表面超微结构的 AFM 观察 在光镜下，将
AFM探针放置于花粉管顶端和亚顶端区域。为了便于比较，
将所有聚焦的花粉管区域的纵轴调整至同一方向，所有的
AFM图片均采用同一根探针扫描。低分辨率的 AFM 图片
(20 μm扫描图)可显示花粉管的立体结构，与 FESEM 观察
到的粗糙网状结构相比，花粉管表面光滑(图 1B)。高分辨
率的 AFM图片(1 μm或 2 μm扫描图)显示花粉管表面覆盖
块状结构和(或)纤丝状结构(图 2)。每一结构的高度、直径
以及纤丝状结构与花粉管纵轴之间的角度等参数见表 1。根
据已知的花粉管细胞壁的组成特点，依据其形状和大小，纤
丝状结构可能是纤维素微纤丝(CMFs) ;块状结构可能是富
含果胶的花粉管细胞壁基质。蓝猪耳花粉管细胞壁中 CMFs
的排列在相位图中较高度图中更清晰。花粉管顶端富含彼
此近平行排列的块状结构和少量 CMFs(图 2)。花粉管亚顶
端区域(离顶端 130 ～150 μ m的区域) ，大量的 CMFs彼此近
平行排列，并与花粉管纵轴形成(46． 1 ± 3． 4)° (n = 12)的角
度(图 2)。
注:A．蓝猪耳花粉管场发射扫描电镜图，显示花粉管表面粗糙
的网状表面。比例尺 =1 μm。B．蓝猪耳花粉管原子力显微
镜观察图。比例尺 =1． 3 μm。
Note:A． FESEM images，revealing the rough network structure of
pollen tube． Bar =1 μm;B． AFM images． Bar =1． 3 μm．
图 1 蓝猪耳花粉管表面超微结构的场发射扫描电镜和原子力显
微镜观察结果
Fig． 1 FESEM and AFM of the ultrastructure of Torenia fourni-
eri pollen tubes
3 讨论与结论
透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)常常被用于植物细
注:A．培养 2 h的花粉管顶端区域的高度图;B．培养 2 h的花粉
管顶端区域的相位图;C．培养 2 h的花粉管亚顶端区域的高
度图;D．培养 2 h 的花粉管亚顶端区域相位图。比例尺 =
200 nm，花粉管的生长方向均是垂直向上;虚线圈表示表面
的块状结构，虚线表示表面的纤丝状结构。
Note:A． Height images of the apical area of pollen tube cultured for
2 h;B． Phase images of the apical area of pollen tube cul-
tured for 2 h;C． Height images of the sub － apical area of pol-
len tube cultured for 2 h;D． Phase images of the sub － apical
area of pollen tube cultured for 2 h． Scale = 200 nm，the
pollen tube grows vertically upward;dotted circle represents
the surface block － like structure，dotted line represents the
surface fibrous structure．
图 2 蓝猪耳花粉管表面超微结构的原子力显微镜观察结果
Fig． 2 AFM images of pollen tubes in Torenia fournieri
表 1 蓝猪耳花粉管 AFM图像中块状结构和纤丝状结构的物理参数数
量分析
Table 1 Quantitative analysis of block-like and fibrous structures in
pollen tubes of Torenia fournieri based on AFM images
区域
Region
结构类型
Structure
高度
Height∥nm
直径
Diameter∥mm
顶端 Apical 块状结构 9． 69 ±4． 03 72． 01 ±14． 30
亚顶端 块状结构 3． 75 ±0． 75 42． 13 ±8． 00
Sub-apical 纤丝状结构 2． 67 ±0． 67 28． 09 ±2． 86
注:表中数据为 20个样品的平均值 ±标准差。
Note:Data in the table are mean ± SD of 20 samples．
胞壁的观察。TEM具有很高的分辨率，其观察细胞壁有 2种
方式:①制作超薄切片，在 TEM下利用重金属处理切片材料
后的反差来观察样品。但是多糖组分不能很好地被染色，
TEM用于切片中细胞壁的研究有一定的局限［10 －12］，而且该
方法并不能观察到表面形貌和分子排列方式;②通过化学方
法抽提细胞壁物质，然后利用 TEM 进行观察。采用这种方
法可以观察细胞壁组分的分子排列，如纤维素排列方向，但
是并不能做到原位观察。同时，由于 TEM 样品制备十分复
杂，在取材、固定、脱水等过程中样品信息会部分丢失。SEM
也具有较高的分辨率，能够提供样品的原位信息，并且样品
制备过程也较 TEM简单，但是样品必须经过碳膜或金膜包
被［12］。与 TEM相比，FESEM用来观察细胞壁的方法简单直
接，样品不需切片或化学抽提，仅需浅浅包被即可观
3081239 卷 35 期 吴娟子 蓝猪耳花粉管细胞壁超微结构的 FESEM和 AFM比较研究
察［4，13 －14］。因此，FESEM很早就用于次生壁中纤维素微纤丝
排列的观察［15 －16］。近年来，FESEM技术用于初生壁的观察
也较为通用［4，13 －14］。Marga等研究表明，1． 5 cm的黄瓜下胚
轴一分为二纵切后，不经抽提和漂白处理，利用 FESEM可直
接观察到与下胚轴纵轴垂直、整齐排列的纤维素微纤丝［8］。
笔者利用 FESEM观察到蓝猪耳花粉管粗糙的表面结构，但
并未观察到精细的纤维素微纤丝排列。这可能是由于花粉
管表面富含胶状多糖物质，经过镀膜处理后分辨率大大降低
所致。
AFM具有原位、无损，高分辨率等优点，可以在最接近生
理状态的条件下，原位地直接观察样品的精细结构，并能方
便地测量样品表面结构的物理参数。将 AFM应用于细胞壁
的观察，一般用于观察化学分离的细胞壁中的高聚物，只有
少数研究者将其直接应用于整个细胞壁的观察，如黄瓜的下
胚轴、玉米的花粉粒［8，17］。利用 AFM 观察花粉管细胞壁是
非常困难的。蓝猪耳花粉管是一个直径仅 7 ～ 10 μm，长达
几百至几千微米的管状细胞，仅有一小部分花粉管壁粘贴于
玻片，因此当 AFM 探针扫描花粉管表面时，花粉管容易移
动。由于花粉管十分脆弱，其顶端富含粘性的果胶物质，表
面很不平整，这都给扫描带来了很大困难。对于表面柔软、
易脆和粘黏性较强的样品，扫描过程中要尽量减少侧向力对
样本表面的损坏。AFM 有多种扫描模式，其中轻敲模式可
最大限度地减少侧向力对样品的影响。该模式在扫描过程
中针尖与样品表面间断地接触。当针尖没有接触到表面时，
微悬臂以一定的大振幅振动;当针尖接近表面并与表面轻轻
接触时，其振幅减小;而当针尖反向远离表面时，振幅又恢复
到原先的大小。反馈系统根据检测到的振幅，不断调整针尖
与样品之间的距离来控制微悬臂的振幅，使其作用在样品上
的力保持恒定。由于针尖与样品接触，扫描分辩率高，几乎
与接触式的效果一样好;又因为针尖与样品接触非常短暂，
剪切力引起对样品的破坏几乎完全消失。因此，此模式非常
适用于分析柔软、易脆和粘黏性较强的样品。近年来，研究
发现轻敲模式的 AFM获得的相位图可区分样品表面的粘弹
性差异［9］，由于果胶比纤维素具有更高的粘弹性，在相位图
中纤维素和果胶物质能够彼此区分开来［18］。在该研究中，
在光镜下 AFM探针能够准确地定位在花粉管中特定的、感
兴趣的区域，采用轻敲模式，粘附于盖玻片上的蓝猪耳花粉
管能够成功地成像。从 AFM图像中，可以清楚观察到花粉
管表面细胞壁物质的结构和排列，花粉管顶端富含果胶而纤
维素含量较少，这与其他被子植物花粉管细胞壁组分分析结
果相一致［19］;在亚顶端区域，CMFs 彼此近平行排列并与花
粉管纵轴约呈 45°，花粉管细胞壁中 CMFs 的排列在相位图
中较高度图中更清晰。
轻敲模式的 AFM能够提供花粉管“完整无损”细胞壁的
原位信息，能真实反映 CMFs的排列情况，是一种观察花粉管
表面结构及细胞壁中 CMFs 排向的有效手段。对于象花粉
管这样表面结构不均一、细胞壁组成空间分布不均一、富含
胶状多糖的生物样品，AFM比 FESEM的观察效果更佳。
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