全 文 ：⒇文章编号: 1008 3464 ( 2004) 04 0291 05
蓝猪耳再生系统的建立
宾金华 , 禹艳红 , 肖文娟 , 徐曲毅 , 王小菁
(华南师范大学 生命科学学院 , 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东 广州 510631)
摘要: 采用 4因子 3水平的正交设计 , 研究外植体种类、 NAA、 6-BA和光照处理对蓝猪耳愈伤组织诱
导的影响 , 结果表明 , 光照下带有根的完整植株生长在 M S+ N AA 0. 5 mg / L+ 6-BA 2 mg / L的培养基上能
够诱导出大量的愈伤组织。比较了不同外植体在诱导愈伤组织出现的时间、形态、质地和颜色等方面的差别。
无菌苗的幼叶在培养基 MS+ NAA 0. 1 mg /L+ 6-BA 2 mg / L中不定芽诱导率最高 , 达到 81. 3% , 在 M S+
N AA 0. 1 mg /L+ 6-BA 0. 5 mg /L培养基上有效不定芽数最多 , 在 M S+ N AA 0. 1～ 0. 5 mg / L培养基中无
根的植株能够诱导出大量的不定根。
关键词: 蓝猪耳 ; 愈伤组织 ; 再生系统 ; 植物激素
中图分类号: Q945　　　文献标识码: A
Establishment of Torenia fournier i Lind. regeneration system
BIN Jin hua , YU Yan hong , X IAO Wen juan, XU Qu yi , WANG Xiao jing
( College o f Life Science, Southern China No rmal Univ ersity, Guangdong Key Lab o f
Bio technolog y fo r Plant Development , Guang zhou 510631, China)
Abstract: Ef fects of the kinds of explants、 NAA、 6-BA and light t reatment on calli induction of
Torenia fournieri Lind. w ere studied by L9 ( 3
4 ) o rtho gonal design. The best medium fo r calli induction
w as M S medium with 0. 5 mg /L N AA and 2 mg /L 6-BA when shoot wi th roo ts g rowing in ligh t. The
calli di fference in the period, shape, tex ture and co lor formed by di fferent explants had been compared.
When germ free leaves o f T . fournieri were inoculated in M S medium w ith 0. 1 mg / L N AA and
2 mg /L 6-BA, the percentag e of buds induction w as highest and a rriv ed 81. 3% . When 0. 1 mg /L
N A A and 0. 5 mg /L 6-BA were added into M S medium, avai lable buds could be most fo rmation. M any
roots could be induced when shoo ts wi thout roo ts were cul tiv ated in M S medium w ith 0. 1～ 0. 5 mg /L
N A A.
Key words: Torenia fournieri Lind. ; callus; regeneration system; phy toho rmone
蓝猪耳 ( Torenia fournieri Lind. ) , 玄参科羽萼属 , 多分布在亚洲和非洲的热带和亚热带地区 , 是
热带亚热带地区的一种观赏花卉植物。它具有特殊的裸露胚囊 , 在胚囊发育的四核期 , 胚囊即从珠孔
端伸出 , 在胚囊发育成熟时 , 助细胞、 卵细胞和大部分中央细胞均暴露在胚珠组织之外 , 是研究被子
植物胚囊发育和受精过程的极好模式植物。早期由于蓝猪耳的表皮层能诱导出各种器官而且生长发育
都很快 [1 ] ,因此 ,蓝猪耳一直是离体器官发育研究的很好材料 ,多用于研究花芽的形成、分化及衰老 [2, 3 ]。
蓝猪耳植株再生虽有报道 [4 ] , 但不是很多。
第 23卷　第 4期
V ol. 23, No. 4
广 西 农 业 生 物 科 学
Jou rnal of Guangxi Agric. and Biol. Science
2004年 12月　
Dec. , 2004　
⒇ 收稿日期: 2003 02 11
基金项目: 广东省自然科学基金团队项目 ( 003061)
作者简介: 宾金华 ( 1962 ) , 男 , 湖南衡山人 , 华南师范大学教授 , 博士 , 博士生导师。
1　材料与方法
1. 1　种子萌发及生长
将蓝猪耳的种子用 70%的乙醇灭菌 3 0 s ,迅速转入 0. 1% 的 HgCl2中灭菌 5 min ,无菌水冲洗
5～ 6次 , 置于含 0. 8%琼脂的 M S培养基上 , 在 28℃ , 光照 12 h /d, 光强 90～ 100μmo l· m- 2· s- 1下
培养。
1. 2　愈伤组织诱导及继代繁殖
采用 4因子 3水平的正交设计 (表 1) , 每处理接种 12瓶 , 每瓶接种 8个外植体 , 30 d后观察愈伤
组织的诱导率和生长状态。采用的基本培养基为 MS, pH5. 8～ 6. 0, 琼脂 0. 8% (以下采用的培养基与
此相同 )。
表 1　正交设计诱导愈伤组织 L9 ( 34 ) 因子水平表
Table 1　 Levers and factors of orthogonal design L9 ( 34 ) on calli induction
水平
Lever
外植体种类 ( A)
Kind of explant
N AA ( B)
/mg· L- 1
6-BA ( C)
/mg· L- 1
光照条件 ( D)
Tr ea tment of lig ht
1 叶盘 Leaf disc 0. 1 0. 5 光照 Light 90～ 100μmol· m- 2 s- 1
2 有根苗 Shoo t with r oo ts 0. 5 1. 0 漏光 Transmitted light 15～ 20μmo l· m- 2s- 1
3 无根苗 Shoo t without roo ts 1. 0 2. 0 黑暗 Dark
1. 3　不定芽诱导
将蓝猪耳无菌苗的幼叶接种含有 NAA 0, 0. 1, 0. 5, 1. 0 mg /L和 6-BA 0, 0. 5, 1. 0, 2. 0 mg /L
的不同组合的 MS培养基上 , 30 d后观察不定芽诱导率和每个叶盘上的不定芽数。
1. 4　不定根诱导
将诱导的植株在第 3～ 4叶节处切断 ,将植株上部转入含有 NAA 0, 0. 1, 0. 5mg /L和 6-BA 0, 0. 5,
1. 0 mg /L的不同组合的 M S培养基上 , 15 d后观察不定根诱导率及生长状态 ,统计每植株诱导出的根
数。
1. 5　植株移栽
挑取健壮的、 已经诱导出不定根的植株 , 轻轻洗去根部的琼脂 , 移栽到蛭石上 , 在 28℃、 12 h /d
光照下培养 2 d后 , 将植株移出室外栽培。
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织诱导
在不同 NAA、 6-BA浓度和光照处理下 ,外植体接种培养 1个月后 , 大部分都形成了愈伤组织。愈
伤组织呈淡白色或黄绿色。统计愈伤组织的诱导率 , 结果如表 2。从各因素水平看 , 诱导愈伤组织的最
优组合 A2 B2 C3D1 , 即光照下带有根的完整植株生长在含有 NAA 0. 5 mg /L和 6-BA 2. 0 mg /L的培养
基上能够诱导出的愈伤组织最多 , 且愈伤组织疏松 , 呈白色或淡绿色。 由极差分析可直观看出外植体
的种类对愈伤组织的诱导影响最大 , 6-BA次之 , N A A对愈伤组织的诱导影响最小。以有根苗作为外
植体诱导愈伤组织的效果最好 ,均差值为 91. 67% ,远远大于其他两种外植体的诱导率 ; 光照处理中以
漏光处理效果较好 ,经光照处理的外植体较黑暗处理的更易于诱导愈伤组织。在这些因素中 ,除了 NAA
外 , 其余的因素对愈伤组织的诱导都达到了极显著水平 , 其中以外植体种类的影响最大。
292 广 西 农 业 生 物 科 学 第 23卷　
表 2　蓝猪耳愈伤组织诱导的正交设计
Table 2　 Orthogonal design and object analysis of calli induction
处理序号
T rea tment
No .
因子 Facto r
外植体种类 ( A)
Kind o f explant
N AA ( B)
/mg· L- 1
6-BA ( C)
/mg· L- 1
光照条件 ( D)
T r ea tment of lig ht
愈伤组织诱导率 /%
Percentag e of
induced ca lli
1 叶盘 Lea f disc 0. 1 0. 5 光照 Light 10. 1 ef
2 叶盘 Lea f disc 0. 5 1. 0 漏光 Transmitted light 49. 2 c
3 叶盘 Lea f disc 1. 0 2. 0 黑暗 Dark 14. 1 e
4 有根苗 Shoo t with ro ots 0. 1 1. 0 黑暗 Dark 91. 6 ab
5 有根苗 Shoo t with ro ots 0. 5 2. 0 光照 Light 100 a
6 有根苗 Shoo t with ro ots 1. 0 0. 5 漏光 Transmitted light 83. 5 b
7 无根苗 Shoo t without r oo ts 0. 1 2. 0 漏光 Transmitted light 31. 6 d
8 无根苗 Shoo t without r oo ts 0. 5 0. 5 黑暗 Dark 0 f
9 无根苗 Shoo t without r oo ts 1. 0 1. 0 光照 Light 18. 6 e
　　注: 表中诱导率为 3次重复的平均值。
No te: Dates in the table ar e aver ages o f three r eplica tions.
在愈伤组织诱导时发现 ,在用 NAA和 6-BA作为激素处理时 ,选用合适的外植体会增加愈伤组织
的诱导率。比较不同的外植体诱导愈伤组织的结果发现 , 用叶片、 茎段、 无根苗、 有根苗和根部在 MS
+ NAA 0. 5 mg /L+ 6-BA 2. 0 mg /L中都能不同程度的诱导出愈伤组织 , 但愈伤组织的诱导量和生长
状态有很明显的差别 (表 3)。用叶片、 茎段和有根苗诱导的愈伤组织大都出现在伤口处或与培养基接
触的部位 , 且愈伤组织量较少 , 颜色以绿色为主 , 结构较为紧密 , 这些愈伤组织在生长 3周后就会褐
化 , 然后长出不定芽 ; 而从根部诱导的愈伤组织为淡黄色或白色 , 量多 , 出现早 , 且在原来的培养基
质中能不断的增殖。
表 3　外植体类型对愈伤组织诱导的影响
Table 3　 Ef fects of diff erent kinds of explants on calli induction
外植体
Explan t
叶盘
Leaf dis c
茎段
S tem segm en t
无根苗
Shoot w ithout roots
有根苗
Shoot w ith roots
根段
Root segment
出现时间 Generant tim e /d 　　 14 　　　 17 　　　 17 　　 10 　　　 12
出现部位 Generant posi tion 叶片切口处 与培养基接触的部位 与培养基接触的部位 根部愈伤组织化与培养基接触的部位
形态 Shape 球状突出小点 与培养基接触的部位
膨大愈伤组织化
与培养基接触的部位
膨大愈伤组织化
团块状 团块状或线状
质地 Tex ture 紧密 紧密 紧密 疏松 疏松
颜色 Colo r 深绿色 淡绿色 淡绿色 淡绿色或白色 淡黄绿色
2. 2　不同浓度的 NAA和 6-BA组合对不定芽诱导的影响
将蓝猪耳的幼嫩叶片切成小块 ,接种到不定芽诱导培养基中 , 5 d左右叶缘处膨大 ,叶片扩展 ,
7 d左右芽点开始萌动 , 20 d后调查不定芽诱导率和有效芽数。从表 4可见 , 除了未添加 6-BA的 4个
处理没有诱导出不定芽外 , 其它的不同浓度的 BA和 NAA组合 , 均对外植体有诱导效果。在 16种培
养基中 ,以 8号培养基的不定芽诱导率最高 ,达到 91. 7% , 6号培养基的每块叶片上诱导的有效不定芽
数最多 , 平均每叶盘可诱导 12. 3个有效芽。当 6-BA的浓度高于 NAA时 , 都能不同程度的诱导出不
定芽 , 当 6-BA的浓度偏高时 , 叶片上能萌生大量芽点 , 但能够从叶片上分离出的有效芽数目较少。当
NAA浓度一致时 , 低浓度的 6-BA诱导的不定芽叶片较大 , 株型正常 , 而高浓度的处理则会出现玻璃
化植株。
293第 4期 宾金华等: 蓝猪耳再生系统的建立
表 4　不同的 NAA和 6-BA组合对不定芽诱导的影响
Table 4　 Effect of NAA and 6-BA on the induct ion of buds
处理序号
T rea tment
No .
N AA
/mg· L- 1
6-BA
/mg· L- 1
接种叶盘数
No. of leaf
discs
生芽叶盘数
No. of leaf discs
induced buds
不定芽诱导率
Percentag e of buds
induc tion /%
平均有效芽数
Average No . o f
available buds
　 1 　 0 　 0 48 　　 0 　　 0 　　 0
2 0 0. 5 48 7 14. 6 3. 3
3 0 1. 0 48 13 27. 1 4. 2
4 0 2. 0 48 10 20. 8 1. 8
5 0. 1 0 48 0 0 0
6 0. 1 0. 5 48 32 66. 7 12. 3
7 0. 1 1. 0 48 35 72. 9 10. 3
8 0. 1 2. 0 48 44 91. 7 9. 7
9 0. 5 0 48 0 0 0
10 0. 5 0. 5 48 2 4. 2 1. 3
11 0. 5 1. 0 48 14 29. 2 8. 7
12 0. 5 2. 0 48 28 58. 3 6. 4
13 1. 0 0 48 0 0 0
14 1. 0 0. 5 48 4 8. 3 1. 9
15 1. 0 1. 0 48 6 12. 5 3. 0
16 1. 0 2. 0 48 16 33. 3 10. 6
表 5　不定芽形成的直观分析
Table 5　 Object analysis of the orthogonal design of buds formation
水平
Lever
不定芽诱导率 /%
Percentag e of buds induction
N AA 6-BA
平均有效芽数
Average No. o f available buds
NAA 6-BA
1 　 15. 62 　 0 　 2. 33 　 0
2 57. 82 23. 44 8. 06 4. 71
3 22. 92 35. 42 4. 09 6. 53
4 13. 54 51. 04 3. 87 7. 10
极差 Range 44. 28 51. 04 5. 74 7. 10
表 5的直观分析结果
表明 , N AA或 6-BA对不
定芽诱导率和有效不定芽
数的影响趋势是十分一致
的。 0. 1 mg /L N AA诱导
的不定芽分别为未添加
NAA, 0. 5 mg /L N AA,
1. 0 mg /L N AA的 3. 70
倍 , 2. 52倍 , 4. 12倍 , 表
明不定芽的诱导需要较低
的 NAA浓度 ,高浓度的 NAA会抑制不定芽的形成。NAA对有效不定芽的形成也有相类似的效应。不
定芽的诱导及有效芽的形成则需要较高的 6-BA浓度 , 在所试验的浓度范围内 , 6-BA的浓度越高 , 不
定芽的诱导率越高 ,形成的有效芽的数量越多。在对不定芽的诱导过程中 , 6-BA的效应高于 NAA,特
别是在有效不定芽的形成过程中 , 6-BA的处理效应达到了显著水平。在对不定芽诱导率的影响是 , 二
者的差异不明显 , 都能显著的影响不定芽的诱导率。
2. 3　不同浓度的 NAA和 6-BA组合对不定根诱导的效果
取 2～ 3 cm长的幼苗 , 剪断根部 , 将上部植株接种在各种培养基上 , 在光下培养 20 d后 , 各处理
在幼苗基部都可以形成一定数量的不定根 ,结果如表 6。不用激素处理的蓝猪耳都有较高的不定根诱导
率 ,但不添加激素的培养基诱导不定根形成所需的时间长 ,而且不定根的生长缓慢。当 NAA浓度高于
6-BA时都有不定根诱导出来 ,特别是仅用 0. 1 mg /L或 0. 5 mg /L N AA的 4号处理和 7号处理 ,所有
的植株都能形成不定根 , 虽然 NAA浓度偏高 (处理 7和 8) 可以形成大量的不定根 , 但生长出的不定
根的侧根多为毛状根。
294 广 西 农 业 生 物 科 学 第 23卷　
表 6　不同浓度的 NAA和 6-BA组合对不定根形成的效果
Table 6　 Effect of NAA and 6-BA on the formation of roots
处理序号
T rea tment
No .
N AA
/mg· L- 1
6-BA
/mg· L- 1
接种幼苗数
No. o f
seedling s
生根幼苗数
No. of seedling
induced roo ts
不定根诱导率
Pe rcenta ge o f
induced roo ts /%
平均根数
Average No.
o f roo ts
　　 1 　　 0 　　 0 30 　 11 　　　 36. 7 　　　 6. 7
2 0 0. 1 30 9 30. 0 3. 0
3 0 0. 5 30 2 6. 7 1. 0
4 0. 1 0 30 30 100 13. 3
5 0. 1 0. 1 30 14 46. 7 2. 3
6 0. 1 0. 5 30 10 33. 3 1. 8
7 0. 5 0 30 30 100 16. 7
8 0. 5 0. 1 30 30 100 15. 3
9 0. 5 0. 5 30 8 26. 7 4. 2
2. 4　植株移栽
当小苗长至 6～ 8 cm时 , 将培养瓶塞旋松 , 置于 25～ 30℃温室中炼苗 2 d后 , 挑取健壮的长根植
株 , 轻轻洗掉根部的琼脂 , 移栽到蛭石或营养土上 , 在 28℃ , 12 h /d光照下培养 , 其成活率达 90% 。
3　结论
本研究发现 , 在愈伤组织的诱导中 , 外植体的取材部位和光照处理对愈伤组织的诱导和生长状态
影响较大 , 虽然没有达到显著水平 , 但可以通过取材和光照的调节 , 在合适的激素处理下增加愈伤组
织的诱导品质和产量。 最后得到了从蓝猪耳叶盘诱导出不定芽以及不定根的有效激素浓度 , 建立了一
套蓝猪耳再生系统 , 可为蓝猪耳的遗传转化研究以及利用分子生物学技术研究蓝猪耳受精过程提供基
础资料。
参考文献:
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[ 3 ]　 T ANIMOTO S, M IYAZAKI A, HARADA H. Regula tion by abacsis acid of in v itro flow er fo rma tion in Torenia
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(责任编辑　裴润梅 )
295第 4期 宾金华等: 蓝猪耳再生系统的建立