全 文 ：2003-04-29收到 , 2003-07-21 接受。
国家自然科学基金(39970368),国家杰出青年基金(30225006)和国
家重大基础研究前期研究专项项目计划(2002CCA00100)资助。
＊通讯作者(E-mai l:mxsun @w hu.edu.cn;Tel:027-87646170;
Fax:027-87640601)。
烟草与蓝猪耳胚胎发生中细胞表面三种凝集素受体的动态分布
房克凤　孙蒙祥＊　周　嫦
(武汉大学生命科学学院植物发育生物学教育部重点实验室 ,武汉 430072)
摘要:以异硫氰酸甲酯(F ITC)标记的三种凝集素(伴
刀豆凝集素 , 麦芽凝集素和大豆凝集素)为荧光探针 ,
对烟草及蓝猪耳各发育时期胚细胞表面的凝集素受体
进行了定位。结果显示胚柄基部荧光信号最强 , 沿胚
柄单列细胞向胚体方向渐次减弱。以后随着胚柄功能
的逐渐丧失而改变。同时 , 三种凝集素受体集中分布
于胚柄细胞间的分裂面;凝集素受体在原胚中分布的
另一个特点是聚集于新形成的细胞壁上。随着胚胎发
育至分化阶段 , 凝集素受体则主要分布在胚体细胞的
外切向壁上;三种凝集素受体的动态分布显示了凝集
素受体的分布与细胞分裂之间的密切关系及其调控胚
胎发育的作用。
关键词:凝集素受体;胚胎;烟草;蓝猪耳
中图分类号:Q944.46
　　在动物的胚胎发育中凝集素受体有着重要的
作用。在胚胎的不同发育时期凝集素受体分布呈
有规律的变化。有研究表明 ,在囊胚期胚胎的表面
分布有多种凝集素受体(Sato 和 Muramatsu 1985 ,
新井吉典等 1991)。而且 ,有些凝集素受体随囊胚
向着床方向发育而动态消涨。囊胚发育的后期与
早期相比 ,其表面的日本槐凝集素(Sophora japon-
ica agglut inin , SJA)和双花扁豆凝集素(Dolichos
bif lorus agglutinin , DBA)受体分布减少(Sato 和
Muramatsu 1985),而囊胚与子宫黏膜上皮接触后 ,
其表面的麦芽凝集素(Trit icum vulgaris agglu-
tinin , wheat germ agglutinin , WGA)受体消失(新
井吉典等 1991)。用实验方法延迟小鼠囊胚着床
时 ,伴刀豆凝集素(Canavalia ensi formis agglu-
tinin , concanavalin agg lutinin , Con A)和 DBA 受体
在囊胚表面有分布 ,着床开始后这两种凝集素受体
减少并消失(Carollo 和 Weitlauf 1981 , Chavez 和
Enders 1982)。据此认为囊胚表面的凝集素受体可
能参与了着床过程。
有关研究同时揭示了凝集素受体与胚胎细胞
分化的密切关系 。在外胚层向神经分化的过程中 ,
Con A受体有明显的作用。高桥礼子和高田健三
(1990)观察了凝集素对体外培养的蝾螈未分化外
胚层向神经分化的影响 ,发现 Con A 处理明显提高
了神经分化诱导率 。并证实外胚层的 Con A 受体
是决定外胚层分化方向的重要因素。
在高等植物中 ,大量研究表明凝集素存在于很
多豆类或其它种类植物的果实中 ,主要分布在胚的
组成细胞的胞质中 ,起储存蛋白的作用。但在不同
发育时期的胚胎细胞表面是否有凝集素受体的分
布 ,凝集素受体在被子植物胚胎中是否也有调控细
胞分化的类似的作用 ,迄今未见报道。本文选择在
动物胚胎发育中起重要作用的 Con A 、大豆凝集素
(Glycline max agglutinin , soybean agglutinin ,
SBA)和WGA为探针对烟草和蓝猪耳两种双子叶
植物不同发育时期的胚胎细胞表面凝集素受体进
行定位 ,观察其在胚胎发生过程中各个时期的分
布。以了解三种重要凝集素受体在植物胚胎发生
过程中分布的基本模式以及动态规律 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料为烟草(Nicot iana tabacum i L.)品种
W38和蓝猪耳 (Torenia fournieri L.)。3月份播
种于自然条件下。9月份栽种于温室内 ,25℃, 16 h
光照 。
1.2　胚的分离及标记
烟草胚的分离方法按照傅春梅等(1996)方法
或直接解剖法 。
蓝猪耳的分离参照 Mól(1986)的方法 。将胚
珠从子房内解剖出来 ,放入含 2%纤维素酶 、0.5%
离析酶 、1%半纤维素酶和 0.05%果胶溶酶的 13%
甘露醇溶液中酶解约 1 h ,得到胚囊以后 ,用解剖法
获得胚。较大的球形胚和球形胚以后各时期的胚
不经酶解而直接解剖得到。由于蓝猪耳胚囊结构
的特殊性 ,很难得到带完整胚柄的胚。
463植物生理与分子生物学学报 , Journal of Plant Physiology and Molecular Biology　2003 , 29(5):463-468
凝集素受体的标记参照 Sun 等人(2002a)的方
法。FITC-Con A 、FITC-SBA 和 FITC-WGA 购自
Sigma公司。溶于 13%甘露醇 ,pH 为 5.8 ,配制成
浓度为 1 mg/mL 的母液 。将已分离得到的或经其
它处理的胚 ,置于培养皿底部 ,做成大约 200 nL 的
微滴。其上覆盖一层矿物油以防蒸发 ,然后加入等
体积的荧光标记的凝集素溶液 ,使其最终浓度为
500μg/mL。在室温下保温 1 h并用13%甘露醇充
分清洗后观察。
一组对照为没有用 FITC 标记的凝集素处理的
各发育时期的胚。另一组对照为各发育时期的胚先
用0.1 mol/ L的各凝集素特异的竞争性抑制剂处理
30 min ,然后再用凝集素标记 。Con A 、WGA和 SBA
的特异竞争性抑制剂分别为α-甲基-D-甘露糖 、N-乙
酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖。
1.3　观察与图像分析
胚的分离及荧光标记操作在倒置荧光显微镜
(Olympus IM T-2)下进行 ,在 Leica DM IRB倒置荧
光显微镜下观察 ,冷 CCD(MicroMAX Princeton In-
st ruments , Inc.)和动态录像 CCD(Photometrics ,
USA)采集图像 ,用 MetaMo rph(Universal Imaging
Co rpo ration Inc , USA)和 Pro-Plus(Media Cyber-
netics , L.P.)软件对图像进行分析处理 。
2　结果
2.1　Con A受体在两种植物不同发育时期的胚胎
细胞表面分布的变化
Con A 对烟草胚的标记主要出现在两个部位 ,
胚柄和胚体。在整个原胚发育时期 ,胚柄各组成细
胞的细胞壁上一直有较亮的荧光。在 2胞原胚中
(图 1),两个细胞的细胞壁上都有很亮的荧光。而
且在顶细胞与基细胞间的细胞壁(新生壁)上荧光
比其它部位亮 。顶细胞与基细胞的细胞表面的荧
光强度没有很大的差别 。但基细胞与胚囊连接处
的细胞壁荧光特别明亮 。这使整个胚的荧光出现
明显极性分布 ,即基细胞基部荧光亮于顶部(图 1)。
其后 ,在 4胞 、8 胞 、16 胞的早期原胚中 ,除了仍旧
保持了这种明显的极性分布的特点外 ,Con A受体
主要分布在胚细胞分裂时新形成的细胞壁上。新
细胞壁形成处的荧光较之其它部位的明显较强 ,可
据此识别刚刚分裂的细胞(图 2 ～ 4)。而在发育
到大球形胚(图5)和早心型胚阶段(图6), ConA
图 1～ 16　伴刀豆凝集素 、麦芽凝集素和大豆凝集素受体在烟草 、蓝猪耳各发育时期胚的分布
Figs.1-16　Distribution o f lectin receptors on embryo s of tobacco and to renia
Con A:Concanavalin agglutinin;SBA:Soybean agglutinin;WGA:Wheat g erm agglutinin.
1-6.Distribution of Con A receptors on different developmental stages of embryos of tobacco.7-12.Distribution of Con A recep-
tors on embryos of torenia.13-14.The distribution of SBA receptor on proembryos o f tobacco.15.Distribution of WGA receptors
on heart embryo of to renia.16.Distribution of Con A receptor on non-enzymatically isolated spherical embryo of to renia.Fig.13 is
M icroMAX cooled CCD image , All o thers are CoolSNAP cooled CCD images.
1.Tw o-celled proembryo of tobacco labeled by FITC-Con A.Strong fluorescence w as present on the entire surface of basal and api-
cal cell especially the basal part of the basal cell.Bar = 8μm.2.P roembryo of tobacco labeled by FITC-Con A.F luorescence was
concentrated on transverse wall between cells.Bar = 6.7 μm.3.Proembryo of tobacco labeled by F ITC-Con A.Most Con A re-
ceptor was concentrated on the newly formed cell w all(arrow).Bar = 15.6 μm.4.Proembryo of tobacco labeled by F ITC-Con
A.Con A receptor distributed polarily on the embryo suspensor.Stronger fluo rescence was present on the place connecting the em-
bryo and embryo sac(arrow).Bar= 15 μm.5.Spherical embryo of tobacco labeled by F ITC-Con A.Fluo rescence w as present on
the out-tangent w all of epidermis cell of the embryo proper.F luorescence embodied the embryo outline.Bar=29μm.6.Heart em-
bryo of tobacco labeled by F ITC-Con A.Fluorescence w as w eak on the embryo proper and stronger on embryo suspenso r cell w all.
But the fluorescence on the basal part of the basal cell became w eaker(arrow).Bar = 33 μm.7.Two-celled proembryo of torenia
labeled by F ITC-Con A.New ly fo rmed w all g ave off slightly stronger fluorescence.Bar = 4 μm.8.Eight-celled proembryo of
to renia labeled by F ITC-Con A.Fluorescence was preferentially distributed on transverse cell w all.Bar = 10 μm.9.Small spheri-
cal embryo of torenia labeled by F ITC-Con A.The arrow indicated bright fluorescence on the embryo suspensor.Bar= 16 μm.10 ,
11.Spherical embryo s of to renia labeled by F ITC-Con A.Fluorescence w as present on the cell surface of every component cell of
embryo at different developmental stages.Bar = 20 and 22 μm in pla tes 10 and 11 respectively.12.Heart embryo of torenia la-
beled by F ITC-Con A.Fluorescence on inner cell surface weakened remarkably than before.Bar =25μm.13.Four-celled proem-
bryo of tobacco labeled by F ITC-SBA.Fluorescence w as present on cell wall and division plane.The basal par t of the embryo sus-
pensor gave off stronger fluorescence.Bar = 12μm.14.Proembryo of tobacco labeled by FITC-SBA.The distributive pa ttern of
the SBA receptor was like that of Con A receptor.Arrow indica ted bright fluorescence on embryo suspensor.Bar = 12 μm.15.
Heart embryo of torenia labeled by F ITC-WGA.Fluorescence only existed on the outer tangential wall of epidermis cell of the em-
bryo.Bar = 30 μm.16.Non-enzymatically iso lated spherical embryo of torenia labeled by FITC-Con A.Con A receptor distribu-
tiv e pattern and fluorescence intensity was similar to the enzymatically isolated embryo.Bar = 20μm.
464 植物生理与分子生物学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷
受体的分布模式有显著改变。仅胚柄各细胞间的
荧光仍然比较明亮 ,而在胚体内部细胞的细胞壁上
未观察到荧光。只在表皮细胞的外切向壁上分布
有Con A受体 ,其荧光勾画出胚的轮廓 。另外一个
变化是早期原胚的胚柄基部细胞壁的荧光特别强 ,
而到大球形胚阶段后 ,这种极性现象已经消失 ,荧
光呈均匀分布(图 5 、6)。
　　与烟草相似 ,在蓝猪耳 2胞 、4胞 、8胞等早期
原胚阶段(图 7 、8),Con A可以标记各个细胞的细
胞表面 ,胚柄基部及细胞分裂面的荧光强于其它部
位。但到球形胚及以后逐渐表现出与烟草不同的
特点 。除胚的表皮细胞外切向壁上有荧光外 ,Con
A受体荧光同时也出现在胚的内部细胞壁上(图 9
～ 12),到大球形胚阶段后则多数细胞荧光减弱或
消失 。胚柄的各细胞壁仍显示明亮的荧光 。
2.2　SBA受体在各发育时期胚的分布及变化
在烟草 2胞 、4胞 、8胞等原胚阶段 ,SBA 的荧
光主要分布于细胞壁上及分裂面上 ,而且观察到的
4655 期　　　　　　　　房克凤等:烟草与蓝猪耳胚胎发生中细胞表面三种凝集素受体的动态分布
荧光集中分布在新生壁上(图 13 )。同 Con A受体
分布类似 ,胚柄基部荧光特别明亮(图14)。靠近胚
柄处的胚体内部分裂面的荧光要强于其他部分 。
发育较大的球形胚至心形胚 ,与Con A受体分布类
似 ,仅在胚的表皮细胞的外切向壁上有荧光。
与在烟草胚中不同 , SBA 未能标记蓝猪耳胚 ,
胚柄与胚的表面均未观察到 SBA受体的分布。
2.3　WGA受体在各发育时期胚的分布
烟草 2胞 、4胞 、8胞等早期原胚的细胞壁均可
被WGA 标记 ,但是荧光较弱 。胚柄部分荧光信号
的分布规律与 Con A 相似 , 但其极性分布远不如
Con A标记明显 。球形胚及以后发育时期的胚被
WGA标记后 ,荧光主要分布在胚的表皮细胞的外
切向壁上 ,尤其是心形胚表皮细胞的外切向壁的荧
光比较明亮。
蓝猪耳原胚的胚柄与胚表面的 WGA 标记与
烟草胚中WGA 标记的情形相似 。但与 Con A 标
记情况不同 ,WGA 不能标记蓝猪耳胚胎内部细胞
的细胞壁 ,只标记胚体表皮细胞外切向壁(图 15)。
幼胚在两组对照实验中都没有出现荧光信号 。
较大的胚在蓝光激发下会出现很弱的红色自发荧
光 ,但对凝集素荧光的观察无很大影响 。
2.4　酶解对凝集素受体分布的影响
Con A受体在这两种植物中胚的分布形式不
同 ,是否由于酶处理的不同造成的 ,我们设计了另
外的实验。将用解剖法得到的烟草胚用不同的酶
组合处理后再用凝集素标记。蓝猪耳胚用解剖法
分离后直接进行标记 ,结果发现无论是烟草还是蓝
猪耳 ,用两种方法得到的胚经 Con A标记后的荧光
分布形式没有很明显的差异(图 11 , 16),表明纤维
素和离析酶组合 , 纤维素酶 、半纤维素酶 、离析酶
及果胶溶酶的组合处理对凝集素受体的分布形式
没有明显影响。烟草和蓝猪耳胚中 Con A 受体分
布形式的不同是种间差异 。
3　讨论
烟草早期原胚凝集素受体分布的一个特点是
在胚柄细胞外表面的分布呈现明显的极性 ,即胚柄
基部 Con A荧光信号最强 ,沿胚柄单列细胞向胚体
方向渐次减弱(图 1 ～ 4)。且在整个原胚发育时期
一直保持着这种极性分布的特点。以后 ,随着胚柄
功能的逐渐丧失而呈均匀分布。此外 ,在两种植物
中Con A 和WGA 受体集中分布于胚柄细胞间的
壁上(图 3 、4)。此处荧光信号强度明显高于其它部
位。胚柄在胚胎发生早期对胚的发育起着重要作
用。一般认为至少有固着 、支持和输导的功能(胡
适宜 1982)。当胚柄的功能逐渐丧失 ,这种极性分
布的特点也逐渐消失 ,表明两者间有密切关系。凝
集素受体在原胚中分布的另一个特点是聚集于新
形成的细胞壁上。特别是在早期原胚中 ,可用于识
别刚刚分裂的细胞 。在动物中凝集素受体分布模
式与细胞分裂有一定的相关性。如海胆受精卵的
第一次分裂过程中 ,凝集素受体的不对称分布有一
个变化过程(McCaig 和 Robinson 1982)。Con A受
体在合子表面是均匀分布的 ,但是当合子变成椭圆
形准备分裂至分裂将近完成期间 , Con A 受体集中
分布在分裂沟即将形成或已经形成的地方。分裂
完毕 ,Con A受体从分裂沟处渐渐转移至两个子细
胞的相对端 。用活体及固定材料得到了相同的结
果 ,即海胆合子分裂过程中 , Con A 受体分布的不
对称性是其本身固有的 ,并不是由于膜的流动造成
的。我们在玉米人工合子的离体分裂中也曾观察
到 Con A受体集中分布在细胞板处并保持至细胞
壁形成(Sun等 2002b)。在烟草和蓝猪耳的早期胚
胎中我们也观察到 Con A 及 WGA 的这种分布规
律。而在原胚细胞分裂高峰期过后 ,胚胎逐渐转向
分化期时凝集素受体随之变化 ,主要分布于胚胎细
胞的外切向壁 。这种变化特点揭示了凝集素受体
的分布与细胞分裂之间的密切关系。此外 ,细胞壁
在植物的胚胎发生 、个体发育中起着重要的作用
(Kropf等 1988)。在细胞壁尤其是新生的壁上大
量的凝集素受体的存在提示了在植物的胚胎发生
中凝集素受体可能起着与动物胚胎发育中类似的
调控胚胎发育的作用。
我们的结果表明在同一种植物的胚中 ,不同的
凝集素受体的分布模式不尽相同 。蓝猪耳中 , Con
A受体在整个发育时期都分布于胚中 ,而 SBA 在
整个发育时期的胚细胞表面都没有分布。不同凝
集素在同一时期 、同一材料上的标记模式也不一
样。Con A 可以标记蓝猪耳各发育时期胚胎内部
组成细胞的细胞壁 ,而另两种凝集素则不能 。在动
物胚胎发生过程中 ,凝集素受体在种类和数量上都
发生很大的变化(Sato 和 Muramatsu 1985 ,Kimber
1986 , 新井吉典等 1991 , 1992),并且这种变化与
胚胎发育进程密切相关 。在植物的胚胎发育过程
中 ,凝集素受体的作用是否如此还需要进一步的研
466 植物生理与分子生物学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷
究。但在不同植物中凝集素受体分布模式的差异
表明在胚胎发育的不同时期 ,同一种凝集素受体所
起的作用会有不同。同一发育时期的胚胎中 ,不同
的凝集素受体所起的作用可能也不一样。总之 ,本
文揭示了在植物胚胎发生过程中与动物一样有多
种凝集素的参与 ,并初步查明了三种凝集素在两种
植物胚胎发生中的分布动态 ,但其作用机制有待进
一步深入研究。
参 考 文 献
胡适宜主编(1982).被子植物胚胎学.北京:人民教育出
版社 , 185-192
高桥礼子 ,高田健三(1990).胚たおけゐ神经诱导のメカニ
スム.细胞工学 , 19:224-228
新井吉典 , 四谷伊公子 , 新村末雄 , 石田一夫(1991).发生
初期たおけゐマオス胚表面のレクチン结合の组织化
学的观察.日不妊志 , 36:469-474
新井吉典 , 四谷伊公子 , 新村末雄 , 石田一夫(1992).着床
前マオス胚盘胞表面たおけゐレクチン结合の组织化
学的观察.日畜会报 , 63:318-324
Carollo JR , Weitlauf HM (1981).Regional changes in the
binding of 3H-concanavalin A to mouse blastocy sts at im-
plantation:an autoradiog raphic study.J Exp Zool , 218:
247-251
Chavez DJ , Enders AC(1982).Lectin binding of mouse blas-
tocysts:appearance of Dolichos biforus binding sites on
the trophoblast during delayed implantation and their sub-
sequent disappearance during implantation.Biol Reprod ,
26:545-552
Fu CM (傅春梅), Sun MX(孙蒙祥), Zhou C (周　嫦),
Yang HY (杨弘远)(1996).Isolation of fer tilized em-
bryo sac and zygotes and triggering of zygo te division in
v itro in Nicotiana tabacum.Acta Bot Sin (植物学报),
38:262-267(in Chinese)
Kimber SJ (1986).Distribution of lectin receptors in postim-
plantation mouse embryos at 6-8 days gestation.Amer J
Anat , 177:203-219
Kropf DL , Kloareg B , Quatrano RS (1988).Cell wall is re-
quired fo r fix ation of the embryonic ax is in Fucus zygotes.
Science , 239:187-189
McCaig CD , Robinson KR(1982).The distribution of lectin
recepto rs on the plasma membrane of the fertilized sea
urchin egg during first and second cleavage.Devel Biol ,
92:197-202
Mó l R (1986).Isolation of pro toplasts from female gameto-
phytes of Torenia fournieri.Plant Cell Rep , 3:202-
206
Sato M , Muramatsu T (1985).Reactivity of five N-ace ty l-
galactosamine-recognizing lectins w ith preimplantation
embryos , early postimplantation embryos , and teratocar-
cinoma cells of the mouse.Di f ferentiation , 29:29-38
Sun MX , Kranz E , Moscatelli A , Yang HY , L9rz H , Cresti
M (2002a).A reliable pro tocol fo r direct detection of
lectin receptors on the plasma membrane of a single living
sperm cell in maize.Sex Plant Reprod , 15:53-55
Sun MX , Kranz E , Yang HY , L9rz H , Moscatelli A , Cresti
M (2002b).Fluo rophore-conjugated lectin labeling of the
cell surface of isolated male and female gametes , central
cells and synerg ids before and after fertilization in maize.
Sex Plant Reprod , 15:159-166
4675 期　　　　　　　　房克凤等:烟草与蓝猪耳胚胎发生中细胞表面三种凝集素受体的动态分布
Dynamic Distribution of Three Lectin Receptors on Cell Surface During
Embryogenesis in Nicotiana tabacum and Torenia fournieri
FANG Ke-Feng , SUN Meng-Xiang ＊ , ZHOU Chang
(The Key Laboratory of MOE for Plant Developmental Biology , College of Li fe Sciences , Wuhan U niversity , Wuhan 430072 , China)
Abstract:The dynamic distribution of lectin
receptors during development of embryos in
animal has been well studied and it is known
that these dynamic changes are functionally in-
volved in cell differentiation.However , no re-
port is known so far about lectin receptor dis-
tribution on cell surface during embryogenesis
in higher plants.In present work , fluorescein
isothiocyanate(FITC)conjugated lectins , con-
canavalin agglutinin (Con A), soybean agglu-
tinin (SBA) and wheat germ agglutinin
(WGA), were used as probes to localize the
lectin receptors on the cell surface of embryos
of Nicotiana tabacum and Torenia fournieri .
The results revealed several interesting charac-
teristics of lectin receptor distribution.At the
early proembryo stage , polar distribution of
lectin receptors w as observed on suspensor in
tobacco , w ith stronger fluorescence of FITC-
Con A and FITC-SBA on the basal end and
weaker fluorescence on the apical end(Figs.1 ,
3 , 4 , 14).The walls betw een suspensor cells
w ere strongly labeled by all three lectins(Figs.
3 , 7 , 14).Such feature was kept as long as the
suspensor functioned during embryogenesis.It
w as also found that lectin receptors were pref-
erentially located on the new ly formed cell w all
in early proembryos(Figs.3 , 4), but once the
embryos began to differentiate the lectin recep-
tors w ere mainly located on outer tangential
w all of epidermis cell(Figs.5 , 6);The results
also revealed that the same lectin receptors in
different species showed different distribution
pattern , whereas on the same embryo different
lectin receptors showed different distribution
characteristics.
Key words: lectin recepto r;embryo;Nicotiana tabacum ;
Torenia fournieri
＊Corresponding author(E-mail:m xsun@w hu.edu.cn).
468 Journal of Plant Physiology and Molecular Biology　2003 , 29(5):463-468