全 文 :·中草药· 北方园艺2014(24):144~146
第一作者简介:邓佳(1983-),女,云南昆明人,博士,讲师,现主要
从事经济林栽培与开发利用等研究工作。E-mail:dengjia1983@
163.com.
责任作者:刘惠民(1957-),男,湖南武冈人,博士,教授,博士生导
师,现主要从事经济林栽培与开发利用等研究工作。
基金项目:国家林业局林业公益行业资助项目(201304810);教育
部重点实验室科研基金资助项目(KLESWFU-1405);西南林业大
学科研启动资助项目(111406)。
收稿日期:2014-09-09
野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物抑菌活性的研究
邓 佳1,王 芳2,史 正 军1,刘 惠 民1
(1.西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南 昆明650224;
2.西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室,云南 昆明650224)
摘 要:以野生牛角瓜为试材,采用索氏提取法提取野生牛角瓜花、果、叶中脂溶性物质,选
择大肠杆菌、普通变形杆菌和枯草芽孢杆菌为供试菌,采用抑菌圈法和最低抑菌浓度法测定其抑
菌活性,研究野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物的抑菌活性。结果表明:野生牛角瓜不同部位脂
溶性提取物对大肠杆菌抑菌效果最明显,其中叶脂溶性提取物的抑菌活性最强。叶脂溶性提取
物对大肠杆菌和普通变形杆菌的最小抑菌浓度分别为30、60mg/mL。野生牛角瓜脂溶性提取物
具有抗菌能力,可为牛角瓜资源的进一步开发利用提供一定的参考依据。
关键词:牛角瓜;脂溶性提取物;抑菌活性
中图分类号:S 567.23+9 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2014)24-0144-03
牛角瓜(Calotropis gigantean L.)属萝藦科牛角瓜
属植物,又称羊浸树、断肠草,广泛分布于亚洲和非洲的
热带亚热带地区,在我国主要分布于海南、广东、四川和
云南[1-2]。牛角瓜属植物在民间具有广泛的药用价值,
其根、茎、叶、果及各部位的白色汁液均可药用,具有抗
菌、消炎、驱虫、解毒等作用,可用于哮喘、咳嗽、麻疯病、
溃疡、肿瘤等疾病的治疗[3-4]。目前,国内外对牛角瓜的
化学成分和药理作用做了多方面的研究,结果表明,牛
角瓜含有生物碱、黄酮、酚类、强心苷类、三萜类和甾体
类等多种类型的化合物[3],具有抗菌、抗肿瘤等活性。
有研究报道了牛角瓜属植物脂溶性成分的抑菌性,
并从中发现和提取低毒广谱抗菌物质[5]。王茂媛等[6]
研究证明,牛角瓜花脂溶性成分对金色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)和白色念球菌(Canidia albicans)
均表现出一定的抑制作用。Alam等[7]报道了牛角瓜根
脂溶性成分对藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)、巨大芽孢
杆菌(Bacilus megaterium)、绿脓杆菌(Pseudomonas
aeruginosa)具有明显的抑菌效果,但关于牛角瓜不同部
位脂溶性提取物抑菌效果的比较研究尚鲜见详细报道。
该试验采用氯仿萃取野生牛角瓜乙醇提取物,研究牛角
瓜不同部位(花、果、叶)脂溶性提取物对3种常见细菌的
抑菌效果,以期为牛角瓜的研究与开发提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料野生牛角瓜(Calotropis gigantea)花、果、
叶于2013年11月采自云南省玉溪市元江县,分别干燥
粉碎后备用。供试菌种为大肠杆菌(Escherichia coli)、普
通变形杆菌(Proteus vulgaris)和枯草芽孢杆菌(Bacilus
subtilis),由西南林业大学植物病理实验室提供。试剂为
无水乙醇、氯仿、正己烷、氢氧化钠、牛肉膏、蛋白胨、琼脂
等试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 提取液的制备 将野外采集的野生牛角瓜花、
果、叶带回实验室,在烘箱中60℃烘干粉碎,过40目筛,
称取牛角瓜花、果、叶样品各30g,置于索氏提取器中,加
入300mL 75%乙醇溶液(物料比1∶10),85℃回流提取
4h,减压回收乙醇至无醇味,粗提物分散于水中形成悬
浊液,经氯仿萃取3次,合并减压浓缩得黄色油状提取
物备用。
1.2.2 抑菌活性试验 该试验所用培养基为牛肉膏蛋
白胨固体培养基:蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g和
琼脂18~20g,去离子水定容至1 000mL,pH 值调至
7.0~7.2,121℃,0.15MPa下温热灭菌30min。牛肉膏
蛋白胨液体培养基:除不加琼脂外,与牛肉膏蛋白胨固
体培养基配制方法相同。菌种活化:将供试的菌株接种
于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面,37℃培养24h。菌悬
液制备:在3个装有100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的
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北方园艺2014(24):144~146 ·中草药·
三角瓶中各接种一环活化供试菌株,于37℃培养18h,制
得初始菌悬液。用无菌生理盐水采用梯度稀释法制成
10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等6个浓度梯度的菌悬
液;选取10-5、10-62个梯度各取200μL分别涂布平板,
于37℃倒置培养18h后计数。根据培养结果,挑选合
适浓度的菌悬液作为供试菌悬液。抑菌圈法:用打孔器
将滤纸打成孔径为6mm的圆纸片,高压蒸汽灭菌。将
灭菌后的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿制
成平板,每皿约20mL,待培养基凝固以后,分别加入3
种菌悬液(大肠杆菌:5.0×107 CFU/mL,枯草芽孢杆菌:
3.8×107 CFU/mL,普通变形杆菌:6.6×107 CFU/mL)
各200μL,用无菌玻璃刮涂布均匀。将野生牛角瓜花、
果、叶氯仿萃取物配成质量浓度分别为60mg/mL的正
己烷溶液,取直径6mm的无菌滤纸片,分别放入牛角瓜
花、果、叶的正己烷溶液中充分浸泡,并以正己烷作空白
对照,取出后放在含菌平板上,每皿1片对照,每个浓度
平行作2皿,37℃倒置培养18~24h后,分别测量各样
品的抑菌圈直径(mm),取平均值。最低抑菌浓度(MIC)
法:根据上述试验结果,对具有明显抑菌圈的样品进行
MIC值的测定。将具有最佳抑菌效果的提取原液进行连
续梯度稀释,配成含提取原液为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、
1∶32的5种浓度的液体,加之原液一共有6个浓度梯
度的提取液,加入1.0mL离心管并用去离子水补齐、摇
匀,再分别加入到灭菌的19mL培养基中,混匀,制成平
板。待培养基凝固以后,分别加入上述3种菌悬液各
200μL,菌悬液的浓度为10
6 CFU/mL,涂布于平板,于
37℃倒置培养24h,观察细菌生长情况。以完全无菌生
长的浓度作为供试样品溶液的 MIC值,同时以1.0mL
正己烷溶液代替牛角瓜提取物溶液与培养基混合作
对照。
2 结果与分析
2.1 野生牛角瓜脂溶性提取物样品得率
野生牛角瓜花、果、叶乙醇提取物,经氯仿萃取合并
浓缩,分别得花、果、叶脂溶性提取物1.60、1.35、2.10g,
得率分别为5.3%、4.5%、7.0%。
2.2 野生牛角瓜脂溶性提取物的抑菌效果比较
从表1可以看出,野生牛角瓜叶脂溶性提取物对大
肠杆菌的抑菌效果最佳,对普通变形杆菌的效果次之,
对枯草芽孢抑制作用不理想。野生牛角瓜花脂溶性提
取物对大肠杆菌和普通变形杆菌抑菌效果较好,对枯草
芽孢杆菌的抑菌作用最弱。野生牛角瓜果脂溶性提取
物除对普通变形杆菌外无明显抑菌效果。
上述结果表明,野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物
总体上对大肠杆菌和普通变形杆菌的抑菌效果比枯草
芽孢杆菌的效果好,特别是对大肠杆菌的抑菌效果较明
显。野生牛角瓜3个部位脂溶性提取物中,叶提取物抑
菌作用最强,其次是花提取物,果提取物的抑菌作用
最弱。
表1 野生牛角瓜不同部位脂溶性提取物对
3种菌的抑菌直径
Table 1 Diameter zone of inhibition for 3bacterial with
liposoluble extraction in diferent parts of wild Calotropis gigantean
菌株
Bacterial strain
抑菌圈大小Diameter zone of inhibition/mm
花Flower 果Fruit 叶Leave 对照Control
大肠杆菌Escherichia coli 7.21 6.46 15.00 6
普通变形杆菌Proteus vulgaris 7.08 6.73 8.13 6
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 6.21 6.15 6.32 6
2.3 野生牛角瓜叶脂溶性提取物的最低抑菌浓度
(MIC)值
由表2可知,野生牛角瓜叶脂溶性提取物对大肠杆
菌和普通变形杆菌的最低抑菌浓度分别为30、60mg/mL。
野生牛角瓜叶脂溶性提取物对枯草牙孢杆菌抑菌效果
不明显,在叶脂溶性提取物较高浓度下,细菌仍生长良好。
表2 野生牛角瓜叶脂溶性提取物对
试验菌的最低抑制浓度
Table 2 The minimal inhibitory concentration(MIC)of
leave liposoluble extraction against for test organisms
菌株
Bacterial strain
叶脂溶性提取物最低抑菌浓度 MIC
Minimal inhibitory concentration of
leave liposoluble extraction MIC/(mg·mL-1)
60 30 15 7.5 3.75
大肠杆菌Escherichia coli - - + ++ +++
普通变形杆菌Proteus vulgaris - + +++ +++ ++++
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis + ++ +++ ++++ ++++
注:“-”表示无菌生长;“+”表示有少量菌体生长;“++”表示有不超过1/3平
皿面积的菌体生长;“+++”表示有不超过1/2平皿面积的菌体生长;“++++”
表示有超过1/2平皿面积的菌体生长[8]。
Note:“-”shows no bacterial;“+”shows litle bacterial;“++”shows less than 1/3
plate area of bacteria;“+++”shows less than 1/2plate area of bacteria;“++++”
shows more than 1/2plate area of bacteria.
3 讨论与结论
该试验采用75%的乙醇85℃回流提取经氯仿萃取
得浸膏分别为:花1.60g、果1.35g、叶2.10g,得率分别
为5.3%、4.5%、7.0%。抑菌试验结果表明,野生牛角
瓜脂溶性提取物对大肠杆菌、普通变形杆菌和枯草芽孢
杆菌都有一定抑菌作用,抑菌效果大小依次为:大肠杆
菌>普通变形杆菌>枯草芽孢杆菌。野生牛角瓜不同
部位脂溶性提取物抑菌效果大小依次为:叶>花>果。
叶脂溶性提取物对大肠杆菌和普通变形杆菌的最小抑
菌浓度分别为30、60mg/mL。野生牛角瓜脂溶性提取
物对3种细菌的抑菌活性具有明显差异,这可能与革兰
氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞壁结构组分不同有关。
大肠杆菌和普通变形杆菌属革兰氏阴性菌,其细胞壁较
薄,物质的转运通道多,相对而言,野生牛角瓜抑菌物质
更容易穿过细胞壁,表现为较强的抑菌作用。枯草芽孢
杆菌属革兰氏阳性菌,其细胞壁较厚,肽聚糖含量丰富,
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形成坚固致密的三维立体网状结构,膜转运通道少,抑
菌化合物较难进入细胞质膜,抑菌效果相对较弱[9]。
该试验仅研究了体外抑菌效果,未进行有机体内抑
菌活性试验,且该试验所选提取溶剂、时间、温度较为单
一,对脂溶性成分种类、含量也不尽相同,从而对抑菌活
性有很大影响,需要进一步对不同提取溶剂、提取条件
进行系统研究。结果表明,野生牛角瓜脂溶性提取物对
供试菌有良好的抑菌作用,与王茂媛等[6]的研究结果相
似。野生牛角瓜脂溶性成分含有多种化合物,如脂肪酸
类、烷烃类、醇类等,已有试验表明牛角瓜脂溶性成分含
有羽扇豆醇、α?香树脂醇和β?香树脂醇等三萜类化合物,
其具有抗肿瘤、抗炎和镇痛的作用并对多种细菌也有广
泛的抗菌作用[6,10],但值得注意的是,该试验中野生牛角
瓜不同部位脂溶性成分的抑菌活性有所差异,推测与其
不同部位萜类成分含量不同有关。该研究只是对野生
牛角瓜脂溶性提取物进行了抑菌活性的初步研究,具体
哪一种或几种活性成分起主要抑菌作用,以及各活性成
分之间的相互作用目前尚不明确,因此对野生牛角瓜脂
溶性提取物中抑菌活性成分的进一步分离纯化及其抑
菌机理有待进一步深入研究和探讨。
牛角瓜提取液作为天然植物的抗菌物质,具有多种
药用价值,国内外学者对它的化学成分和药理活性进行
了广泛的研究[2,11-12]。近年来,各种抗菌素的大量广泛
应用,使细菌的抗药性问题变得越来越突出。采用牛角
瓜提取液配合一些抗生素来使用,可以减少抗生素的使
用量,降低抗药性。随着国内外学者对牛角瓜化学成
分、药理活性展开的深入研究,将有利于人们对牛角瓜
属植物的开发利用。
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32.
Study on Bacteriostatic Activity of Different Parts of Calotropis gigantean
Liposoluble Extraction
DENG Jia1,WANG Fang2,SHI Zheng-jun1,LIU Hui-min1
(1.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest
Forestry University,Kunming,Yunnan 650224;2.Key Laboratory of Diversity Conservation in the Southwest of China,State Forestry
Administration,Southwest Forestry University,Kunming,Yunnan 650224)
Abstract:Taking Calotropis gigantean as material,liposoluble constituents of Calotropis gigantean’s flower,fruit and
leave were extracted by soxhlet extraction.The antibacterial activities on Escherichia coli,Proteus vulgaris and Bacilus
subtilis of three fractions were studied by inhibition zone method and minimal inhibitory concentration(MIC)method to
study the bacteriostatic activity of diferent parts of Calotropis giganteanliposoluble extraction.The results showed that
the antibacterial activity of liposoluble extraction in diferent parts of Calotropis gigantean were the highest for
Escherichia coli,while leave extraction exhibited the strongest bacteriostatic activity.The minimal inhibitory concentration
(MIC)of leaves liposoluble extraction against for Escherichia coli and Proteus vulgaris were 30mg/mL,60mg/mL
respectively.The wild Calotropis gigantean liposoluble extractions had a good bacteriostatic activity.The study could
provide theoretical foundation for further studying and developing of the Calotropis gigantean.
Keywords:Calotropis gigantean L.;liposoluble extraction;antibacterial activities
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