全 文 ：北方园艺 2008(5):181 ～ 184 ·生物技术 ·
第一作者简介:龙海涛(1979-),男 ,湖南邵阳人 ,硕士, 助教,现从
事生化与分子生物学教学及科研工作。 E-mail:lo nght@scnu.
edu.cn。
通讯作者:李玲。E-mail:lilab@scnu.edu.cn。
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(003062)。
收稿日期:2008-01-30
蓝猪耳启动子捕获系统的建立
龙 海涛 , 李洪 清 , 李 　玲
(华南师范大学生命科学学院,广东 广州 510631)
　　摘　要:为了分离基因启动子 ,构建了陷阱植物表达载体pHAHCA ,用农杆菌介导的无启动
子GUS方法转化蓝猪耳 ,经抗性筛选和 PCR检测 ,获得82株转基因植株 ,转化率达 12.5%。12
株GUS染色呈阳性 ,其中 10株GUS在叶脉表达 ,2株在茎和叶脉表达。对转基因植株进行盐胁
迫处理 ,有1株根部出现GUS染色蓝色斑点。通过 TAIL-PCR扩增和测序 ,获得5个 T-DNA侧
翼序列。
关键词:启动子捕获;T-DNA侧翼;GUS报告基因;蓝猪耳
中图分类号:S 681.1　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2008)05-0181-04
　　蓝猪耳(Torenia fournieri Linden)属玄参科蓝猪耳
属 ,是热带亚热带地区 1 a生观赏花卉植物 ,其生长周期
短、容易再生且具备特殊的裸露胚囊[ 1] ,是植物细胞分
化、花器官发育和授粉受精研究的理想模式植物[ 2] 。近
年来通过传统育种和分子育种等方法已获得了蓝猪耳
的变种 ,其改变了花色 、花型 、花期以及提高其对环境的
适应性[ 3-5] 。研究室前期工作建立了蓝猪耳高频再生体
系[ 6] 和农杆菌介导的遗传转化体系[ 2 , 7] 。
基因启动子是指 RNA 聚合酶识别 、结合和开始转
录的一段 DNA序列 ,是基因表达调控重要的顺式作用
元件 ,在很大程度上决定着目的基因表达的时间 、空间
和强度。分离和鉴别启动子 ,研究启动子的结构和功
能 ,了解启动子时空专一性表达特征及其作用机制 ,不
仅具有基因表达调控的重要意义和潜在的巨大的实用
价值[ 8] 。目前分离捕获启动子主要利用陷阱技术 ,通过
建立高效稳定的启动子捕获系统 ,构建包含报告基因随
机插入整个基因组的个体突变体库[ 9-12] 。
研究将构建蓝猪耳启动子捕获系统 ,旨在分离启动
子 ,为研究其结构和功能以及为植物表达外源目的基因
提供新的启动子资源打下基础。
1　材料与方法
1.1　植物材料 、菌株 、载体 、工具酶
植物材料为蓝色花类型的蓝猪耳品种。大肠杆菌
E.coli DH5α、根癌农杆菌 EHA101 、克隆载体 pCAM-
BIA1200和质粒 pAHC27实验室自存。pMT18载体和
各种工具酶为TaKaRa 公司产品;质粒快速提取试剂盒、
DNA快速纯化和回收试剂盒购自上海博能申彩公司。
1.2　植物表达载体的构建和工程菌种的获得
pCAMBIA1200和 pAHC27(图 1)分别用 EcoRⅠ和
XbaⅠ双酶切 ,获得线性 pCAMBIA1200和 2.3kb无启动
子的GUS基因 ,纯化后连接转化 E.coli DH5α,经酶切
鉴定(图2)获得启动子陷阱植物表达载体 pAHCA ,质粒
冻融法转化根癌农杆菌 EHA101 ,根据GUS基因设计引
物(GUS1:5′ACGGATCCATATTACGTCCTGTAGA
AACC3′, GUS2:5′ACCTGCAGTCATTGTTTGCCTC-
CCTGCT3′),经 PCR鉴定(图 3)获得工程菌种 pAHCL。
图 1　表达载体 pAHCA的构建
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1.3　蓝猪耳转化和抗性筛选
将含有 pAHCL农杆菌接种于含 200 μmol·L-1乙
酰丁香酮(AS)的诱导培养基(1/2 MS),活化后稀释至
OD600为0.5。浸染嫩叶片5 ～ 10 min ,在含 200μmol·
L-1 AS的愈伤组织共培养基(MS+1.0 mg ·L-1 BA+
0.1 mg·L-1 2 ,4-D)、25℃暗培养 4 d ,转入含 500 mg ·
L-1头孢霉素(Cef)、12 mg ·L-1潮霉素(Hyg)愈伤组织
选择培养基(MS+1.0 mg ·L-1 BA +0.1 mg ·L-1
2 ,4-D)14 d。在含400 mg ·L-1 Cef芽选择培养基(1/2
MS+1.0 mg ·L-1 BA+0.1 mg ·L-1 NAA)培养 7 d ,
用400 mg ·L-1 Cef 、12 mg ·L-1 Hyg 的芽选择培养基
培养 28 d。在含 400 mg ·L-1 Cef 、15 mg ·L-1 Hyg的
生根培养基(1/2 MS)生根筛选 21 d ,获得抗性植株。
1.4　PCR检测和GUS活性分析
采用 CTAB 法[ 14] 提取植株基因组 DNA ,根据 T-
DNA区域潮霉素抗性基因设计引物 ,引物间序列长度
为375 bp。引物序列为 Hph1:5′GCTGGGGCGTCG-
GTTTCCACTATCGG 3′, Hph2:5′CGCATAACAGCG
CTCATTGACTGGAGC3′)。20 μL PCR 反应体系:
15 ng模板 DNA , 1 μmol · L-1 Hph1 , 1 μmol · L-1
Hph2 ,0.4 U Tag 酶 ,200μmol·L-1 dNTP ,10×buffer
2μL。反应程序:94℃变性 3 min后 ,依次在 94℃变性
30 s、55℃退火 30 s 、72℃延 1 min的条件下循环30次 ,
最后 72℃反应 10 min。PCR反应结束后 ,取 10μL 在
0.8%琼脂糖凝胶上电泳检测。
GUS活性分析参照 Jefferson[ 13] 的方法进行。
　　图 2　pAHCA的 EcoRI+　　　　　图3　pAHCA的
Xba I双酶切检测 PCR检测
　　　注:M:1 kb DNA ladder　　　　　　　注:M:DL2000DNA
Marker;1:pAH CA。 Marker;l:PAHCL。
图 4　农杆菌介导蓝猪耳的转化 图 5　转基因蓝猪耳抗性植株 PCR检测
注:a:抗性愈伤诱导;b:抗性芽体诱导; 注:M:DL 2000 DNA Marlcer;l:pAHCL;
c:抗性植株生根筛选;d:抗性植株。 2:非转基因植株;2～ 7:转基因抗性植株。
1.5　TAIL-PCR法逐步扩增 T-DNA侧翼序列 ,寻求分
离启动子
TAIL-PCR参照Liu等[ 15-16]的方法。特异引物按照
双元载体 pCAMBIA1200的 T-DNA 右边界进行设计 ,
由里往外依次为引物 1(5′CAACTTAATCGCCTTG-
CAGCACATC 3′)、引物 2 (5′GGCGTAATAGCGAAG
AGGCCCGCA3′)和引物 3(5′CAGATTGTCGTTTC-
CCGCCTTC AG3′)。随机引物采用 Liu等[ 15-16] 的随机
引物 AD(5′NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)
GTT 3′)。第一轮 PCR反应的退火温度分别为 61℃、
67℃和 44℃。取第一轮产物稀释 50倍作为第二轮
PCR扩增模板 ,退火温度分别为 60℃和 44℃。取第二
轮产物稀释 50倍作为第三轮 PCR扩增模板 ,退火温
度为 44℃。当 3 轮 PCR进行完毕 ,取 TAIL-PCR第
2 、3轮的产物电泳检测 、测序。通过 GeneBank对获得
的 T-DNA侧翼序列进行核苷酸和氨基酸序列同源性
比对和相关分析 。
2　结果与分析
2.1　蓝猪耳的遗传转化、抗性筛选及分子生物学检测
对 GUS基因设计引物 ,经 PCR检测 pAHCL ,获得
约 1.8 kb特异片段(图 3),与所设计引物间序列大小相
符 ,证实 pAHCA 成功转入农杆菌。GUS 基因连接
pCAMBIA1200 , T-DNA区域内的GUS基因上游仍然没
有启动子 ,T-DNA 随机插入到植物基因组 DNA后 ,若
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GUS基因能表达 ,则表明其上游存在着植物启动子。
将656块叶片外植体分别移入含 500 mg ·L-1 Cef
和12 mg·L-1 Hyg 的愈伤组织选择培养基培养 14 d ,
获得愈伤组织(图 4a),移入含 400 mg · L-1 Cef 和
12 mg ·L-1 Hyg的芽选择培养基上分化出芽(图 4b),
将0.5 cm的抗性芽转入生根培养基 ,能发生生根生长的
小苗(图 4c)推测为拟转基因的抗性植株 ,共获得 115株
抗性植株(图4d)。经 PCR检测(图 5),有 82株出现目
的片段 ,确认为转基因植株 ,转化率(转基因植株数/外
植体数)达12.5%。
2.2　GUS活性分析
对转基因植株的根 、茎 、叶器官进行 GUS组织化学
染色分析 ,发现有 12株植株 GUS染色呈阳性 ,其中 10
株蓝色斑点发生在叶脉部位(图6a),2株出现在茎和叶
脉(图 6b , c)。
为了获得盐胁迫特异型启动子 ,对转基因植株进行
高盐处理(根浸入 25℃的 200 mmol·L-1 NaCl溶液 ,
4 h后植株完全萎蔫)。检测器官GUS活性 ,结果表明:
有1株植株根部出现蓝色斑点(图6d)。
图 6　转基因植株 GUS 染色分析
注:a:1号株子叶片;b , c::11号株子叶片 ,茎;d:13号株子高盐胁迫根系。
2.3　TAIL-PCR法逐步扩增 T-DNA侧翼序列 ,寻求分
离启动子序列
　图 7　1 号转基因蓝猪耳 TAIL-PCR产物琼脂糖凝胶电脉分析
　　注:M:DL 2000 DNA Marker;l:Tail-PCR第二轮产物;2:Tail-PCR轮
3轮产物。
　　对GUS染色呈阳性的13株植株进行 Tail-PCR分
析 ,有5株获得特异扩增片段 ,扩增片段最短为300 bp ,
最长为 2 kb。以1号植株为例:PCR产物进行琼脂糖凝
胶电泳 ,第2轮无特异性电泳带出现 ,但第3轮产物特异
性较强 ,扩增片段约为 700 bp左右(图 7),经测序表明
394 bp为植物序列(图 8)。经GenBank分析 ,其与拟南
芥羧酸酯酶(β-酯酶)同源核苷酸序列为91%,同源氨基
酸序列为 57%,需以所获序列逐步进行 Tail-PCR ,最终
获得启动子序列。
3　讨论
启动子陷阱技术可以建立高效稳定的启动子捕获
系统 ,构建包含报告基因随机插入整个基因组的个体突
变体库 ,已成为当前未知序列基因启动子的克隆的主要
途径之一。目前认为 ,只有报告基因插入启动子附近 ,
即报告基因才表达 ,这些转基因植株才为启动子分离所
需材料 ,同时所创建的突变体库的饱和程度影响利用插
入突变研究基因功能的效率[ 17] 。
研究建立了启动子陷阱植物表达载体 pAHCA ,转
化农杆菌 EHA101获得工程菌种 pAHCL ,利用根癌农
杆菌介导的蓝猪耳遗传转化体系 ,转化率达 12.8%,通
过 GUS组织化学染色 ,有 12株植株呈现蓝色斑点 ,经
盐胁迫处理 ,有一株植株根部染色成阳性 ,此 13株植株
即为启动子分离材料。此结果证明所构建的启动子陷
阱植物表达载体可用于启动子捕获 ,达到了预期目的。
植物基因启动子按其功能和作用方式可分为 3类:
组成型启动子 、组织特异型启动子和诱导型启动子[ 18] 。
组织特异型启动子和诱导型启动子在植物基因理论研
究和生产应用中作用更大 ,因此寻找组织特异型启动子
和诱导型启动子意义更为重要。试验中 ,若GUS 基因
表达具有组织特异性 ,则GUS 基因插入在组织特异型
启动子下游;当在特定的物理或化学信号的刺激下 ,
GUS基因的表达才出现大幅度变化 ,则GUS基因上游
存在着诱导型启动子。为了获得盐胁迫特异启动子 ,研
究对转基因植株进行高盐处理 ,观察到 1株植株根部出
现蓝色斑点 ,推测 GUS基因上游可能存在盐胁迫启动
子 ,由于蓝色斑点仅出现在根部 ,该启动子可能具有根
部表达的组织特异性。采用更合适的盐胁迫处理方式 ,
或进行其它合适的处理如水分胁迫 、高温胁迫等 ,将会
获得更多相关特异型启动子。
对 13株GUS染色呈阳性的植株进行 TAIL-PCR ,
有 5株获得 T-DNA侧翼序列 ,经GenBank分析 ,其与拟
南芥羧酸酯酶(β-酯酶)的核苷酸序列和氨基酸序列的同
源性分别为91%和 57%,其功能将进一步分析。结果为
TAIL-PCR方法逐步扩增最终获得启动子提供借鉴。
同时需结合其它 PCR方法如连接介导的 PCR和反向
PCR进行分离[ 22-23] ,最终获得启动子序列 ,为花卉和其
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它植物表达外源目的基因提供了新的启动子资源 ,促进
花卉品种改良和新品种选育的应用。同时该启动子捕
获系统的建立 ,为其它转化效率较高的植物基因组学研
究提供借鉴和思路。
参考文献
[ 1] 　Tetsuya H , Kuroiw a H , Kawano S , et al.Guidance in Vit ro of the
Pollen Tube to the Naked Embryo Sac of Torenia fournieri[ J] .Plant Cell ,
1998(10):2019-2031.
[ 2] 　李梅兰 ,王小菁 ,李洪清.Establishment of Agrobacterium-mediated
Transformation System for Torenia[ J] .园艺学报 , 2006 ,33(1):105-110.
[ 3] 　Aida R , Kishimoto S , Tanaka Y , et al.Modification of f low er color in
torenia by genetic t ransformation[ J] .Plant Science ,2000 ,153:33-42.
[ 4] 　Aida R , Yoshida T , Knodo T , et al.Copigmentation gives bluer flow-
ers on t ransgenic torenia plants with the antisense dihydroflavonol-4-reductase
gene[ J] .Plant Science , 2000, 160:49-56.
[ 5] 　Fukusaki E , Kaw asaki K , Kajiyama S , et al.Flower color modulations
of Torenia hybrida by dow nregulation of chalcone synthase genes with RNA
interference[ J] .Journal of Biotechnology , 2004, 111(3):229-240.
[ 6] 　李玲 ,黄群声,张铭光, et al.Tissue culture and regeneration of Tore-
nia fournieri[ J] .亚热带植物科学 ,2001 ,30(4):27-31.
[ 7] 　Tao Jun , Li Ling.Genetic t ransformation of Torenia fournieri L.me-
diated by Agrobacterium rhizogenes[ J] .South African Journal of Botany ,
2006 ,72:211-216.
[ 8] 　朱英 ,蔡秀玲 ,王宗阳.Promoter Trapping by Using Promoterless
GUS Reporter Gene in Rice[ J] .植物生理与分子生物学学报 , 2003, 29(4):
289-294.
[ 9] 　Chin H G , Choe M S , Lee S H , et al.Molecular analysis of rice plants
harboring an Ac/ Ds transposable element-mediated gene trapping system
[ J] .Plant J , 1999, 19(5):615-623.
[ 10] 　Jeon J S , Lee S , Jung K H , et al.T-DNA insertional mutagenesis for
funct ional genomics in rice[ J] .Plant J ,2000 ,22(6):561-570.
[ 11] 　Greve H D, Nguyen K V , Deboeck F , et al.T-DNA tagging of the
translation factor eIF-4Al of Arabidopsis Thaliana[ J] .Plant science , 2001 ,
161:685-693.
[ 12] 　王爱民 ,陈石燕,沈革志.Establishment of Promoter Trapping Sys-
tem Mediated by Activator/Dissociat ion (β-glucuronidase)Const ruction in
Rice[ J] .植物生理与分子生物学学报 , 2005, 31(6):575-580.
[ 13] 　Jefferson R A.Assaying chimeric genes in plants:The GUS fusion
system[ J] .Plant Mol Biol Rep, 1987, 5:387-405.
[ 14] 　房迈莼 ,李美茹,李洪清.A Simple and Highly Efficient Method for
Cloning Telomere Associated Sequences f rom Oryza sativa[ J] .植物生理学通
讯 ,2004 ,40(6):729-730.
[ 15] 　Liu Y G , Whit tier R F.Thermal asymmet ric interlaced PCR:autom-
atable amplification and sequencing of insert end f ragments from P1 and YAC
clones for chromosome w alking[ J] .Genomics , 1995, 25:674-681.
[ 16] 　Liu Y G , Mitsukawa N , Oosumi T , et al.Efficient isolation and map-
ping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junction by thermal asymmet ric
interlaced PCR[ J] .Plant Journal , 1995, 8(3):457-463.
[ 17] 　江树业, 陈启锋, 葛学军.Gene Traps and Their Applications on
Plant Gene Isolation and Functional Genomics[ J] .热带亚热带植物学报,
2003 ,11(2):181-189.
[ 18] 　王颖,麦维军 ,梁承邺, 等.Advances on studies of plan t promoters
[ J] .西北植物学报, 2003, 23(11):2040-2048.
[ 19] 　刘博 ,苏乔,汤敏谦, 等.Progress of the PCR Amplification Tech-
niques f or Chromosome Walking[ J] .遗传 , 2006 ,28(5):587-595.
[ 20] 　Michiels A , Tucker M , Ende W V D , et al.Chromosomal walking of
f lanking regions f rom short known sequences inGC-Rich plant genomic DNA
[ J] .Plant Mol Biol Rep ,2003 ,21:295-302.
[ 21] 　Terauchi R, Kahl G.Rapid isolation of promoter sequences by
TAIL-PCR:the 5-flanking regions of Pal and Pgi genes f rom yams (Di-
oscorea)[ J] .Mol Gen Genet , 2000, 263(3):554-560.
[ 22] 　Casson S A , Chilley P M , Topping J F et al.The POLARIS gene of
Arabidopsis encodes a predicted peptide requi red for correct root growth and
leaf vascular pat terning[ J] .Plant Cell, 2002 , 14(8):1705-1721.
[ 23] 　Lee S , Jung K H , An G , et al.Isolation andcharacterization of a rice
cysteine protease gene , OsCPI , Using T-DNA gene trap-system[ J] .Plant Mol
Biol ,2004 ,54(5):755-765.
Establishment of Promoter Trapping System in Torenia fournieri Linden
LONG Hai- tao , LI Hong-qing , LI Ling
(College of Life Science , South China No rmal University , Guangzhou , Guangdong 510631 , China)
Abstract:Based on the optimization of genetic transformation of Torenia fournieri Linden mediated by Agrobacterium tu-
mefaciens , a binary vector , designated as pHAHCA , was const ructed for promoter trapping , and was int roduced into
Torenia to establish an efficient promoter t rapping system.82 hygromycin-resistant plants w ere confirmed to be positive
transformants by PCR.The transformation frequency was up to 12.5% overall.GUS histochemical staining of the 82
transgenic plants showed that 12 of them were stained.10 out of the 12 transformants plants were stained only in veins
of plants , and the other 2 transgenic plants were stained both in veins and stems.Under salt st ress , only one plant
showed GUS activity in roots.The flanking sequences of T-DNA inserting si tes in 5 transgenic Torenia showedGUS ac-
tivity w as amplified by TAIL-PCR.
Keyword:Promoter trapping;Genetic transformation;GUS reporter gene;Torenia fournieri Linden
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