全 文 ：化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 Chemistry &Bioengineering 45
收稿日期:2006-11-13
作者简介:李于善(1950-),男 ,湖北宜昌人 ,教授 , 主要从事天然有机化学研究。 E-mail:Lyus2006@163.com。
均匀设计法优选隔山牛皮消中总甾苷的半仿生提取工艺
李于善 , 贺 艳
(三峡大学天然产物研究与应用湖北省重点实验室 ,湖北 宜昌 443002)
摘 要:以总甾苷含量和干浸膏得率为指标 ,采用均匀设计法确定隔山牛皮消中总甾苷的半仿生提取的最佳工艺条
件为:3 次煎水 pH 值分别为 5.0 、6.0 、8.0 ,用 8 倍量的水分别回流提取 2 h 、1 h 、1 h , 总提取时间为 4 h。并用实验验证
了以上最佳工艺条件的可行性。
关键词:隔山牛皮消;总甾苷;均匀设计法
中图分类号:TQ 461 R284.2 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0045-02
隔山牛皮消是一种临床常用的补益和抗衰老的中
药 ,唐代的本草著作开始有记载 。原植物为萝藦科鹅
绒属植物 C.uil f ordii(Ma xim)Hemsl ,产于湖北 、重
庆 、湖南[ 1] 。现代科学研究发现 ,隔山牛皮消具有提高
免疫力 、抗肿瘤和抗衰老等作用 。甾体酯苷是从隔山
牛皮消中发现含量最高 ,也是最主要的活性成分[ 2] 。
半仿生提取法是从生物药剂学角度模拟口服及经
胃肠道给药的中药制剂设计的一种新型提取工艺 ,体
现了中医临床用药的综合作用特点 ,符合口服药物经
胃肠道转运吸收的原理[ 3] 。作者以总甾体酯苷含量 、
干浸膏得率为指标 ,采用均匀设计法对隔山牛皮消中
总甾苷的半仿生提取工艺条件进行了优化研究 。
1 实验
1.1 原料和仪器
总甾苷对照品 ,从滨海首乌制品厂生产的“首乌饮
片”中提取 、分离 、纯化制得;隔山牛皮消购自宜昌市药
材公司 。所用试剂均为分析纯。
Ultrospec 4000型紫外可见分光光度计 , Pharma-
cia Biotech , Eng land ;Sarto rius电子天平 ,北京赛多利
斯仪器有限公司;Del ta 320型 pH 计 ,梅特勒-托利
多仪器上海有限公司。
1.2 提取方法
称取6份隔山牛皮消药材 ,每份50 g ,均采用不同
pH 值的水依次提取 3次 , 3次提取时间比为 2 ∶1 ∶
1 ,按实验方案回流提取(提取前先浸泡 30 min), 过
滤 ,浓缩 ,定容至100 mL备用(每 1mL 含隔山牛皮消
0.5 g)。
1.3 干浸膏的测定[ 4]
精密量取各药液 2 mL置于已干燥至恒重的蒸发
皿中 ,水浴蒸干溶剂后放入烘箱中于 105℃干燥 3 h ,
取出 ,移至干燥器中 ,冷却 30 min ,迅速精密称重 。
1.4 总甾苷含量的测定
1.4.1 对照品溶液的制备
精密称取由“首乌饮片”提取的总甾苷 ,用乙醇溶
解 ,配成浓度为 0.512 mg ·mL-1的溶液 ,作为对照品
溶液。
1.4.2 紫外吸收光谱的测定
取总甾苷对照品溶液于 200 ～ 400 nm 波长范围
内扫描 ,测得在228 nm波长处有最大吸收(如图 1 所
示),故选择228 nm波长处测定吸光度。
图 1 紫外光谱图
Fig.1 UV spectra of the sample
1.4.3 标准曲线的制定
精密吸取 0.512 mg · mL -1总甾苷对照品溶液
0.1 mL 、0.3 mL 、0.5 mL 、0.7 mL 、0.9 mL 、1.1 mL
于10 mL容量瓶中 ,用无水乙醇稀释 ,配成浓度(μg ·
mL
-1)为 5.12 、15.36 、25.60 、35.84 、46.08 、56.32 的
李于善等:均匀设计法优选隔山牛皮消中总甾苷的半仿生提取工艺/ 2007 年第 1 期46
溶液 ,以无水乙醇为空白于 228 nm 波长处测定吸光
度 ,以吸光度 A 为纵坐标 ,以浓度 c(μg · mL-1)为横
坐标绘制标准曲线 ,得回归方程为:A=0.017413c-
0.046418 , R =0.9999(n =6),结果本品溶液浓度在
5.12 ～ 56.32 μg ·mL-1范围内符合 Beer-Lambert 定
律 。
1.4.4 样品溶液制备
精密量取提取液 2 mL(含隔山牛皮消0.5 g ·
mL
-1),置蒸发皿中水浴蒸干 ,在残渣中加入 5%的盐
酸溶液溶解 ,过滤 ,弃去不溶物。滤液加等量乙醚萃取
3次 ,分出乙醚层 ,取水层用氨水调 pH 值至 9 ～ 10 ,再
用乙醚萃取至不显甾苷反应和不显 Kelle r-Kiliam i反
应为止 。合并乙醚液 ,水浴蒸干溶剂 ,残渣用无水乙醇
溶解 ,过滤 ,定容于 50 mL 容量瓶中 ,作为样品液 。
2 结果与讨论
2.1 均匀设计实验结果
根据半仿生提取法理论[ 3 , 5] ,在药材粒度 、煎煮温
度 、过滤 、浓缩等条件一致的前提下 ,确定考察的因素
和水平 。根据预实验的结果 ,提取溶媒的 pH 值 、溶媒
用量 、提取时间等因素对提取结果的影响较大 ,故考察
以上几个因素 ,因素水平见表 1。以干浸膏得率 、总甾
苷含量为指标 ,选用 U 6(65)均匀设计表安排实验 ,结
果见表 1。
表 1 均匀设计实验安排及结果
Tab.1 The experiment schemes and results
实验
号
第一煎水
pH值
第二煎水
pH值
第三煎水
pH值
溶媒用
量/倍
总提取
时间/h
y
1
mg ·mL-1
y
2
% Y
1 1.0 7.0 7.0 6 4 13.199 41.64 90.140
2 2.0 10.0 10.0 5 12 10.176 39.64 71.312
3 3.0 5.0 12.0 7 8 9.015 40.48 65.566
4 4.0 8.0 11.0 3 2 9.028 29.53 70.032
5 5.0 6.0 8.0 4 10 15.740 38.32 96.143
6 6.0 9.0 9.0 8 6 15.771 39.95 95.414
注:总提取时间指 3次提取时间的总和 ,按 2∶1∶1分配
总甾苷的含量越多越好 ,故将含量为 160 mg ·
mL
-1的总甾苷含量定为 100分 ,Y 1表示隔山牛皮消总
甾苷含量得分 ,用公式Y 1 =y 1 ÷ 16 ×100 ,把各实验总
甾苷含量转化为分数 。干浸膏得率越高 ,则服用量越
大 ,所以干浸膏得率越小越好 ,故将干浸膏得率 29 %
定为 100分 ,Y 2表示干浸膏得分 ,用公式 Y 2 =129 -
y 2 ,把各实验的浸膏得率转化为分数。另外 ,总甾苷含
量要比干浸膏得率重要 ,权重系数取 0.7和 0.3 ,用公
式Y =0.7 Y 1 +0.3 Y 2计算总得分 ,结果见表 1。
2.2 多元回归方程的建立
将综合得分采用 SPSS11.0进行多元线性回归统
计处理 ,得回归方程Y =116.964+4.358x1 -0.333 x2
-6.117x3 +0.856x4 +0.361x5 ,Y =1.000(x 1 、x2 、x3
分别为第一 、第二 、第三煎水的 pH 值 , x4为提取溶媒
用量 , x5为总提取时间),回归方程有显著性意义 。方
差分析见表 2。
表 2 方差分析
Tab.2 Results of variance analysis
模型 平方和 自由度 均方 F P
回归 910.347 5 182.070 - -
残差 0.000 0
总和 910.347 5
由上述方程及方差分析可以看出 ,在实验条件范
围内 ,第三 、第一煎水的 pH 值对实验结果影响最大 ,
其次为溶媒用量。各因素对结果的影响程度大小顺序
依次为:第三煎水 pH 值>第一煎水 pH 值>溶媒用
量>提取时间>第二煎水 pH 值 。
结合实验结果以及工业化大批量生产操作的实际
情况 ,确定该提取工艺的最佳工艺条件是:三次煎煮用
水的pH 值分别为5.0 、6.0 、8.0 ,用 8倍量的水回流提
取 3次 ,总提取时间为4 h。在此条件下可获得较高的
总甾苷含量和最小的干浸膏得率 。
2.3 提取优化条件的验证
称取隔山牛皮消药材 ,按最佳提取工艺条件进行
验证实验 , 得总甾苷含量为15.498 mg · mL-1(n =
3)、干浸膏得率为 30.15 %(n =3), 综合评分为
97.33 。实验结果接近预测值 ,说明优选的最佳工艺
条件可行 。
3 结论
中药的药用成分的分离提取受多种因素的影响 ,
提取工艺条件的选择不但要考虑主要有效成分的得
率 ,还要兼顾干固物的得率 ,这关系到服药量的大小 ,
作者通过均匀设计实验 ,考察了第一 、第二 、第三煎水的
pH值 ,溶媒用量 ,提取时间5个因素对总甾苷得率和干
浸膏得率的影响 ,确定最佳提取工艺条件为:3次煎水
pH值分别为 5.0 、6.0 、8.0 ,用 8倍量的水分别回流提取
2 h 、1 h 、1 h ,总提取时间为4 h。验证实验结果接近预
测值 ,说明优选工艺的条件可行 ,也验证了均匀设计法
适用于中药提取中多因素优选实验。
(下转第78页)
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 Chemistry &Bioengineering 47
收稿日期:2006-10-18
作者简介:秦晓蓉(1969-),女 ,重庆合川人 ,讲师 , 在读博士 ,从事生物活性物质分离纯化等领域的研究。
固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的性能研究
秦晓蓉1 , 易德莲1 , 伍 林1 , 张铭金1 , 2 , 王春伟1 , 王立立1
(1.武汉科技大学化学工程与技术学院 , 湖北 武汉 430081;
2.中国科学院武汉物理与数学研究所 , 湖北 武汉 430071)
摘 要:用固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白(Hb),考察了血红蛋白浓度 、pH 值 、离子强度 、温度和时间对吸
附的影响。结果表明 , 固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的最大吸附量为 14.8719 mg · g -1 , 当控制温度 16 ～
25℃、pH 值 7.0 ～ 7.4 、Hb 浓度 0.8484 ～ 1.2726 mg·m L-1时 , 吸附效果较好;离子强度越低 , 吸附效果越好;吸附时
间至少为 30 min。固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的研究为实际体系的分离研究奠定了基础。
关键词:固定化铜离子;亲和膜;静态吸附;血红蛋白
中图分类号:Q 51 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0047-03
亲和膜是 20世纪 80 年代末出现的技术 ,该技术
利用亲和配基修饰的膜为亲和吸附介质亲和纯化目标
物 ,已分离纯化了免疫球蛋白[ 1 , 2] 、超氧化物歧化酶[ 3] 、
溶菌酶[ 4] 等。孙旭东等[ 5] 对血红蛋白(Hemog lobin ,
Hb)和血清白蛋白在金属螯合亲和层析柱上的洗脱效
果进行了对比研究 ,作者[ 6] 曾就固定化铜离子亲和膜
色谱柱对 Hb的吸附行为进行研究 ,在此则利用固定
化铜离子亲和膜进行静态吸附 Hb 的研究 ,拟为实际
产品的分离制备奠定基础。
1 实验
1.1 试剂与仪器
纤维素分析滤纸 , 杭州新华造纸厂;亚氨基二乙
酸 ,化学纯 ,湖州生物化学厂;牛血红蛋白 ,上海伯奥生
物科技有限公司;其它试剂均为国产分析纯 ,实验用水
为二次蒸馏水 。
UV-2000型紫外可见分光光度计 ,上海尤尼柯仪
器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅 ,上海博迅实业
有限公司医疗设备厂;PB-10型酸度计 ,德国 Sartorius
公司。
1.2 固定化铜离子亲和膜的制备
固定化铜离子亲和膜的制备方法参见文献[ 7] ,将
制备的膜裁成直径为 25 mm 的圆片 ,用二次蒸馏水洗
去未反应的铜离子等杂质 ,备用 。
1.3 固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白实验
在室温下 ,将一张直径为 25 mm 的固定化铜离子
亲和膜放入 pH 值为 7.0 的 8 mL Hb 溶液(cHb =
0.9795 mg · mL-1)中 ,静置吸附 2 h ,用分光光度法
(波长为409 nm)测量固定化铜离子亲和膜吸附 Hb
前后溶液的吸光度值。
固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的吸附率及每克干
固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的吸附量按下式计算:
吸附率/ %=吸附前 Hb 量-吸附后 Hb 量吸附前 Hb 量 ×100%
吸附量/ mg· g -1 =吸附前 Hb 量(mg)-吸附后 H b量(mg)固定化铜离子亲和膜(g)
2 结果与讨论
2.1 血红蛋白浓度对吸附的影响
其它条件不变 , 考察了 Hb 浓度(0.03182 ～
3.39360 mg ·mL -1)对吸附的影响 ,结果见图 1。
图 1 血红蛋白浓度对吸附量 、吸附率的影响
Fig.1 Inf luence of hemoglobin concentration on the
adsorption amount, adsorption rate of the affinity
membrane for hemoglobin
由图 1 可知 ,固定化铜离子亲和膜静态吸附 Hb
的吸附量随着 Hb浓度增大而增加 。当 Hb浓度大于
秦晓蓉等:固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的性能研究/ 2007 年第 1 期48
2.1210 mg ·mL-1时 ,吸附量随着 Hb 浓度增大基本
不变。这是因为每克干固定化铜离子亲和膜提供的亲
和配基铜离子与 Hb表面组氨酸结合已达饱和 ,即达
到了固定化铜离子亲和膜吸附 Hb 的最大吸附量
14.8719 mg · g-1 。Hb浓度为 0.8484 ～ 1.2726 mg
·mL -1时 ,固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的吸附率较
高;Hb浓度小于 0.8484 mg ·mL-1时 ,固定化铜离子
亲和膜吸附 Hb的吸附量随 Hb浓度增大而增加 ,吸
附率随之提高 ,Hb浓度较小时吸附率较低是因为 Hb
属大分子 ,运动缓慢 ,和固定化铜离子亲和膜上的亲和
配基铜离子碰撞的几率较低 ,固定化铜离子亲和膜吸
附 Hb的吸附量较低 , 吸附率也较低;Hb 浓度大于
1.2726 mg ·mL-1时 ,固定化铜离子亲和膜吸附 Hb
逐渐达饱和 ,随着 Hb浓度增大 ,吸附前 Hb量增加 ,
固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的吸附率反而降低 。因
此 ,Hb浓度以 0.8484 ～ 1.2726 mg ·mL-1为宜 。
2.2 pH值对吸附的影响
其它条件不变 ,考察了 pH 值(4.4 ～ 10.4)对吸附
的影响 ,结果见图 2。pH 值对应的缓冲体系为:乙酸
-乙酸钠缓冲溶液(3.6 ～ 5.8)、磷酸氢二钠-磷酸二
氢钠缓冲溶液(5.8 ～ 8.0)、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶
液(9.2 ～ 10.6)。
图 2 pH值对吸附量的影响
Fig.2 Influence of pH value on the adsorption amount
of the affinity membrane for hemoglobin
由图 2可知 , pH 值为 7.0 ～ 7.4 时 ,固定化铜离
子亲和膜吸附 Hb的吸附量较高。这是因为 Hb 表面
的组氨酸与 Cu2+结合而被吸附 , Hb 的等电点 pI 为
7 , pH 值小于 7.0或大于 7.4都会使 Hb分子的结构
发生变化 ,进而使其表面组氨酸数量发生变化 ,影响其
与 Cu2 +的结合 ,使固定化铜离子亲和膜吸附 Hb 的吸
附量降低。因此 , pH 值以 7.0 ～ 7.4为宜 。
2.3 离子强度对吸附的影响
其它条件不变 ,Hb浓度为 0.9795 mg ·mL-1 ,考
察了氯化钠浓度(0 ～ 1.2500 mol·L -1)对吸附的影
响 ,结果见图 3 。
图 3 离子强度对吸附量的影响
Fig.3 Influence of ionic strength on the adsorption amount
of the affinity membrane for hemoglobin
由图 3可知 ,固定化铜离子亲和膜吸附 Hb 的吸
附量随着离子强度增加而降低 ,这是因为蛋白是两性
物质 ,带电离子会与蛋白表面的氨基酸结合 ,从而降低
了固定化铜离子亲和膜提供的亲和配基铜离子与氨基
酸结合的几率 。因此 ,离子强度越低 ,吸附效果越好 。
2.4 时间及温度对吸附的影响
其它条件不变 ,考察了吸附时间及温度对吸附的
影响 ,结果见图 4 、图 5 。
图 4 时间及温度对吸附量的影响
Fig.4 Influence of time and temperature on the adsorption
amount of the affinity membrane for hemoglobin
图 5 温度对吸附率的影响
Fig.5 Influence of temperature on the adsorption rate of
the affinity membrane for hemoglobin
秦晓蓉等:固定化铜离子亲和膜静态吸附血红蛋白的性能研究/ 2007 年第 1 期 49
图 4表明 ,在恒定温度下 ,固定化铜离子亲和膜吸
附 Hb的吸附量随着吸附时间的延长而增加 ,然后达
到吸附平衡 。在 16℃时 ,吸附 30 min后 ,吸附量增加
缓慢;达到吸附平衡的时间随着温度升高而缩短 。图
5表明 ,温度为 11 ～ 25 ℃时 ,固定化铜离子亲和膜吸
附 Hb的吸附率较高 ,这是因为升高温度可以使固定
化铜离子亲和膜吸附 Hb 的反应易于进行 ,同时血红
蛋白热变性的几率也加大 。因此 ,固定化铜离子亲和
膜吸附 Hb的温度范围以 16 ～ 25 ℃为宜 ,而吸附时间
至少为30 min。
3 结论
固定化铜离子亲和膜静态吸附 Hb的行为对实际
产品的制备具有指导意义 。当控制温度为 16 ～ 25℃、
pH 值为 7.0 ～ 7.4 、Hb浓度为 0.8484 ～ 1.2726 mg ·
mL
-1时 ,吸附效果较好;离子强度越低 , 吸附效果越
好 。每克干固定化铜离子亲和膜吸附 Hb的最大吸附
量为 14.8719 mg ,为了获取较高吸附率 ,待提取液中
Hb量须低于固定化铜离子亲和膜吸附 Hb 最大吸附
量的 90%,吸附时间至少为30 min。
参考文献:
[ 1] 贾凌云, 杨利 , 邹汉法 , 等.ProteinA亲和膜色谱柱的性能及从人血
浆中纯化免疫球蛋白的研究[ J] .色谱 , 1998 , 16(6):476-480.
[ 2] Cast ilh o L R , Anspach F B , Deckwer W D.C om pari son of af fini-
ty mem branes fo r the pu rifi cation of imm unoglobulins[ J] .Journal
of Membrance S cien ce , 2002 , 207(2):253-264.
[ 3] 魏琪 ,姚汝华 ,鲍时翔.固定化金属螯合亲和膜色谱柱制备及纯化
铜锌超氧化物歧化酶的研究[ J] .色谱 , 2000 , 18(4):361-363.
[ 4] Denizli A , Senel S , Arica M Y.Cibacron Blue F3GA and Cu(II)
derived poly(2-hydroxyethylmethacrylate)memb ranes for lyso-
zyme adsorption[ J] .Colloids and Surfaces B:Biointerfaces , 1998 ,
11(3):113-122.
[ 5] 孙旭东 , 李红旗 , 隋洪艳 , 等.金属螯合亲和层析分离蛋白质的
研究[ J] .生物工程学报 , 2000 , 16(4):495-499.
[ 6] 秦晓蓉 , 伍林 , 易德莲 , 等.固定化铜离子亲和膜层析柱吸附血
红蛋白的研究[ J] .色谱 , 2005 , 23(3):255-257.
[ 7] 魏琪 ,姚汝华 ,鲍时翔.两种固定化金属螯合复合亲和膜色谱介质
制备[ J] .功能高分子学报 , 2000 , 13(1):90-92.
Study of Static Adsorption for Hemoglobin by Immobilized
Copper Ion Affinity Membrane
QIN Xiao-rong1 , YI De-l ian1 , WU Lin1 , ZHANG Ming-jin1 , 2 , WANG Chun-wei1 , WANGLi-li1
(1.College o f Chemical E ngineering and Technolog y , Wuhan Universi ty o f
Science and Technology , Wuhan 430081 , China;
2.Wuhan I nst itute o f Phy sics and Mathematics , the Chinese Academy of Sciences , Wuhan 430071 , China)
Abstract:Immobilized copper ion af finity membrane w as used as an aff ini ty adso rbent for hemog lobin .The
majo r influent ial factors on hemog lobin adso rption such as hemoglobin concentra tion(0.03182 ～ 3.39360 mg ·
mL
-1), pH value(4.4 ～ 10.4), ionic st reng th(0 ～ 1.2500 mo l·L-1), temperature(1 ～ 35 ℃), and time(1 ～
120 min)were investig ated.T he resul ts show ed that the most abso rption capacity of hemoglobin w as 14.8719
mg · g-1 .The opt imal operat ion condit ions w ere found as fol low s:the hemog lobin concentration of 0.8484 ～
1.2726 mg ·mL-1 , pH value range of 7.0 ～ 7.4 , temperature range of 16 ～ 25 ℃, the adso rption time of mo re
than 30 min and low er ionic st reng th .This w o rk facili tates the further research in separa tion of real sy stems.
Keywords:immobilized copper ion ;af finity membrane;static adso rption ;hemoglobin
《腐植酸》杂志 2007年征订启事
《腐植酸》杂志 1979年创刊 , 双月刊 ,是中国腐植酸工业协会主办的全国惟一的腐植酸类专业科技期刊 , 国内外公开发行。《腐
植酸》杂志是《中国学术期刊综合评价数据库》来源期刊 、《中国学术期刊(光盘版)》入编期刊 、第六届全国石油和化工行业专业技术
类优秀期刊。大 16开 , 60 页 , 主要栏目有:卷首语 、专题评述 、研究论文 、译文 、原料与检测 、协会(专业)标准讨论 、腐植酸文摘 、腐植
酸专利简介 、两会动态 、信息传真 、环保视窗等。
每期定价 15.00 元(含邮费),全年 6期 , 总计 90.00 元(含邮费 , 请从邮局汇款)。如需过刊者 , 请直接与编辑部联系。
地址:北京市西城区六铺炕街 1 号《腐植酸》编辑部 邮编:100011 电话:010-82035180
传真:010-82032432 E-mail:chaia@126.com;humicacid@sohu.com 网址:w ww .chinaha.o rg
2007, Vol.24 No.1化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering50
收稿日期:2006-10-23
作者简介:潘涛(1975-), 女 ,江苏盐城人 ,硕士 , 讲师 ,研究方向为离子束生物工程。 E-mail:pantaotao1@hotmail.com。
紫外诱变柠檬酸生产菌黑曲霉的选育
潘 涛1 , 周 剑2 , 虞 龙3
(1.江苏广播电视大学 ,江苏 南京 210036 ;2.福建省微生物研究所 ,福建 福州 350007;
3.南京工业大学制药与生命科学学院 ,江苏 南京 210009)
摘 要:初步研究了柠檬酸生产菌黑曲霉产柠檬酸的影响因素和培养条件 , 通过紫外诱变考察了出发菌株的受诱变
性 , 统计了紫外诱变黑曲霉引起的生物学效应 , 在紫外诱变过程中筛选到一株稳定高产菌株 10min-3 , 产酸增加了
5.33%,可作为进一步诱变筛选的出发菌株。
关键词:紫外;诱变;柠檬酸;黑曲霉
中图分类号:TQ 921.1 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0050-03
柠檬酸是世界上以生物化学方法生产的产量最大
的有机酸 ,也是一种重要的有机酸 ,在食品 、医药 、化工
等领域应用十分广泛 ,世界年产量约 100万 t。我国是
柠檬酸主要生产国 ,年产能力近 50万 t ,占世界总产量
的 40 %以上[ 1 ～ 4] 。
紫外线是一种使用最早 、沿用最久且应用效果明
显的微生物诱变剂 ,其诱变频率高 ,迄今仍然是微生物
育种中最常用和有效的诱变剂之一。紫外线由紫外灯
管产生 ,设备简单 、操作方便 、价格低廉 、诱变效果明
显 。
作者首先以出发菌绘制发酵产酸曲线 ,并对产柠
檬酸值的影响因素和培养条件做初步研究 ,对筛选出
的优质菌株紫外诱变 ,统计紫外诱变黑曲霉引起的生
物学效应 ,提高其产酸值。
1 实验[ 5 ～ 11]
1.1 菌种
黑曲霉(Aspergi l lus niger),本实验室保存。
1.2 培养基配制
斜面培养基:0.2 kg · L-1马铃薯的煮汁 , 2%蔗
糖 ,1.7 %琼脂 ,115℃灭菌 30 min 。
普通培养基:0.2 kg · L-1马铃薯的煮汁 , 2%蔗
糖 ,1.3 %琼脂 ,115℃灭菌 30 min 。
高葡萄糖平板:普通培养基中加 25 %葡萄糖(葡
萄糖需分消)。
高柠檬酸平板:普通培养基(4%琼脂)中加 30 %
柠檬酸(柠檬酸需分消)。
稀土平板:普通培养基中加 0.3%稀土。
木薯粉玉米粉混合摇瓶培养基:0.16 kg · L-1木
薯粉 ,0.04 kg · L-1玉米粉 , 0.0067 kg ·L -1尿素 , α-
淀粉酶 ,蒸馏水 ,液化 30 min , 定容 ,每50 mL分装于
500 mL三角瓶中 , 115℃灭菌30 min ,备用 。
1.3 培养方法
斜面培养:37℃,培养 5 ～ 7 d 。500 mL三角瓶中
装入50 mL培养液 , 115 ℃灭菌30 min ,接入孢子 。摇
床转速300 r ·min-1 , 37℃振荡培养 64 ～ 72 h 。
1.4 诱变方法
产柠檬酸菌株经固体斜面培养基活化培养后 ,用
无菌水洗下新鲜孢子 ,制成孢子悬浮液 ,用灭菌吸管吸
取滴于灭菌的固体平面培养基中(液滴直径约2 mm),
涂抹均匀 ,置于20 W紫外灯下30 cm处 ,以时间控制辐
射剂量 ,室温 20℃。
1.5 筛选方法
1.5.1 初筛
将经诱变后的平板用无菌水洗下 ,涂布于普通培
养基和筛选培养基 。挑选在普通培养基上菌落较小且
比较紧密的菌落及在筛选培养基上能生长的菌落。把
这些菌落转接到斜面培养基上进一步筛选 。
1.5.2 复筛
将初筛获得的菌株转入发酵培养基逐个发酵 ,进
行产量测定。
1.6 分析方法
1.6.1 pH 值测定
采用雷磁 PHS-3C 型精密 pH 计与精密 pH 试纸
潘 涛等:紫外诱变柠檬酸生产菌黑曲霉的选育/2007 年第 1 期 51
相结合测定。
1.6.2 产酸测定
(1)酸度测定:发酵液经脱脂棉过滤后 , 用
0.1429 mo l·L-1的 N aOH 滴定 ,以酚酞为指示剂 ,用
标准溶液滴定至淡粉红色 ,记录体积数。
(2)酸值 A(%)计算:A=K ·V
式中 K =1-(失水量/50),V 是碱液滴定体积数。
1.6.3 显微镜检查
显微镜型号 JNOEC XS-212-201 ,采用10倍放大。
1.6.4 存活率 、诱变菌株产酸率增幅的计算
已照射菌株的存活率为其在固体平面培养基生长
的菌落数与同样条件下生长的菌落数的比值。
诱变菌株产酸率的增幅 =(诱变菌株的产酸率-
对照菌株产酸率)/对照菌株产酸率。增幅为+5 %～
-5%,为无义突变;低于-5%,为负突变;高于+5%,
为正突变。
2 结果与讨论
2.1 培养条件的优化
2.1.1 菌株的发酵曲线分析
选择原始菌株 N1-2 为发酵菌株 ,采用木薯粉与
玉米粉混合培养基配方 ,进行发酵曲线分析 ,结果如图
1所示 。
图 1 发酵产酸曲线
Fig.1 Fermentation curve
由图 1可知 ,该菌株产柠檬酸的酸值在 67 ～ 69 h
达到最高点。从显微镜下可以看出 ,柠檬酸发酵高产
时 ,黑曲霉菌丝球多 ,球体小而紧密。而菌体大或是生
长过旺而产生菌丝体时产酸都不高。
2.1.2 溶氧对产酸的影响
从 N1-2成熟斜面中取出一环孢子 ,分别接种于
250 mL 及 500 mL 三角瓶中 50 mL 装液量的发酵液
中 ,转速 300 r ·min-1旋转摇床发酵69 h 。取 10组数
据的平均值 , 250 mL 三角摇瓶产酸12.13 g ·(100
mL)-1 、500 mL 三角摇瓶产酸12.72 g ·(100 mL)-1 。
由上述结果可知 ,用 500 mL的三角摇瓶较适合柠檬酸
的积累 ,这也说明菌体在生长阶段需要较多的溶氧量。
2.1.3 接种量对产酸的影响
从 N1-2 成熟斜面中加入 10 mL 无菌水刮出孢
子 ,倒入装有小玻璃珠的三角瓶中 ,置于转速 180 r ·
min-1旋转摇床上旋转 10 min 后 ,过滤制成菌悬液 。
分别吸取 1 mL 、2 mL 及 3 mL 菌悬液置于 500 mL 三
角瓶 50 mL 装液量的发酵培养基中 ,即接种量为 2 %、
4%、6%,转速 300 r ·min-1旋转摇床发酵69 h ,结果
见表 1。
表 1 接种量对产酸的影响
Tab.1 Effect of inoculation on yield of acid
接种量(1)/ % 产酸/ g ·(100 mL)-1 接种量(2) 产酸/g ·(100 mL)-1
2 12.74 一环 12.73
4 12.71 二环 12.70
6 12.60 三环 12.56
表 1数据为 10组数据的平均值 。由表 1可以看
出 ,接种量为 2%和 4%的产酸相近 ,可见达到饱和接
种量后对产酸基本无影响 ,而接种量过大为 6%时 ,反
而使产酸略降低。
为提高诱变筛选效率 ,直接用接种针从成熟斜面
中接孢子来研究接种量对产酸的影响。从 N1-2成熟
斜面中取出孢子 ,分别取一环 、二环 、三环置于 500 mL
三角瓶 50 mL 装液量的发酵培养基中 ,转速 300 r ·
min-1旋转摇床发酵69 h ,结果见表 1 。表 1数据为 10
组数据的平均值。由表 1 可以看出 ,接种量为一环和
二环的产酸相近 ,可见达到饱和接种量后对产酸基本
无影响 ,而接种量过大 ,接三环反而使产酸略降低。因
此接种量取成熟斜面上的一环孢子为宜。
2.2 紫外诱变
2.2.1 菌体存活曲线
经过固体平面培养基的培养 ,菌体紫外诱变的存
活曲线如图 2所示 。
图 2 紫外辐照菌株存活曲线
Fig.2 Survival rate of UV strains under irradiation
潘 涛等:紫外诱变柠檬酸生产菌黑曲霉的选育/ 2007 年第 1 期52
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的
处理具有悠久的历史 ,它属于非电离辐射 ,作用机理是
使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级 ,
可能导致 DNA 链和氢键断裂等生物学效应。紫外诱
变的存活率曲线是呈指数下降的。由图 2 可以看出 ,
随着紫外诱变时间的延长 ,存活率呈明显的下降趋势 ,
20 min后存活率低于 5%。
2.2.2 紫外诱变后产酸
在每个辐照剂量下挑出 40 株诱变菌株进行对比
发酵实验。结果发现辐照时间 1 ～ 10 m in之间菌株产
酸有较大增幅 ,最高增幅率为 5.35 %;辐照15 min后 ,
产酸基本无较大增幅。
由于柠檬酸原始生产菌株是经过工业诱变的菌
株 ,对紫外诱变手段已具有较高的耐受性 ,因此突变率
不高。正突变率为 16.7 %,负突变率为 22.2%,无义
突变为 61.1%。
2.2.3 诱变菌株的遗传稳定性研究
选取诱变产酸值有较大增幅的两菌株 10min-3和
6min-2＊ ,传代培养 ,产酸结果见表 2。
表 2 高产突变株 10min-3、6min-2 ＊遗传稳定性实验
Tab.2 The genetic stability of high productive mutant
strains 10min-3 , 6min-2＊
对照 N1-2产酸
g ·(100 mL)-1
10min-3产酸
g ·(100 mL)-1
酸值增幅
%
6min-2＊产酸
g ·(100 mL)-1
酸值增幅
%
12.70 13.38 5.35 13.46 5.97
12.69 13.37 5.36 12.78 0.63
12.70 13.39 5.43 12.63 -0.55
12.71 13.37 5.19
由表 2可以看出 ,紫外诱变菌株 10min-3 比较稳
定 ,多次传代后产酸稳定在13.38 g ·(100mL)-1左
右 ,平均增幅为 5.33%。而紫外诱变菌株 6min-2＊不
稳定 ,传代后产酸值又恢复到对照水平了。
3 结论
经过紫外诱变处理后得到一株良好的诱变菌株
10min-3 ,可以作为进一步诱变筛选的菌株 。实验结果
表明 ,运用紫外诱变能在一定程度上诱发黑曲霉细胞
的遗传变异 ,得到较出发菌株产酸值提高约 5 %的菌
株 ,但突变率不高 ,由于紫外诱变已使用多年 ,菌体对
它产生了一定的抗性 ,需用其它诱变手段进一步实验
研究。
参考文献:
[ 1] 汪多仁.柠檬酸的国外市场动态和我们的对策[ J] .中国食品用化
学品 , 1999 ,(1):1-6 , 29.
[ 2] 王旭.柠檬酸发酵生产概述[ J] .高等函授学报(自然科学版),
1997 , 11(2):41-48.
[ 3] 边风根 ,张文华.浅谈柠檬酸的现状和前景[ J] .江西化工 , 1999 ,
15(1):4-5.
[ 4] 刘辰.面向 21世纪的新型发酵有机酸工业(一)[ J] .精细与专用
化学品 , 2003 , 11(7):5-6.
[ 5] 潘涛 ,周剑 ,虞龙.离子注入诱变技术在柠檬酸高产菌选育中的应
用[ J] .化学与生物工程 , 2005 , 22(4):233-236.
[ 6] 金其荣 ,张继民 ,徐勤.有机酸发酵工艺学[ M ] .北京:轻工业出版
社 , 1989.
[ 7] 陈小真 ,陈惠萍 ,郭杰炎.玉米粉原料的柠檬酸发酵初步研究[ J] .
工业微生物 , 2000 , 30(1):47-49.
[ 8] 高年发 ,王庆昭 ,杨枫.2-脱氧葡萄糖抗性黑曲霉高产柠檬酸的突
变株的选育[ J] .天津轻工业学院学报, 2000 , 15(4):36-39.
[ 9] 王博彦 ,金其荣.发酵有机酸的生产和应用手册[ M ] .北京:轻工
业出版社 , 2000.
[ 10] 李文革 , 彭玲 , 刘宣承.60Co-γ射线诱变柠檬酸产生菌黑曲霉
Co9-6的研究[ J] .激光生物学 , 1994 , 9(6):419-512.
[ 11] 朱亨政.淀粉原料直接发酵生产柠檬酸[ J].工业微生物 , 1990 ,
20(4):20-24.
Breeding of Citric Acid Producing Bacteria Aspergillus Niger by UV Mutation
PAN Tao1 , ZHOU Jian2 , YU Long3
(1.J iangsu Radio and T V University , N anj ing 210036 ,China;2.Fuj ian I nst itute o f Microbiolog y ,
Fuz hou 350007 ,China ;3.Collegeo f Li f e Science and Pharmaceutical E ngineering ,
Nanj ing University o f Technology , Nanj ing 210009 ,China)
Abstract:The influential facto rs and culture condi tions fo r Aspergi llus niger producing cit ric acid w ere pri-
marily studied.The bearing perfo rmances of the starting st rains ir radiated by UV were explored and the bio logi-
cal ef fects induced by UV mutation we re investiga ted.During the course of UV mutation , a high productive
st rain 10min-3 , which enhanced the yield of cit ric acid by 5.33%, was screened as starting strain for further
study .
Keywords:UV ;mutation;ci tric acid;Asperg il lus niger
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 Chemistry &Bioengineering 53
收稿日期:2006-09-15
作者简介:杨成丽(1976-),女 ,湖北襄樊人 ,讲师 , 博士研究生 , 研究领域为基因工程;通讯联系人:李大力(1965-),江苏徐州人 ,
副教授 ,博士 , 研究领域为生物化工。 E-mail:yangchengli11@163.com。
人 Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
杨成丽 , 郑迎迎 , 柯前进 , 李大力
(南京理工大学化工学院生物工程系 ,江苏 南京 210094)
摘 要:PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因(hAⅠ),插入大肠杆菌表达载体 pET30a中 ,构建重组表达质粒 pET30a-hAⅠ,转化
大肠杆菌宿主菌 BL21(DE3), 构建大肠杆菌基因工程菌 BL21(DE3)(pET30a-hAⅠ), IPTG诱导后表达 , 菌体酶活为每克湿
菌体 34.6 U 。SDS-PAGE 分析表明 ,诱导后的 BL21(DE3)(pET30a- hAⅠ)在约 35 kD处有明显的蛋白表达。
关键词:人Ⅰ型精氨酸酶;克隆;大肠杆菌;表达
中图分类号:Q 78 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0053-02
精氨酸酶(又称 L-精氨酸尿素水解酶)是尿素循
环中的一种酶 ,可催化精氨酸水解产生鸟氨酸和尿素 ,
在机体氮代谢方面起着重要作用 。精氨酸作为一种半
必需氨基酸 ,仅为快速增长的组织尤其是肿瘤组织所
必需。而精氨酸酶通过分解精氨酸对肿瘤细胞进行营
养剥夺 ,对正常组织影响较小 ,因此是一种良好的抗肿
瘤药物 。众多体内外实验证明 ,精氨酸酶有着显著的
抑制肿瘤细胞分裂的作用[ 1 , 2] 。
人Ⅰ型精氨酸酶在 1990年实现了原核表达[ 3] ,受
限于当时表达体系的发展水平 ,研究者采用的启动子
无论是表达水平还是非诱导条件下控制转录的能力都
不如目前广泛使用的 T7 RNA 聚合酶启动子 。南京
理工大学在 2006年尝试了在毕赤酵母工程菌表达人
Ⅰ型精氨酸酶 ,但表达的蛋白没有分泌到酵母细胞外 ,
表达量也偏低[ 4] 。作者在此尝试其在 T7 启动子的调
控下进行原核表达 ,探讨是否会有表达量的提高 。
1 实验
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒
大肠杆菌表达载体 pET30a 及宿主菌 BL21
(DE3),N ovagen 公司。毕赤酵母表达载体 pPIC9K-
h AⅠ为本实验室构建 ,大肠杆菌 TG1由本实验室保
存 。
1.1.2 主要试剂和仪器
PCR试剂盒 、DNA 回收试剂盒 、限制性内切酶 、
T4 DNA连接酶 、EX-Taq酶 , TaKaRa公司 ,其它试剂
为国产或进口分析纯。基因扩增仪 , Eppendo rf公司 。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的克隆
根据 GeneBank中人Ⅰ型精氨酸酶的 cDNA 序列
设计合成引物 ,以本实验室构建的毕赤酵母表达载体
pPIC9K-h A Ⅰ为模板扩增目的基因 h AⅠ 。
Primer F:5′-TAGCA TATGAGCGCCAAGTC-
CAGAACCA T-3′
Primer R:5′-TACGAA TTCTTACTTAGGT-
GGGT TAAGG T-3′
根据 pET30a载体的多克隆位点 ,两条引物的 5′
端分别加上 NdeⅠ和 EcoRⅠ酶切位点。PCR扩增条
件为:95 ℃变性2 min ,然后 95℃变性 30 s , 55℃30 s ,
72 ℃2 min ,25个循环后 70℃延伸10 min 。PCR扩增
产物采用 DNA 回收试剂盒回收 。
1.2.2 重组表达质粒的构建
将上述 PCR 扩增产物和大肠杆菌表达载体
pET30a分别用 NdeⅠ和 EcoRⅠ双酶切后连接 ,连接
产物转化大肠杆菌 TG1。提取转化子的质粒酶切鉴
定 ,筛选出阳性克隆 ,命名为 pET30a-h A Ⅰ 。
1.2.3 基因工程菌的构建
将 pET30a-h A Ⅰ转化至宿主菌BL21(DE3),构建
基因工程菌 BL21(DE3)(pET30a-h A Ⅰ)。同时转化
pET30a至 BL21(DE3),构建 BL21(DE3)(pET30a)
工程菌作为阴性对照。
1.2.4 蛋白的诱导表达
将 BL21(DE3)(pET30a-hA Ⅰ)单菌落接种于
5 mL LB 液体培养基(含卡拉霉素 Km 50 μg ·
mL-1),37℃下200 r ·min-1振荡培养过夜 ,取0.5 mL
杨成丽等:人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达/ 2007 年第 1 期54
隔夜培养物接种于50 mL LB培养基(含 Km)中 ,37 ℃
继续振荡培养 3 h ,加 IPTG 至 1 mmol ·L-1 [同时设
BL21(DE3)(pET30a)菌株和未诱导的 BL21(DE3)
(pET30a-h AⅠ)菌株作对照] ,30℃诱导 。
1.2.5 表达产物分析
采用超声破壁法破碎细胞获取胞内粗酶液 ,粗酶
液进行酶活测定和 SDS-PAGE 分析 。精氨酸酶的酶
活测定按文献[ 5]进行 。
2 结果与讨论
2.1 目的基因的扩增
以 Primer F 和 Primer R为引物进行 PCR扩增 ,
PCR电泳结果见图 1。从图 1可以看出 ,箭头所指的
片段长度接近 1000 bp ,电泳结果与预期相符 。
1.DNA 分子量 Marker(DL2000) 2.PCR 产物
图 1 hAⅠ基因的 PCR扩增产物电泳
Fig.1 Electrophotogram of PCR product
2.2 表达载体的酶切鉴定
将 pET30a-hA Ⅰ 用 N de Ⅰ/EcoR Ⅰ 和 N de Ⅰ/
Hind Ⅲ两种组合的双酶切体系进行鉴定 ,结果见图
2。分别切下约 1 kb 大小的带 , N de Ⅰ/Hind Ⅲ双酶
切所得小带比 N de Ⅰ/EcoRⅠ双酶切所得小带稍大 ,
与理论值相符 。
1.DNA分子量 Marker 2.pET30a-hAⅠ的 NdeⅠ/ EcoRⅠ 双
酶切 3.pET 30a-hAⅠ的 N deⅠ/ Hind Ⅲ双酶切
图 2 重组质粒 pET30a-hAⅠ的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET30a-hAⅠ
by digestion with restriction endonucleases
2.3 表达产物的酶活测定
用 1 mmol·L-1 IPTG 诱导 7 h ,酶活测定显示 ,
重组菌 BL21(DE3)(pET30a-hA Ⅰ)每克湿菌体的酶
活为 34.6 U , 为 BL21(DE3)(pET30a)菌体酶活的
8.5倍 。
2.4 表达产物的 SDS-PAGE鉴定
按 1.2.5所述方法破壁后 ,取 10 μL 破壁上清液
加等量 2×加样缓冲液进行 SDS-PAGE ,同时与转化
空质粒的宿主菌和未诱导的工程菌做对照 ,结果见图
3。由图 3可以看出 ,在约 35 kD处 ,工程菌诱导后产
物明显多于 BL21(DE3)(pET30a)和未诱导处理的工
程菌 ,即 h A Ⅰ基因成功实现了大肠杆菌表达。
1.蛋白分子量 Marker 2.BL21(DE3)(pET 30a-hAⅠ)诱导
3 、4.BL21(DE3)(pET 30a) 5.BL21(DE3)(pE T30a-hAⅠ)未诱导
图 3 表达产物的 SDS-PAGE鉴定
Fig.3 The SDS-PAGE identification of the product
3 结论
选择含有控制转录能力很强的 T7 RNA 聚合酶
启动子的大肠杆菌作为宿主细胞 。人 Ⅰ型精氨酸酶在
天然宿主内没有糖基化修饰 ,因此大肠杆菌表达体系
缺乏翻译后修饰的缺点被弱化。由于大肠杆菌中也存
在精氨酸酶 ,但大肠杆菌精氨酸酶与人 Ⅰ型精氨酸酶
氨基酸序列相似度不到 30%,三级结构应该有较大的
差异 ,可以尝试使用人 Ⅰ型精氨酸酶抗体进行亲和层
析的方法实现二者的分离;也可尝试大肠杆菌的分泌
表达 ,以实现与大肠杆菌本底精氨酸酶的分离。这将
是以后研究的重点 。
作者在成功克隆人 Ⅰ型精氨酸酶基因的基础上构
建其高效原核表达载体 ,表达出有活性的精氨酸酶 ,为
氨基酸剥夺疗法在肿瘤治疗领域的应用注入新的活
力 。
参考文献:
[ 1] Denys N Wheat ley , Elaine Campbell.Arginine catab olism , li ver
ext racts and cancer[ J] .Pathology On cology Research , 2002 , 8
(1):18-25.
(下转第 67页)
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 开发应用 Chemistry &Bioengineering 55
基金项目:广东省科技攻关项目(2005B20401006), 广东省自然科学博士启动基金资助项目(5300170), 广东省粤港招标项目
(2005A20302003),华南理工大学自然科学基金资助项目(E5051040)
收稿日期:2006-08-11
作者简介:杨景峰(1981-), 男 , 河南驻马店人 , 硕士研究生 , 研究方向为功能性碳水化合物材料理论与实验研究。 电话:020-
88370976 , 020-28864231 , E-mail:lo stinbeauty@126.com。
不同载体材料在脲酶固定化中的应用
杨景峰 , 罗志刚 , 罗发兴 , 汪明振
(华南理工大学轻工与食品学院 ,广东 广州 510640)
摘 要:脲酶可广泛应用于农肥科学 、医学和环保监控等领域 , 但游离脲酶在溶液中很不稳定 ,易失活 , 不能长期贮
存和重复使用 , 脲酶的固定化可以克服上述缺点。目前 ,已有很多载体材料用于脲酶的固定化 , 如多糖 、聚合物 、无机吸
附剂等。对不同载体材料在脲酶固定化中的特点和应用进行了综述 ,并对脲酶固定化载体材料的发展前景做出展望。
关键词:固定化;脲酶;载体
中图分类号:TQ 925.9 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0055-03
脲酶是一种来源广泛的植物蛋白酶 ,能高效 、专一
地催化尿素分解。脲酶用途广泛 ,可应用于尿素生产
控制和产品的检验 、农肥科学 、分析化学 、临床医学 、医
学检验和环保监控等领域 。但液体酶价格贵 ,且游离
脲酶在溶液中很不稳定 ,易失活 ,不能长期贮存;反应
后酶难以分离回收 ,不能重复使用;因此 ,其应用受到
一定的限制。
酶的固定化技术克服了以上的不足 ,固定化的脲
酶可结合于不溶性载体材料上 ,稳定性得到加强 ,且可
重复利用。各种固定化脲酶载体材料已得到广泛的研
究 ,使用较多的脲酶固定化载体材料有多糖 、聚合物 、
无机吸附剂等 。目前不同载体固定化脲酶已广泛应用
于医学 、食品工业等领域。如在医学领域作为人工肾
脏 ,可大大缩小人工肾脏的体积 ,降低成本 ,治疗尿毒
症;在食品工业中用于除去饮料或食品中的微量尿素 。
作者对不同载体材料在脲酶固定化中的应用做了相关
的综述 ,并展望了其发展前景。
1 多糖类载体材料在脲酶固定化中的应用
1.1 壳聚糖及其衍生物
壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物 ,是天然直链状
氨基多糖 ,具有来源丰富 、成本低廉 、制备简单 、机械性
能好 、化学性质稳定 、耐热性好等优点 , 分子中具有
β(1 ,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡糖结构 , 其中氨基对
蛋白质具有极高的亲和性 ,提供了易与脲酶共价相联
的活性位点 ,又可络合金属离子使脲酶免受抑制 。郑
迎迎等[ 1] 以壳聚糖载体固定化脲酶 ,探讨了交联条件
对载体性能的影响 ,优化了脲酶固定化的条件 ,得出制
备载体的最优条件是将壳聚糖微球用 6%的戊二醛活
化 2 h ,最佳联酶条件是载体与脲酶共反应 1 h。该条
件下制备的固定化脲酶的最适反应温度为 65℃,最适
反应 pH 值为 6.6 ,Km 值为 0.009 mo l·L-1 ,较游离
酶均有较大改善;热稳定性较游离酶有很大的提高 ,还
具有良好的操作稳定性 。
Chel lapandian等[ 2] 以壳聚糖 -聚甘油异丁酸酯
为载体材料 ,通过共价交联法固定化脲酶 ,该固定化脲
酶的比活力为 82.15%;和游离酶相比 ,其热稳定性 、
耐碱性和储存稳定性均提高 ,最适反应温度提高了
10 ℃,但最适反应 pH 值没有发生变化 。梁足培等[ 3]
以戊二醛交联壳聚糖球 ,以此为载体通过共价结合法
固定化脲酶 ,该固定化脲酶的比活为 10.83 U · g-1载
体 ,且具有良好的重复使用性和贮存稳定性 ,重复使用
10次后仍保留初始活力的 40%,湿态固定化酶在 4 ℃
下贮存 35 d后仍保留初始活力的 46 %。
1.2 纤维素及其衍生物
纤维素是多羟基天然高聚物 ,原料丰富 、价格便
宜 、无毒性。王巨梅等[ 4] 将脲酶吸附在纤维素载体上 ,
再通过交联和包埋双重固定技术制备出活性高和稳定
性好的复合纤维素固定化脲酶。该固定化脲酶的初始
保活期达 2年之久 ,与单一方法制备的固定化脲酶相
杨景峰等:不同载体材料在脲酶固定化中的应用/ 2007 年第 1 期56
比 ,其稳定性提高 10倍 ,大大提高了脲酶的重复利用
率 ,也可满足需高稳定性脲酶的应用场合。
Fahmy 等[ 5] 以腈尿酰氯二乙氨乙基纤维素醚为
载体固定化脲酶 ,该固定化脲酶的活力收率为 72%,
Km值是游离酶的 3.8倍;最适反应 pH 值为 7.5 ,和
游离酶相同;最适反应温度为 65℃;其热稳定性提高 ,
在 90 ℃下加热 15 min仍保留 18%的活性 ,而同等条
件下游离酶已全部失活;另外 ,其抗离子毒性增强。
1.3 淀粉衍生物
包醛氧淀粉含有聚醛结构 ,对氨吸附速度快 、吸附
能力强。于九皋等[ 6] 用包醛氧淀粉固定化脲酶作为口
服吸附剂 ,并在固定化脲酶表面覆上一层海藻酸膜保
护脲酶的活性 ,制成包覆型包醛氧淀粉固定化脲酶 ,在
0.1 mol·L-1的 HCl溶液中浸泡 3 h 后 ,该固定化脲
酶样品对尿素的吸附量可达到 15 mg · g-1 ,约是包醛
氧淀粉的 4倍 ,是一种高效的尿素吸附剂。
Dung 等[ 7]用辐射法将丙烯酰胺接枝共聚到原淀
粉 ,并以此为载体固定化脲酶 ,该固定化脲酶的活力收
率最高可达 70%,重复使用后仍保留较高活力(重复
使用 7次后仍保留初始活力的 60%)。
2 聚合物类载体在脲酶固定化中的应用
2.1 聚乙烯醇类
聚乙烯醇(PVA)可以制成多种形式的载体 ,也可
通过改性来改变其载体性能。潘继伦等[ 8] 以 PVA 凝
胶为载体 ,用包埋法对脲酶进行了固定化 , PVA 凝胶
固定化脲酶的活力收率为 79 %,是聚丙烯酰胺固定化
脲酶的 2倍 ,且该载体材料具有良好的生物相容性 ,其
毒性及溶血试验合格。
Rejikumar等[ 9] 用不同的交联剂对聚乙烯醇进行
交联改性 ,并以其为载体固定化脲酶 。结果表明 ,活化
不同羟基的 PV A-F 载体固定化脲酶效果较好;且在
pH 值 8 ～ 9 、交联时间 3 ～ 4 h 的条件下 ,得到的载体
的固定化效果最好;该固定化脲酶的最适反应温度提
高了 20℃;最适反应 pH 值为 8 ,没有发生变化;储存
稳定性提高 ,在 30℃、pH 值为 8 的条件下 ,储存 45 d
后仍保留初始活力的 50%,而游离酶已完全失活 。
2.2 聚胺类
Laska等[ 10] 用化学氧化聚合法制备聚苯胺膜 ,将
其作为载体固定化脲酶 ,该固定化脲酶的活力收率较
高;储存稳定性和重复使用性均提高 ,在 25℃下储存
40 d仍保留初始活力的 10%,重复使用 7次后仍保留
初始活力的 20 %。
Sarfo等[ 11]用聚醚胺和 P(CH 2OH)3 反应制成的载
体固定化脲酶 ,该固定化脲酶的 Km 值是游离酶的 3
倍;最适反应 pH 值由 7 减小到 6.4 ,最适反应温度由
60℃上升到70℃;储存稳定性提高 ,在 20℃下储存 6周
后 ,仍保留初始活力的50%,而游离酶已失活90%。
2.3 其它聚合物
Pozniak等[ 12] 用胺衍生物和聚砜制成多孔非对称
膜 ,然后氯磺化和胺基化引入胺基 ,并将脲酶固定在该
聚砜膜上 ,该固定化脲酶的Km值比游离脲酶的 Km
值高 4.4倍;其最适 pH 值在 5.0 ～ 7.0之间有最大活
力 ,最适反应温度为 70℃;其操作稳定性 、储存稳定性
和重复使用性提高 ,在 4℃下保存 30 d仍保留初始活
力的 75%,重复使用 17次后仍保留 60%的活力 。
3 无机吸附剂类载体材料在脲酶固定化中的
应用
用无机吸附剂固定化酶时 ,酶与载体之间通过氢
键 、范德华力及离子间的静电引力结合 ,载体吸附酶
量 、载体与酶结合的牢固程度以及固定化后的酶活力
取决于载体的性质 。
Godjevarg ova等[ 13] 用金属螯合法将脲酶固定化
在硅胶和硫化硅上 ,将硫化硅载体用 Ti4+和 V 5+活
化 ,硅胶用 Ti4+活化 ,分别在 110℃和 550℃下干燥 ,
研究不同活化剂和干燥温度对固定化脲酶性质的影
响 ,并研究了固定化脲酶的热稳定性 、最适反应 pH 值
和最适反应温度等 。结果表明 ,在 110℃干燥 、用 Ti4+
活化的硫化硅载体固定化脲酶的活性较高 ,其性质和
游离酶接近;固定化脲酶的最适反应 pH 值和最适反
应温度为 5.8和 30℃,和游离酶相近;在 50℃下加热
90 min后 ,游离酶已完全失活 ,而固定化脲酶仍保留
初始活力的 40 %。多孔硅具有非均质超微结晶结构 ,
表面积较大 ,可由单体结晶硅直接合成 ,且生物稳定性
较高 ,无毒 ,这些特性使其成为酶固定化的理想载体 。
Chaudhari等[ 14] 用多孔硅作载体固定化脲酶 ,并对其
活力收率和重复使用性进行了研究。结果表明 ,用多
孔硅固定化脲酶 ,几乎保留了 100%的初始活力 ,在重
复使用 5次后仍保留初始活力的 77%。此外 ,分子筛
中大多含有硅氧和铝氧键 ,可利用硅偶联剂或铝偶联
剂连接在 HY分子筛的硅氧和铝氧键位置 ,把脲酶直
接键合在分子筛上 。
4 其它材料在脲酶固定化中的应用
蚕丝素蛋白是一种天然生物高分子 ,丝素蛋白的
二次结构会随着一定的物理或化学作用发生不可逆转
的变化 ,由水溶性的丝素蛋白变成非水溶性的 ,从而为
杨景峰等:不同载体材料在脲酶固定化中的应用/2007 年第 1 期 57
酶在丝素蛋白中的固定提供可能 ,且可控制丝素蛋白
变性的程度 ,减少酶的渗漏或挤出 ,提高固定酶的效
率 。邵正中等[ 15] 用甲醇对丝素蛋白进行变性 ,将脲酶
和液状丝素蛋白共同成膜 ,通过蛋白质的变性使脲酶
固定在丝素膜中 ,并制成了脲酶-丝素膜电极 ,其成膜
酶活性散失少 、稳定性高 ,室温下干燥保存 , 2个月后 ,
未发现酶活性有明显的损失 。
董晓毅等[ 16] 将游离脲酶用硫酸铵沉淀下来后 ,以
戊二醛作为交联剂对其进行化学交联 ,制备新型的固
定化脲酶-交联脲酶聚集体 ,该交联脲酶聚集体的最
适反应 pH 值和最适反应温度分别为 8.0 和 70 ℃,且
其热稳定性 、储存稳定性和对抗蛋白水解酶的能力均
比游离脲酶高 。
5 展望
各种载体固定化脲酶的研究已经很多 ,但是每种
载体在脲酶固定化中都存在一些缺点 ,如使用多糖类
物质和膜类物质固定化脲酶时 ,通过官能团之间的化
学反应固定化脲酶 ,酶固定比较牢固 ,不易脱落 ,但是
固定化脲酶的活力收率较低;采用无机吸附剂固定化
脲酶虽能提高脲酶的活力收率 ,但酶容易脱落 ,且吸附
量也有限;采用蚕丝素蛋白作载体 ,价格比较贵。因此 ,
对载体材料进行改进 ,使固定化脲酶的稳定性提高 、使
用寿命延长 、活力增强 、酶活回收率增加 ,是脲酶固定化
研究的一个趋势。在今后的固定化脲酶载体研究和应
用中 ,应运用高新技术对具有适宜生物相容性的天然载
体进行修饰改性 ,研究高分子材料与特定无机材料的复
合材料及合成脲酶固定化智能载体材料等 ,以开发合成
出性能优良的新型脲酶固定化载体材料。
参考文献:
[ 1] 郑迎迎 ,李大力.壳聚糖载体的制备及脲酶的固定化研究[ J] .生
物技术 , 2005 , 15(2):56-59.
[ 2] Chellapan dian M , Krishnan M R V.Chi tosan-poly(g lycidyl meth-
acrylate)copolymer for imm obi lization of u rease[ J] .Process Bio-
chemist ry , 1998 , 33(6):595-600.
[ 3] 梁足培 ,桑明心 ,李建 ,等.戊二醛交联壳聚糖球固定化脲酶的制
备[ J] .青岛科技大学学报 , 2006 , 27(2):123-126.
[ 4] 王巨梅 ,吴文斌.以醋酸纤维素吸水胶囊为载体制备固定化脲酶
[ J] .广州化学 , 1995 , 20(4):21-27.
[ 5] Fahmy A S , Bagos V B, M ohamm ed T M .Imm obi lization of ci t ru l-
lus vulgaris u rease on cyanuric chloride DEAE-cellulose ether:
Preparation and properties[ J] .Biores ou rce Tech nology , 1998 , 64
(6):121-129.
[ 6] 于九皋 ,刘峰 ,于琳.包覆包醛氧淀粉固定脲酶制备及对尿素吸附
[ J] .天津大学学报 , 2003 , 36(2):197-200.
[ 7] Dung N A , H uyen N D , H ang N D , et al.Imm obi lization of ureas e
on graf ted starch by radiat ion method [ J] .Radiat Phys Chem ,
1995 , 46(6):1037-1042.
[ 8] 潘继伦 ,童明容 ,陈长治.聚乙烯醇凝胶固定化脲酶及载体生物相
容性的评价[ J] .功能材料 , 1994 , 25(4):362-365.
[ 9] Rejikumar S , Devi Surekha.Preparation and characterizat ion of u-
rease b ou nd on cross linked poly(vinyl alcohols)[ J] .Journal of
Molecular Catalysis B:Enzymat ic , 1998 , 4(1-2):61-66.
[ 10] Laska J ,Wlodarczyk J , Zaborsk a W.Polyaniline as a su pport for
ureas e immobilizat ion[ J] .Journal of M olecu lar Catalysi s B:En-
zymatic , 1999 , 6(6):549-553.
[ 11] Sarfo K , Petach H H , H enderson W .Polymeric phosp hine oxide
polyeth er-derived copolymer as a support for u rease immobiliza-
ti on[ J] .Enzyme and Microbial Technology , 1995 , 17(9):804-
808.
[ 12] Pozniak G , Krajew sk a B, Trochimczu k W .Urease imm obi lized on
modified polysulfone memb rane:Preparat ion and properties[ J] .
Biomaterials , 1995 , 16(2):129-134.
[ 13] God jevargova T s , Velikova M , Vasileva N , et al.M etallochelate
immobili zation of u rease on to amorphous SiO2[ J] .Process Bio-
chemist ry , 2005 , 40(9):3045-3049.
[ 14] Chaudhari P S , Gokarna A , Ku lkarni M , et al.Porou s sili con as
an ent rap ping mat rix for the imm obi lization of u rease[ J] .Sen-
sors and Actu ators B:Chemical , 2005 , 107(1):258-263.
[ 15] 邵正中 ,方跃 ,邓家祺 ,等.用桑蚕丝素蛋白固定脲酶的研究及脲
酶电极的制备[ J] .化学学报 , 1995 , 53(9):883-888.
[ 16] 董晓毅 ,夏仕文.交联脲酶聚集体的制备和初步应用[ J] .生物工
程学报 , 2003 , 19(3):332-336.
Applications of Different Supports in Immobilization of Urease
YANG Jing-feng , LUO Zhi-gang , LUO Fa-xing , WANG Ming-zhen
(Collegeo f Light Industry and Food Science , South China University o f Technology ,Guangzhou 510640 , China)
Abstract:The urease is w idely applied in fa rming fert ili zer , medicine , envi ronmental pro tection and other
fields.However , it canno t be stored long and reused because the f ree urease is instable and easily becomes inac-
tive in so lutions.Through the immobilizat ion o f urease these disadvantages can be ove rcomed.So far , there has
been many suppor ts applied in the immobilization of urease , such as polysaccharides , po lymer , inorg anic ab-
so rbents and so on .This paper summaries the t rai ts and applica tions of these supports , and prospects their
foreg round and o rienta tion .
Keywords:immobilizat ion ;urease;support
2007, Vol.24 No.1化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering58
基金项目:国家自然科学基金重点项目(30230350), 国家自然科学基金项目(60278014), 广东省自然科学基金项目(36704)
收稿日期:2006-09-28
作者简介:吴峰(1974-), 男 ,湖南会同人 , 硕士研究生 , 研究方向:纳米生物技术;通讯联系人:蔡继业(1944-), 男 ,博士 , 教授 , 博
士生导师 ,主要从事激光化学研究。 E-mail:w ufeng04303@126.com。
基于量子点的荧光共振能量转移的应用
吴 峰1 , 2 , 蔡继业1
(1.暨南大学生命科学学院化学系 ,广东 广州 510632;2.怀化学院化学化工系 ,湖南 怀化 418008)
摘 要:介绍了基于量子点(QDs)的 FRET 原理 ,综述了基于 QDs 的 FRET 在生物传感器 、蛋白质相互作用 、生物
分子构像变化和癌症治疗的光敏剂研究中的应用。
关键词:量子点;荧光共振能量转移(FRET);供体;受体
中图分类号:O 657.3 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0058-04
荧光共振能量转移(FRET)是运用荧光蛋白 、传
统有机染料和其它染料作为探针来研究蛋白构像 、蛋
白相互作用的一种有用的技术 ,能检测到小于纳米的
距离变化。以往的荧光蛋白 、有机染料和镧系染料分
子由于窄的吸收光谱 、带长尾的宽发射光谱和非常低
的光淬灭域限 ,在吸收和发射峰之间不允许存在大的
斯托克斯偏移[ 1 , 2] ,因此 ,只有选择合适 、理想的供体 、
受体分子才能保证高的能量和提供测量参数。半导体
量子点(QDs)由于其可调谐的激发波 、抗漂白性 、同时
连接多个染料分子 、狭窄的激发波长和远离激发峰激发
等优良的光学性质 ,使其成为比有机荧光分子更好的荧
光共振能量转移的供体或受体 。
在近几年 ,基于量子点的FRET 研究得到了广泛的
证实和应用[ 3 ～ 5] ,量子点既可以作为 FRET 供体 ,也可
以作为它的受体[ 6] 。但最近有文献报道量子点作为
FRET 受体几乎看不到能量的转移 ,他们认为主要是因
为量子点长的激活寿命和受体染料分子短暂的激发时
间。作者简单地介绍了基于量子点的 FRET 基本原理 ,
同时综述了基于量子点的 FRET 在生物传感器 、蛋白相
互作用 、分子构像和癌症研究等方面的应用。
1 量子点在 FRET中应用的可行性
基于量子点的 FRET 应用一般是量子点作为供
体 ,但也可以作为受体 ,其原理示意图如图 1所示[ 7] 。
生物连接的量子点用一层多聚物和蛋白包被来钝化 ,
以保持稳定性和荧光的高量子产率。但随着稳定性的
增强 、量子产率的增大 , 粒子的直径也增大了 , 而
FRET 的能量转移发生在偶极-偶极相互作用之中
(对距离的变化非常敏感), 距离的增加就减少了
FRET 的产生 。为了减小偶极-偶极中心之间的距
离 ,研究者采用把蛋白直接连接在量子点上 ,使能量转
移发生在量子点和蛋白质色氨酸残基之间[ 8] ,或者使
量子点连接到一个基因控制的髓磷脂基本蛋白上 ,使
能量转移发生在外层髓磷脂基本蛋白和量子点之
间[ 3] 。当供体-受体距离在几个波长之内时 ,外层受
体分子吸收由量子点发出的非辐射性能量发出一定波
长的荧光 ,而作为供体的量子点能级回落到基态 。
图 1 基于量子点的多个供体-受体对 FRET的应用原理
Fig.1 Scheme of FRET based on quantum dots
在 FRET 中 ,选择合适的供体-受体对能够保证
高效的能量转移率和提供可测量的参数:淬灭的供体
光子发射和增强的受体荧光 。在研究生物受体-配体
之间特定的相互作用 ,或者是蛋白分子受到目标分子
的作用而发生构像改变时 ,合适的光谱交错对于得到
高效的能量转移至关重要 。而且 ,激发线必须与最小
的受体吸收光谱相一致 ,才能减轻由于直接激发受体
吴 峰等:基于量子点的荧光共振能量转移的应用/2007 年第 1 期 59
而产生的影响 。量子点具有优越的光学性质 ,无疑在
某些程度上具备了这些优点 。
两个相距 r的独立分子 D-A 之间的能量转移可
以表示为[ 3] :
E= kD-A
k D-A +τ-1D =
R60
R60 +r6 (1)
其中 kD-A表示独立的两个单分子对之间的能量转
移速率;τD表示供体分子激发状态的时间寿命;R 0表
示能量转移为 50%时供体 、受体之间的距离;r表示量
子点和无机染料中心的距离 。
当多个受体同时靠近量子点供体时 ,公式(1)可以
修改为公式(2)[ 3]来说明它们之间的相互作用。
E= nR60
nR60 +r6 (2)
其中 n表示与供体分子相互作用的受体分子的平
均个数 。
从以上两个公式可以看出 ,供体 、受体之间的能量
转移与 R0和 r之间存在六次方的关系 。Wang 等[ 9] 通
过设计麦芽糖粘附蛋白(MBP)连接到量子点的实验
模型比较了量子点作为 FRET 能量供体具有比传统
染料更好的能量转移效率。通过改变 n值和光谱重叠
的程度 ,证明了量子点的优越性。Wargnier等[ 10] 利用
纳米尺度的自组装合成水溶性的 CdSe-ZnS 量子点 ,
并用合成的量子点作为 FRET 的供体 、受体和纳米金
胶体作为受体分子进行了实验 ,数据与长程能量转移
的理论计算值完全一致 。
2 基于量子点的 FRET的应用
2.1 生物传感器
在生物传感器的设计中 ,信号的调制主要依赖于
粘附于外部生物分子的供体和受体之间的电子传导或
能量传导效率 。
Medintz等[ 3] 提出了麦芽糖粘附蛋白(MBP)的麦
芽糖生物传感器的设计方案。把量子点修饰的 MBP
和染料标记的 β-环糊精(β-CD)作为 FRET 的供体 、受
体对 ,如图 2所示[ 3] 。
图 2 麦芽糖粘附蛋白(MBP)的麦芽糖生物传感器
Fig.2 Maltose biosensor labled with
maltose-binding protein(MBP)
尽管 β-CD连接于 MBP ,但由于天然的麦芽糖配
体的强烈竞争 ,导致了 QD-MBP 和 β-CD染料连接体
的物理性分开。这种分开有效地减少了量子点的淬
灭 ,增强了荧光信号的数量。通过对设计的生物传感
器的检测 ,发现生物连接的量子点可以作为基于识别
的传感器的 FRET 供体。并认为量子点不仅作为有
效的能量供体 ,还相当于生物传感器纳米组装的“脚手
架” 。最近 ,还提供了 QD-蛋白生物连接纳米组装的
FRET 分析 ,证明了通过对这种精确控制来得到高效
和精确的分析[ 11 , 12] 。还利用多个麦芽糖粘附蛋白
(MBP)标记光敏性的 BIPS 来反向调节量子点的发射
光谱 ,调节的效率可以通过改变 BIPS 的数量来进行
控制[ 13] 。因此 ,光敏性开关的装置或生物传感器有望
通过这样的装置来实现 。
Medintz等[ 14] 利用荧光量子点连接抗体片段发展
了溶液相纳米尺度传感器的组装 ,基于 FRET 对液相
环境的 2 , 4 ,6-三硝基甲苯(TN T)进行了特定的检测 。
抗-TNT 特定抗体片段通过金属吸附作用连接到亲水
的量子点上。
2.2 蛋白相互作用
Willard等[ 4] 通过连有 CdSe-ZnS QDs 的血清蛋
白供体和连有链霉清和素的四甲基之间的 FRET 研
究了它们之间特定的相互作用(如图 3所示)。证明不
同蛋白分子之间的粘附作用可以通过量子点供体标记
的蛋白和有机染料标记的蛋白之间的 FRET 观察得
到 ,增强的受体染料分子荧光来源于量子点发射光谱 。
这种方法有望用于抗体-抗原 、DNA 杂化 、酶-基质
相互作用等的类似分析 。
图 3 FRET粘附分析示意图[ 19]
Fig.3 Scheme of the FRET binding assay
Oh 等[ 15] 基于量子点与金纳米粒子之间的
FRET ,研究了生物分子相互作用的抑制性分析 。利
用链霉清和素连接的量子点作为能量的供体 ,生物素
连接的金纳米粒子作为能量的受体 , 构成了一个
FRET 体系。当外源性地加入抗生物素时 ,由于抗生
物素与生物素之间特定的相互作用 ,减少了链霉清和
素连接量子点的荧光淬灭。抗生物素的检测域限达到
吴 峰等:基于量子点的荧光共振能量转移的应用/ 2007 年第 1 期60
10 nmol· L -1 ,动力学检测范围也升到2 mol·L -1 。
随着不同浓度的外源性抗生物素的加入 ,荧光淬灭的
强度也存在着一定的定量关系 ,说明其设计可以作为
生物分子特定性相互作用的高分辨定量分析。
考虑到量子点在水溶液中的分散稳定性 , Nagasa-
ki等[ 16] 在水溶液中利用 CHO-PEG/PAMA 共沉淀方
法制备得到 CdS 量子点 , 即便是在浓度大的盐溶液
中 ,这种方法制备的量子点也保持了很好的稳定性 。
将粘附量子点的 PEG 末梢连接生物素作为配体分子 ,
连有蔷薇花红染料分子的链霉清和素作为受体 ,通过
配体-受体之间特定的相互作用来识别链霉清和素 。
结果证明 ,荧光共振能量转移确实来自连接在 CdS 量
子点上的生物素与连有蔷薇花红染料分子的链霉清和
素之间特定的相互作用 。
2.3 癌症治疗的光敏剂
在光动力学治疗(PDT)中 ,光 、氧气和光敏剂共同
作用以选择性地破坏目标组织。目标性也就是光敏剂
在癌细胞有选择地滞留 、浓缩和激光或紫外光在癌变
组织的直接照射。在氧气的存在下 ,癌变组织同时暴
露在光和光敏剂中才能杀死癌细胞(如图 4所示)。相
对传统的治疗 ,光动力学治疗侵害性更少 ,目标性更
强 ,没有声波治疗的剂量限制 ,因而治疗几乎没有伤
疤 。量子点表面的多样性功能化修饰 ,使之具有良好
的水溶性和生物相容性 ,有利于 PDT 能量在机体中的
传送。自从 Derfus等[ 17] 证明量子点毒性受 UV 照射
调节以来 ,量子点有望用于杀死癌细胞。
图 4 量子点诱发的光动力学治疗的可能机理示意图
Fig.4 Possible mechanisms for induction of
photodynamics by quantum dots
在 PDT 中 ,光敏剂受到光的激活 ,但并不是光敏
剂直接与组织细胞反应来杀死癌变细胞 ,而是通过临
近氧分子从三线态转变为能与细胞产生毒性反应的单
线态氧来杀死癌变细胞 。Samia 等[ 18] 通过 FRET 机
理证明了 CdSe量子点作为 PDT 光敏剂的可能性 ,为
PDT 光敏剂的发展开辟了新的思路 。同时 ,量子点具
有可调节的光学性质 ,有助于浅层和深层次的癌症治
疗 。Bakalova 等[ 19]还研究了在更少毒性量子点的存
在下单线态氧的产生 ,并评价了不同表面包裹技术对
单线态氧量子产率的影响。
Lou 等[ 20] 研究了量子点生物连接癌细胞作为
PDT 传统光敏剂具有的潜在优势 。水溶性的 CdSe 量
子点连接于与白血病有特别作用的抗-CD抗体上 ,标
记的细胞与正常的淋巴细胞混合同时受到有经典光敏
剂存在的紫外光的照射 。结果表明 ,量子点抗-CD 连
接的白血病细胞对紫外光刺激敏感 ,同时增强了经典
光敏剂的效果 。
量子点生物连接体作为 PDT 光敏剂或只是增强
光敏药物的效果都具有很好的应用前景 ,但量子点易
聚集 、释放重金属离子和光学稳定性也是待解决的问
题 。因此 ,人们应更清楚地认识到量子点独特的光学
性质和实际应用之间存在的差距 ,更好地了解量子点
在机体中吸收 、代谢和毒性等机理。
2.4 生物分子构像的研究
由于对距离变化的灵敏性 , FRET 在揭开生物分
子内部活动的研究中显示出独特的优势 。Hohng
等[ 21] 观察了量子点和有机荧光团之间的单分子
FRET ,进一步利用单分子之间的 FRET , 获得了两
对双链 DNA 交叉连接模型(如图 5所示)的单分子
构像变化信息 。链霉清和素包裹的量子点不仅作为
能量转移的供体 ,还充当了连接基底的支架作用 。
虽然量子点和 Cy5 之间的能量转移效率较低 ,但从
高 、低能量转移的两种状态看来 ,证实了交叉连接构
像的改变 。
图 5 量子点和染料 Cy5FRET对的交叉连接动力学探针
Fig.5 Holliday junction dynamics probed via
QS585/ Cy5 FRET pairs
3 结论
与有机荧光分子相比较而言 ,量子点作为荧光能
量共振转移的供体或受体 ,具有许多特别的光学性质 。
首先 ,激发量子点的激发波长范围很宽 ,因此不同大小
的量子点可以由同一个波长的光激发。另外 ,量子点
吴 峰等:基于量子点的荧光共振能量转移的应用/2007 年第 1 期 61
具有较大的斯托克斯位移和狭窄对称的荧光谱峰 ,这
样就允许同时使用不同光谱特征的量子点 ,而发射光
谱不交叠(Overlap),或只有很少交叠 。由于大小不同 、
材料不同的量子点受到光激发后发出一系列不同光谱
的光 ,且发射的荧光强度足以使光学设备检测到单个的
量子点 ,当标记有不同量子点的两个生物分子互相靠
近 ,在这一区域的光谱就会发生变化 ,甚至发生能量转
移 ,就可以及时地观察到整个过程的动态变化。尽管基
于量子点的 FRET 得到了广泛的应用 ,也取得了很大的
成就 ,但还有许多有待改善的地方 ,如量子点的尺寸。
生物素包裹的量子点至少增加了10 nm的直径 ,使其接
近 20 nm左右 ,而荧光能量转移发生的距离应该在几个
波长的范围之内 ,这样就严重降低了能量转移的效率。
因此 ,寻求更小的包裹物将是今后研究的方向 。
参考文献:
[ 1] Lakowicz J R.Principles of Flu orescence Spect roscopy(2nd ed)
[ M] .New York:Kluw er academic , 1999.
[ 2] H ermanson G T.Bioconjugate Techniques[ M] .London:Academic
Press , 1996.
[ 3] M edintz I L , Clapp A R , Mat tou ssi H , et al.Self-assembled
nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors[ J] .
Nat Mater , 2003 , 2(9):630-638.
[ 4] Willard Dale M , Lori L , Cari llo J J , et al.CdSe-ZnS quantum
dots as resonance energy t ransfer donors in a model protein-pro-
t ein bindin g assay[ J] .Nan o Let t , 2001 , 1(9):469-474.
[ 5] T ran P T , Goldm an E R , Anderson G P , et al.U se of lumines-
cent C dSe-ZnS nanocrys tal biocon jugates in quantum dot-b ased
nanosensors[ J] .Physica S tatus Solidi-B , 2002 , 229(1):427-
432.
[ 6] Patolsk y F , Gill R , Weizmann Y , et al.Light ing-up th e dynam-
ics of telomeri zation and DNA replicat ion by CdS e-ZnS quantum
dots[ J] .J Am Chem Soc , 2003 , 125(46):13 918-13 919.
[ 7] Clapp A R , Medintz I L , Fisher B R , et al.Can luminescent
quantum dots be ef ficient energy accep tors wi th organic dye do-
nors[ J] .J Am Chem Soc , 2005 , 127(4):1242-1250.
[ 8] Mamedova N N , Kotov N A , Rogach A L , et al.Albumin-CdTe
nanoparticle bioconjugates:Preparation, st ructure , and interunit en-
ergy t ransfer with antenna effect[ J] .Nano Let t , 2001 , 1(6):281-
286.
[ 9] Wang S P , Mamed ova N , Kotov N A , et al.Ant igen/ ant ibody
immunocomplex f rom CdTe nanoparticle bioconjugates [ J] .J
Nano Let t , 2002 , 2(8):817-822.
[ 10] Wargnier R , Alexandre V , Baranov V G , et al.Energy t ran sfer
in aqu eous s olutions of oppositely charged CdSe/ZnS core/ shell
quantum dots and in quantum dot-nan og old assem blies[ J] .Nano
Let ter , 2004 , 4(3):451-457.
[ 11] Clapp A R , Medintz I L , Mattou ssi H , et al.Fluorescence resonance
energy transfer betw een quantum dot donors and dye-labeled protein
acceptors[ J] .J Am Chem Soc , 2004 , 126(1):301-310.
[ 12] Medintz I L , Konnert J H , Clapp A R , et al.A fluo rescence res-
onance energy t ransfer derived st ructu re of a quantum dot-pro-
t ein biocon jugate nanoassembly[ J] .Proc Nat l Acad S ci U S A ,
2004 , 101(26):9612-9617.
[ 13] Lassm an M , Mat tou ssi H .A hybrid quantum dot-an tib ody f rag-
ment f luorescence resonance energy t ransfer-based T NT sensor
[ J] .J Am Chem Soc , 2005 , 127(18):6744-6751.
[ 14] Medintz I L , Trammell S A , Mat tou ssi H , et al.Reversible
modulat ion of quantum dot photoluminescence u sing a protein-
bound ph otochromic flu ores cen ce res on ance energy transfer ac-
ceptor[ J] .J AM Chem Soc , 2004 , 126(1):30-31.
[ 15] Oh E , Hong M Y , Lee D , et al.In hibit ion assay of biomolecules
based on f luorescence resonan ce energy t ransfer (FRET) be-
tween quantum dots and gold nan opart icles[ J] .J Am Chem Soc ,
2005 , 127(10):3270-3271.
[ 16] Nagasaki Y , Ito T , Sunan aga Y , et al.Novel m olecular recogni-
ti on via f luorescent resonance energy t rans fer u sing a biotin-
PEG/ polyamine s tabiliz ed CdS quantum dot [ J ] .Lan gmuir ,
2004 , 20(15):6396-6400.
[ 17] Derfus A M , Chan W C W , Bhat ia S N.Probing the cytotoxicity of
semiconductor quantum dots[ J] .Nano Letter , 2004, 4(1):11-18.
[ 18] Samia A C , Chen X , Burda C.Semiconductor quantum dots for pho-
todynamic therapy[ J] .J Am Chem Soc , 2003 , 125(51):15 736-
15 737.
[ 19] Bakalova R , Ohba H , Zhelev Z , et al.Quan tum dot ant i-CD
conjugates:A re they potent ial photosensit izers or p otentiators of
clas sical photosen siti zing agen ts in ph otodynamic therapy of
cancer[ J] .Nano Let ter , 2004 , 4(9):1567-1573.
[ 20] Lou Y , Samia A C S , C ow en J , et al.Evaluation of the photoin-
duced elect ron relaxation dynamics of Cu1.8S quantum dots[ J] .
Phys Chem C hem Phys , 2003 , 5(6):1091-1095.
[ 21] H ohng S , Ha T.S ingle-m olecu le quantum-dot f luorescence res-
onance energy t ransfer[ J] .Chem Phys Chem , 2005 , 6(5):956-
960.
Applications of Fluorescence Resonance Energy Transfer Based on Quantum Dots
WU Feng
1 , 2 , CAI Ji-ye1
(1.Department o f Chemistry , I nst itute o f Biosciences , J inan Universi ty , Guangz hou 510632 , China;
2.Department o f Chemistry and Chemical Engineering , Collegeo f Huaihua , Huaihua 418008 ,China)
Abstract:This article introduced the principle of f luo rescence re sonance energy t ransfer(FRET)based on
QDs , and the applications in bio sensor s , interact be tw een pro teins , molecular confo rmational changes and as
pho to sensitize rs in photodynamic the rapy.
Keywords:quantum do t;f luorescence re sonance energy t ransfer(FRET);donor;acceptor
2007, Vol.24 No.1化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering62
收稿日期:2006-10-30
作者简介:王富贵(1983-),男 ,江西余干人 ,助理工程师 , 主要从事给排水/消防方面的工作。 E-mail:litai20000946@sina.com.cn。
一体化复合式生物反应器的脱氮研究
王富贵1 , 蔡 丽2 , 李 晨3
(1.广东工业设备安装公司第三分公司 ,广东 广州 510220;
2.辽宁省大连市城市建设管理局大连市排水设计院 ,辽宁 大连 116021;
3.辽宁省大连市市政设计研究院有限责任公司 ,辽宁 大连 116011)
摘 要:利用自制的一体式缺氧/好氧(A/ O)复合式生物反应器(HBR),对高浓度氨氮废水进行了脱氮研究。结果
表明 ,当进水 COD浓度在 950 ～ 1100 mg· L-1 、氨氮浓度增加到 150 mg· L-1时系统 COD、氨氮去除率开始下降;在好
氧区内检测到大量的 NO -2-N 积累 , 表明 HBR 的脱氮作用部分是通过短程硝化-反硝化途径实现的。且复合式生物反
应器填料内部存在多种多样的微环境类型以及缺氧/好氧内循环 , 造成反应器缺氧 、好氧区都发生了同步硝化-反硝化
反应。
关键词:复合式;缺氧/好氧;脱氮;短程硝化-反硝化;同步硝化-反硝化
中图分类号:X 505 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0062-03
活性污泥法是目前废水生物处理的主要方法 ,由
于其中微生物呈悬浮生长态存在 ,因此受活性污泥沉
降性能 、二沉池分离效果影响甚大 ,运行不够稳定 ,容
积负荷也受到污泥浓度的限制。生物膜法能大幅提高
反应器中微生物的浓度及容积负荷并减轻二沉池的负
荷 ,近年来日益受到人们的关注[ 1 ～ 4] 。
根据复合式生物膜反应器的特点及 A/O 工艺的
基本原理 ,作者设计并制作了利用曝气推动力驱动硝
化液在缺氧/好氧区循环流动的一体化复合式生物反
应器 ,重点研究了其脱氮特性。
1 一体化复合式生物反应器系统
一体化复合式生物反应器系统是 A/O 池和复合
式生物接触反应池的组合 ,由缺氧区 、好氧区 、沉淀区
串联而成(如图 1所示)。
图 1 一体化复合式生物反应器
Fig.1 The experiment equipment of HBR
原水首先进入缺氧池 ,与好氧池回流硝化液混合
并完成微生物反硝化反应 ,将 NO x-N 转化成 N 2 和
N 2O逸出废水 。随后废水进入供氧充足的好氧池连续
曝气 ,其中部分有机物和氨氮在好氧池得到降解 。硝
化液在缺氧/好氧区的循环则利用了压缩空气的推动
力 ,无需外加水泵 ,节约了动力消耗。根据硝化过程优
先的原则 ,当进水氨氮负荷增加时 ,可通过增加曝气量
和减少阻水板面积来提高好氧/缺氧区液体循环量。
实验用水的原水取自化粪池 ,其中氨氮含量较高 、
C/N 值较低。实验时在原水中投加了一定量葡萄糖
以补充实验用水的碳源 ,静置自来水中 1.0 g ·L-1葡
萄糖相当于约1000 mg ·L-1COD ,实验用水水质参数
为:COD 156 ～ 1285 mg · L-1 ,氨氮 150 ～ 220 mg ·
L
-1 , TN 198 ～ 325 mg ·L-1 ,pH 值 7.0 ～ 8.0。
与常规活性污泥法多级生物脱氮工艺相比 ,一体
化生物脱氮反应器结构简单紧凑 、占地面积小;利用曝
气推动力实现硝化液循环 ,不需外加动力设备 ,能耗
低;布置灵活 ,可用于含高浓度氨氮废水的脱氮和现有
污水处理设施的改造。
一体化复合式生物反应器的独特构造使得硝化和
反硝化反应分别在反应器不同分区占优势;同时由于
生物膜内部缺氧微环境的存在 ,不同分区均同时发生
硝化和反硝化反应 。采用生物膜法不仅有利于世代周
期长的硝化菌的生长 ,而且可以使反应器保持较高浓
度的微生物 ,且生物相丰富 ,污泥产率较低 ,剩余污泥
王富贵等:一体化复合式生物反应器的脱氮研究/2007 年第 1 期 63
极少 ,降低了后续污泥处理 、处置的难度。
2 一体化复合式生物反应器脱氮特性
2.1 氨氮容积负荷对脱氮效果的影响
在好氧池水力停留时间 HRT 为 10 h 、进水 pH
值为 7 ～ 8 、水温为 25 ～ 30℃、进水 COD浓度在 950 ～
1100 mg ·L-1范围内时 ,投加氯化铵改变进水氨氮浓
度 ,考察好氧段氨氮容积负荷(kg · m-3 · d-1)为
0.22 、0.35 、0.40 、0.72 时污染物的去除效果 , 结果见
图 2。
图 2 氨氮容积负荷对 COD、氨氮 、TN 去除率的影响
Fig.2 Effect of volumetric load of NH3-N on
removal of COD , NH3-N and TN
从图 2可以看出 ,当容积负荷从 0.22 kg ·m-3 ·
d
-1增加到 0.35 kg ·m -3 ·d-1 , 即进水氨氮浓度从
100 mg ·L-1增加到 150 mg ·L-1时 ,系统去除率随
之增加 。原因可能是由于氨氮容积负荷的增加 ,好氧
段 COD和氨氮的比例减小 ,异氧菌对硝化菌的抑制
作用减小 ,硝化速率提高。由于反硝化过程中碳源充
足 ,硝化反应成为脱氮效率的决定性因素 ,因此反硝化
速率也随之提高 ,使好氧段 COD和氨氮的比例更小 。
但当氨氮容积负荷继续增加时 ,高浓度的氨氮 ,尤
其是游离 NH 3对硝化菌 、反硝化菌均有毒 ,会抑制反
应的进行 ,且浓度越大抑制作用越明显[ 3] 。另外 ,随着
氨氮浓度继续增加 , C/N 值不断降低 ,碳源不足又使
反硝化不充分 ,硝化细菌的代谢产物 NO-3 -N 和 NO-2 -
N 在系统中累积 ,硝化细菌的生长又受到其代谢产物
的抑制 。基质和代谢产物的双重抑制使硝化细菌活性
大大降低 ,NH3-N 去除效果也随之变差 。
2.2 同步硝化-反硝化
2.2.1 悬浮污泥硝化 、反硝化活性
分别在好氧段 、缺氧段中部取出悬浮活性污泥测
定其比硝化速率。比硝化速率的测定方法如下:在恒
温(20 ～ 30℃)条件下 ,配制一定浓度一定体积的碳酸
氢铵溶液 ,注入反应器中 ,然后从生物反应器中取出一
定体积的活性污泥 ,用自来水清洗 3 ～ 6次 。洗掉其表
面吸附的 NH3-N 、NO -2 -N 和 NO -3 -N ,将洗净的污泥
注入反应器中 ,并用砂球曝气。实验开始后 ,测定反应
器中的污泥浓度 ,并通过碳酸钠调节 pH 值 。每间隔
一定时间取一次样 ,并测定所取样品中 NH3-N 、NO-2 -
N 和 NO -3 -N 的浓度 ,然后计算其单位时间内单位质
量污泥将 NH 3-N 转化为 NO -2 -N 和 NO -3 -N 的量 ,即
比硝化速率。
实验结果表明 ,好氧 、缺氧段悬浮污泥的比硝化速
率[ g NH 3-N/(g M LSS ·d)]分别为 0.252 、0.0997。
由此可见 ,好氧 、缺氧段都同时具有硝化活性 ,但存在
一定的差异 ,好氧段悬浮污泥的硝化活性较缺氧段高 。
缺氧段氨氮浓度的降低还可能是因为发生了厌氧氨氧
化 ,即在厌氧条件下 ,以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受
体 ,将氨氮氧化生成氮气。
污泥的反硝化活性采用缺氧环境下硝酸盐氮的比
污泥降解速率来表征 ,即单位时间内单位质量的污泥
能够还原的 NO -3 -N的量。具体做法类似硝化活性的
测定。在实验过程中 ,为了使碳源为反硝化过程的非
限制性因素 ,使 COD/ [ NO-3 -N ] =8。实验结果表明 ,
反硝化速率与基质浓度成零级动力学反应 ,这与悬浮
污泥的反硝化速率动力学结果一致[ 5 , 6] 。好氧 、缺氧
段悬浮污泥的比污泥降解速率[ g NO -3 -N/(g M LSS
·d)]分别为 0.0813 、0.261。
由此得出结论 ,反应器的脱氮过程 ,一方面是基于
不同分区发生硝化反应和反硝化反应 ,相互间通过液
体循环而实现;另一方面由于反应器的混合形态不均
匀 ,或者溶解氧传质受阻 ,在好氧区内形成缺氧和厌氧
微环境 ,同样在缺氧区内也会有微量的 DO 存在而发
生硝化反应;另外 ,好氧反硝化和厌氧氨氧化现象也有
可能存在于该反应器中 。因此在每一个分区内都可能
同时发生硝化反应和反硝化反应 。
2.2.2 附着污泥脱氮特性
从附着污泥的表观特征来看 ,好氧区填料外部污
泥呈黄褐色 ,填料内部污泥略显黑褐色;缺氧区上部填
料外部污泥呈黄褐色 ,中部污泥呈黑褐色 ,下部填料内
部呈黑色。从物理学的角度来看 ,由于氧扩散的受限 ,
生物膜内部将产生溶解氧梯度:生物膜的外表面 DO
浓度较高 ,附着于其上的微生物以好氧菌 、硝化菌为
主;生物膜内部氧扩散受阻 ,同时外部溶解氧大量消
耗 ,产生缺氧区 ,反硝化菌在此区域内占生长优势[ 7] 。
因此在好氧区内形成了好氧 、兼氧微环境 ,可出现同步
硝化和反硝化反应现象 。好氧段硝化液的回流 ,使缺
氧池内溶解氧保持在较低水平 ,其横向和纵向上也均
形成了兼氧 、厌氧微环境 ,相对好氧池缺氧微环境所占
王富贵等:一体化复合式生物反应器的脱氮研究/ 2007 年第 1 期64
比例有所提高 ,促进了反硝化作用。
因此 ,在生物膜内部存在不同活动能力 、呼吸类
型 、营养类型的微生物系统 ,使系统稳定性增强 ,反硝
化反应的发生成为可能 。且投加载体后由于悬浮相污
泥浓度的减小 ,回流至兼性池中的混合液大部分为硝
化液 ,好氧污泥较少 ,保证了反硝化反应的顺利进行 。
2.3 短程硝化-反硝化
短程硝化-反硝化工艺提出将生物膜法和活性污
泥法相结合 ,且不需要污泥搅拌设备[ 8] 。
本系统在运行过程中 , 好氧池内亚硝化率为
64 %,出现了稳定的 NO-2 -N 的积累 ,曝气硝化阶段部
分 NO -2 -N没有被进一步氧化成 NO -3 -N ,好氧池内出
现了亚硝酸盐氮积累 ,发生了短程硝化-反硝化反应 。
原因可能是:(1)由于混合液回流造成好氧段内活性污
泥处于好氧 、缺氧的循环状态 ,且混合液的回流引起部
分回流液水力停留时间缩短 ,使得氨氮的硝化反应不
完全;(2)好氧段有机物浓度较高 ,由于对溶解氧的竞
争 ,使硝化反应溶解氧不足 ,有研究报道[ 9] ,氨氧化菌
对 DO 的竞争力强于亚硝酸氧化菌;(3)由于填料的存
在 、充氧装置的充氧不均和反应器的构造原因 ,造成反
应器内部分混合液充氧不足 ,导致 NO -2 -N 的积累;
(4)由于反应过程中 NH3-N 浓度较高 ,使生化细菌处
于休克状态以及活性降低[ 10] 。硝酸菌比亚硝酸菌更
容易受到抑制 ,而且也容易受到 NO -2 -N浓度的影响 。
3 结论
对自制一体化复合式生物反应器脱氮特性研究表
明 ,当进水 COD浓度在 950 ～ 1100 mg · L-1 、氨氮浓
度增加到 150 mg · L-1时 ,系统 COD 、氨氮去除率开
始下降 。
复合式生物反应器缺氧 、好氧区中都发生了同
步硝化 -反硝化反应 。在好氧池内亚硝化率为
64%,出现了稳定的 NO -2 -N 的积累 , 表明复合式生
物反应器的脱氮过程部分是通过短程硝化-反硝化
实现的。
参考文献:
[ 1] 王建龙 , 吴立波 , 钱易.复合生物反应器处理废水特性的研究
[ J] .中国给水排水 , 1998 , 14(2):29-32.
[ 2] Wanner J , Kucman K , Grau P.Activated sludge process combin ed
wi th bio-f ilm cul tivat ion[ J] .Wat Res , 1998 , 22(2):207-215.
[ 3] Fadi Gebara.Activated s ludge bio-fi lm w as te w ater t reatm ent
sys tem[ J] .Wat Res , 1998 , 33(1):230-238.
[ 4] 张宝杰 ,王宝贞 ,韩洪军 ,等.复合式生物处理系统效能与机理研
究[ J].哈尔滨建筑大学学报 , 1999 , 32(6):100-103.
[ 5] 娄金生 , 谢水波 , 何少年.生物脱氮除磷原理与应用[ M].长沙:
国防科技大学出版社, 2002:75-76.
[ 6] 徐亚同.不同碳源对生物反硝化的影响[ J].环境科学 , 1993 , 15
(2):29-32.
[ 7] 康媞 , 林铁.溶解氧对硝化反硝化反应的影响[ J].贵州环保科
技 , 2003 , 9(3):13-17.
[ 8] Liu J X , Van Groenest ijn J W , Doddema H J , et al.Removal of ni-
t rogen and phosph orus u sing a new biof lim-activated-slu dge sys-
tem[ J] .Wat S ci Tech , 1996 , 34(1):315-322.
[ 9] Nicolas Bernet , Peng Dangcong , Delgenes Jean-Phi lippe , et al.Ni-
t ri ficat ion at low oxygen concent rat ion in biofi lm reactor[ J].En-
vi ron E ng , 2001 , 127(3):266-271.
[ 10] Richard O , Mines J.Biological t reatm ent of a high st rength ni-
t rogenou s w astew ater[ J].Environ Sci Heal th , 1997 , A32(5):
1353-1375.
Study on Nitrogen Removal by Integrative Hybrid Bioreactor
WANG Fu-gui1 , CAI Li2 , LI Chen3
(1.The Third S ubsid iary Company o f Guangdong Industrial Equipment Installs
Company ,Guangzhou 510220 , China ;2.Liaoning Dal ian Draining Water Design Insti tute
of Urban Construct ion Administrative Bureau , Dalian 116021 , China;
3.Liaoning Dal ian Municipal Design &Research Inst itute Co .Ltd ., Dalian 116011 , China)
Abstract:Continuous t reatment of high-loaded ammonia nit rogen w astew ater w as car ried out by a self-made
integ rative anoxic/oxic hybrid bio reacto r.T he results show ed that w hen the influent COD concentration w as in
the range of 950 ～ 1100 mg ·L-1 , the removal decreased as ammonia ni t ro gen concentration w as above 150 mg
·L-1.Much nit ri te could be found in the oxic section , thus the removal o f nit rogen by hybrid bioreacto r w as
achieved part ly through shor t-cut nit ri ficat ion-denit rif icat ion.And the biolo gical envi ronment of carrier in hy-
brid biolog ical reacto r w as various and the characteristic of anoxic/oxic sect ion harmonized w ith each other by
ci rculation , accordingly conduced to the phenomenon of simul taneous nit rification-denit rification in both anox ic
and oxic section.
Keywords:hybrid;anoxic/oxic;nit rogen removal;sho rt-cut nit rif icat ion-deni t rif ication;simul taneous ni-
t rification-denit rification
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 Chemistry &Bioengineering 65
收稿日期:2006-10-18
作者简介:边艳勇(1981-),男 ,湖北人 ,硕士研究生 , 主要从事木质素的萃取研究。 E-mail:st.byy@126.com。
微波辅助乙醇 —水体系萃取木质素的研究
边艳勇1 , 2 , 张瑞红1 , 2 , 孙可伟1
(1.昆明理工大学固体废弃资源化国家工程研究中心 ,云南 昆明 650093 ;
2 .昆明理工大学环境科学与工程学院 ,云南 昆明 650093)
摘 要:研究了用微波法提取木质素的工艺条件 ,探讨了微波功率 、处理时间、乙醇体积分数、液固比 、催化剂投加量对木
质素产率的影响。结果表明,在微波功率为 850 W、微波处理时间为30 s、乙醇体积分数为 50%、液固体比为 8∶1、催化剂投加
量为6%的条件下蒸煮1 h ,木质素的产率为 51.92%,比未经微波处理的高出 23.35%。表明微波法是一种提取木质素的有效
方法。
关键词:微波;乙醇;木质素;萃取
中图分类号:O 636.2 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0065-03
木质素是一类具有复杂空间网状结构的聚芳基化
合物 ,其化学结构由苯丙烷类结构单元组成 ,含有多种
活性官能团[ 1] 。木质素具有较高的利用价值 ,优质的
木质素已被广泛地应用于印染工业和橡胶工业中。但
是由于木质素结构复杂 、物理化学性质不均一 、分离提
取困难及易缩合等 ,使其至今没有被很好地利用 。木
质素一般作为木材水解工业和造纸工业的副产物 ,如
果得不到充分利用 ,反而会严重地污染环境 。
木质素的提取方法主要有酸沉淀法 、碱析法 、絮凝
沉淀法 、超滤法 、有机溶剂法等[ 2] ,其中有机溶剂法较
为优越 。但该法存在的缺陷是所需温度和压力较高 ,
致使成本太高 ,经济性不理想[ 3 ～ 5] 。
作者在常压下以乙醇为萃取剂采用微波辅助法萃
取木质素 ,并研究了优化的提取工艺条件。
1 实验
1.1 原料 、试剂和仪器
松木 ,云南产 。无水乙醇 ,分析纯 ,广东汕头西陇
化工厂;氯化镁 ,分析纯 ,天津市化学试剂三厂。
家用微波炉 ,海尔;TG328A 型分析天平 ,上海天
平仪器厂;TED型温控仪 ,上海仪川仪表厂。
1.2 方法
称取一定量的松木粉末 ,置入微波炉中 ,选择一定
功率进行辐射加热 ,然后取出 ,加入催化剂氯化镁及乙
醇水溶液 ,置于电炉上加热回流1 h ,过滤 ,所得滤液在
80 ℃蒸馏 ,木质素逐渐析出 ,再过滤 ,得到高纯木质素 。
2 结果与讨论
2.1 提取条件的优化
2.1.1 微波功率的选择
在微波处理时间为 30 s、乙醇体积分数为 50%、液
固比为 8∶1 、催化剂投加量为 6%的条件下蒸煮1 h ,考
察微波功率对木质素提取率的影响 ,结果见图 1。
图 1 微波功率对木质素产率的影响
Fig.1 The effect of microwave power on lignin yield
由图 1可知 ,木质素的产率随着微波功率增大而
增大 ,在 850 W(所用微波炉最大功率)时达到最大值 。
因此选择微波功率为 850 W 。
2.1.2 微波处理时间的选择
其它条件不变 ,考察微波处理时间对木质素提取
率的影响 ,结果见图 2。
由图 2可知 ,处理时间为 30 s时 ,木质素产率最
大 。其后随着时间的延长 ,木质素的产率逐步下降 ,这
可能是由于微波处理时间过长破坏了原料内部某些物
边艳勇等:微波辅助乙醇—水体系萃取木质素的研究/ 2007 年第 1 期66
图 2 微波处理时间对木质素产率的影响
Fig.2 The effect of treatment time on lignin yield
质的结构。因此 ,选择微波处理时间为30 s。
2.1.3 乙醇体积分数的选择
其它条件不变 ,考察乙醇体积分数对木质素提取
率的影响 ,结果见图 3。
图 3 乙醇体积分数对木质素产率的影响
Fig.3 The ef fect of volume fraction of ethanol on lignin yield
由图 3可知 ,木质素的产率随乙醇体积分数的增
大而增大 ,但趋势逐渐减缓 ,从节约溶剂的角度出发 ,
选择乙醇体积分数为 50%。
2.1.4 液固比的选择
其它条件不变 ,考察液固比对木质素产率的影响 ,
结果见图 4。
图 4 液固比对木质素产率的影响
Fig.4 The effect of ratio of solution to material on lignin yield
由图 4可知 ,三种不同液固比的木质素产率相差
并不大 ,但 8∶1时最佳 。因此 ,选择液固比为 8∶1。
2.1.5 催化剂投加量的选择
其它条件不变 ,考察催化剂氯化镁投加量(质量百
分数)对木质素产率的影响 ,结果见图 5 。
图 5 催化剂投加量对木质素产率的影响
Fig.5 The effect of catalyst amount on lignin yield
由图 5可知 ,催化剂投加量为 6%时 ,木质素产率
最高。因此 ,选择催化剂投加量为 6%。
2.2 方法比较
在乙醇体积分数为 50%、液固比为 8∶1 、催化剂
投加量为 6%的条件下蒸煮1 h时 ,比较功率为 850 W
的微波处理 30 s与无微波处理时的木质素产率 ,结果
见表 1。
表 1 不同方法木质素产率的比较
Tab.1 Comparison of lignin yields by different methods
提取方法 850 W微波处理 30 s 无微波处理
产率/ % 51.92 28.57
由表 1可知 ,经微波处理后 ,木质素产率较无微波
处理时大幅提高 , 在本实验条件下 , 产率提高
23.35%。
2.3 木质素的红外光谱分析(图 6 ,表 2)
图 6 木质素的红外光谱
Fig.6 IR spectrum of obtained lignin
由图 6可见 , 1330 ～ 1325 cm-1(紫丁香环的 C -
O伸展振动)、1125 cm-1(紫丁香环振动)、1270 cm-1
(愈创木基 C-O 伸展振动)处有吸收峰 ,表明乙醇萃
取木质素含有愈创木基和紫丁香基结构。
边艳勇等:微波辅助乙醇—水体系萃取木质素的研究/2007 年第 1 期 67
表 2 所得木质素的红外光谱解析
Tab.2 Analysis of IR of obtained lignin
波数/ cm-1 吸收峰归属
3425 羟基(-OH)伸展振动
2920 -CH3 , -CH2 , -CH 伸展振动
1715～ 1710 醛 、酮的羰基 、酯基的伸展振动
1605～ 1595 芳香环骨架振动(C=C伸展振动)
1510～ 1505 芳香环骨架振动(C=C伸展振动)
1470～ 1460 C -C 弯曲振动
1430～ 1425 芳香环 C-H 平面变形振动
1330～ 1325 紫丁香环 C-O 伸展振动
1270 愈创木基型苯环甲氧基 C-O 伸展振动
1125 紫丁香环苯环 C-H 伸展振动
1085 伯醇、醚 C-H 弯曲振动
834 芳香环 C-H 弯曲振动
由表 2可见 ,所得木质素仍是由苯及其衍生物构
成的大分子。
3 结论
采用微波法提取木质素最佳提取条件为:微波功
率为 850 W 、微波处理时间为 30 s 、乙醇体积分数为
50 %、液固比为 8∶1 、催化剂投加量为 6%的条件下蒸
煮1 h ,所得木质素产率为 51.92%,较未经微波处理
的高出 23.35%。表明微波法是一种提取木质素的有
效方法 。
参考文献:
[ 1] 蒋挺大.木质素[ M] .化学工业出版社 , 2001.
[ 2] 张桂梅 ,廖双泉 ,蔺海兰 ,等.木质素的提取方法及综合利用进展
[ J] .热带农业科学 , 2005 , 25(1):66-70.
[ 3] 李万利 ,罗学刚.芦苇乙醇法分离木素制浆研究[ J] .中华纸业 ,
2005 , 26(1):30-33.
[ 4] 李翠珍.乙醇制浆法[ J] .纸和造纸 , 2000 , 19(6):60-61.
[ 5] 胡庆国.微波法提取桑叶黄酮工艺条件的研究[ J] .淮北煤师院学
报 , 2003 , 24(2):32-34.
Study on the Microwave-Assisted Ethanol-Water Extracting Technology of Lignin
BIAN Yan-yong1 , 2 , ZHANG Rui-hong1 , 2 ,SUN Ke-wei1
(1.N ational Engineering Research Center of Sol id Waste Resource Recovery ,K unming Universi ty o f
Science and Technolog y ,K unming 650093 ,China;2 .Inst i tuteo f Env ironmental Sciences and
Engineering ,K unming Universi ty o f Science and Technology ,K unming 650093 ,China)
Abstract:This paper studied the ext racting technology of lignin by microwave.The effects of the operating condi-
tioins on the lignin yield w ere analyzed.The results showed that the lignin yield raised 23.35%under the optimal tech-
nological condition than that of non-microwave.The optimal ext raction conditions w ere concluded as follows:microw ave
power 850 W , treatment time 30 s , volume fraction of ethanol 50%, ratio of solution to material 8∶1 , catalyst amount
6% and heated for 1 hour.Therefo re , ex tracting lignin by microw ave was proved to be an efficient method.
Keywords:microwave;ethanol;lig nin ;ex t raction
(上接第 54页)
[ 2] Deny s N Wheat ley.Arginine deprivat ion and m etabolomics :Im-
po rtant aspects of intermediary metabolism in relat ion to the dif-
f erent ial sensit ivi ty of normal and tumou r cells[ J] .S emin ars in
Cancer Biology , 2005 , 15(4):247-253.
[ 3] Ik emoto M , Tab ata M , Miyake T , et al.Exp ression of human
liver arginase in Escherichia co li. purif ication and propert ies of
th e product[ J].Biochem J , 1990 , 270(3):697-703.
[ 4] 李大力 ,郑迎迎.人 I 型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达[ J] .
化学与生物工程 , 2006 , 23(4):41-42.
[ 5] Katherine A Borkovich , Weiss Richard L.Pu ri ficat ion and char-
acteri zation of arginase f rom Neurospora crassa[ J] .T he Journal
of Biological Ch emis t ry , 1987 , 262(15):7081-7086.
Cloning of Human ArginaseⅠ Gene and Its Expression in Escherichia Coli .
YANG Cheng-l i , ZHENG Ying-ying , KE Qian-jin , LI Da-li
(Department of B ioengineering , School o f Chemical E ng ineering , Nanj ing University o f
Science and Technology , Nanj ing 210094 , China)
Abstract:Human arginase Ⅰ gene (hA Ⅰ)was amplif ied by PCR.The gene w as inserted into pET30a vec-
tor to const ruct a recombinant plasmid pET30a-hA Ⅰ.Then pET30a-h A Ⅰ was t ransformed into E.coli BL21
(DE3)to const ruct recombinant E.coli st rain BL21(DE3)(pET30a-h A Ⅰ).The recombinant st rain w as in-
duced by IPTG. The BL21(DE3)(pET30a-hA Ⅰ) show ed enzyme activity o f 34.6 U per g ram cel ls(wet
w eight).SDS-PAGE showed that the molecular w eight of the protein expressed was about 35 kD .
Keywords:human arginase I gene;clone;Escherichia coli .;expression
2007, Vol.24 No.1化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering68
收稿日期:2006-11-14
作者简介:李向前(1975-),男 ,河南洛阳人 ,博士研究生 , 环境生物工程专业;通讯联系人:佘跃惠(1965-), 男 , 研究员 , 从事微生
物采油等方面的研究。电话:010-62552493 , E-mail:bjbio s@126.com。
微生物强化水驱在高矿化度油藏的应用
李向前1 , 佘跃惠2 , 张忠智1
(1.中国石油大学 ,北京 102249;2 .长江大学 ,湖北 荆州 434023)
摘 要:青海花土沟油田矿化度很高 ,容易导致外源采油微生物适应性下降。长江大学 MEOR实验室通过对其油
藏本身存在的微生物进行富集 、筛选 、分离得到 3株芽孢菌 , 性能评价表明适合作为该油藏的采油菌。室内岩心物理模
拟实验表明:该采油菌可比单纯水驱提高采收率 10%以上 , 并对该油田 2 口注水井进行了微生物强化水驱的现场试验。
在不到一年的时间内 , 其关联油井增产 3000 多 t。
关键词:本源微生物采油;高矿化度油藏;室内研究;矿场试验
中图分类号:TE 357.9 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0068-03
微生物提高石油采收率(MEOR)技术因其成本
低 、适用范围广 ,成为开采低产油田的经济有效手段 ,
近 20年来 ,大港 、胜利 、吉林等油田分别进行了外源微
生物的室内研究和矿场试验 ,取得了一定的效果 。微
生物强化水驱是指将地面发酵的微生物菌液和营养液
注入油层 ,利用其在油水界面区的繁殖作用产生的代
谢产物提高原油采收率的方法。广义地讲 ,MEOR的
基本方法包括两类:一类是地面发酵法(地面法),一类
是微生物地下发酵法(油层法)[ 1 ～ 3] 。
青海花土沟油田已注水开发多年 ,属异常低压低
温油藏(21.17 ～ 38.83 ℃)。油藏地层中存在钻井及注
水过程中带入地层的细菌 ,它们在地层中已慢慢适应
其油藏生态环境 ,和古细菌一起成为本源菌 。此外 ,花
土沟油田渗透性好 、连通率高 、原油含蜡量高 、油层温
度适中 ,适合微生物强化水驱 。但由于其地层产出水
矿化度偏高 ,有的甚至高达 0.2 ,给利用外源微生物驱
带来很大困难 ,因此作者将地面发酵法和地下发酵法
结合起来 ,从油藏本身环境中分离耐高矿化度的本源
菌 ,并进行了室内研究和矿场先导试验 ,获得了较好效
果 。
1 室内研究
1.1 菌株筛选
1.1.1 本源区系调查
分别对 42口油井产出水的样品进行了烃降解菌 、
腐生菌 、铁细菌 、硫酸盐还原菌的数量统计(MPN
法)[ 1] ,结果见表 1。
表 1 部分油井的本源菌统计/个·mL-1
Tab.1 The enumeration of the partial indigenous microbes
井号 烃降解菌 腐生菌 铁细菌 硫酸盐还原菌
N332(X) 104 105 102 103
N241(X) 104 107 102 102
N132(X) 103 106 102 102
N122(X) 103 107 102 102
1.1.2 菌株富集 、分离 、纯化
选择烃降解菌数量高的油水井样品进行多次富
集 、驯化 、分离 ,最终得到 3株纯菌 L1 、L2 、L3。
1.2 菌株生理特性及菌种鉴定[ 4 , 5]
分别用传统生物学方法和 16sRNA 分子生物学
方法对 3株菌进行了鉴定。初步鉴定结果表明 3株菌
均为芽孢杆菌属 ,分子生物学鉴定正在进一步研究中 。
1.2.1 菌种形态学描述
3株菌在平板上培养 16 ～ 24 h后 ,单菌落均为白
色 、圆形 、隆起 、四周光滑 、细胞表面湿润 、细菌周生鞭
毛 、细胞产芽孢 、芽孢端生膨大 ,革兰氏染色为阳性。
1.2.2 生长曲线
分别取 3株菌斜面经过活化后 ,接入摇瓶。所用
营养基为灭菌的花土沟油层产出水加入定量的激活
剂 ,在 38℃(接近原始油层温度)进行水浴摇床培养 。
每 2 ～ 4 h取样一次 ,用分光光度计进行吸光度测定 ,
绘制生长曲线 。结果表明:所获菌株在营养合适条件
李向前等:微生物强化水驱在高矿化度油藏的应用/2007 年第 1 期 69
下 16 ～ 18 h就可以达到最大生物量(图 1)。
图 1 L1 、L2、L3 的生长曲线
Fig.1 Growth curves of strain L1 , L2 , L3
1.3 性能评价
1.3.1 表面张力(表 2)及 pH 值变化
培养 3 d后的发酵液离心除去菌体。在室温下用
毛细管表面张力仪测定发酵液上清液的表面张力 ,同
时测定 pH 值 。结果表明:作用后发酵液表面张力与
发酵前相比下降很多 , 特别是 L2 菌株 , 降低率达
40 %。pH 值则由最初的 7下降到 3 ～ 4左右 ,表明有
机酸的生成 ,经碱滴定法测定有机酸含量为 0.21%～
0.31%。
表 2 表面张力测试结果
Tab.2 Results of the surface tension test
菌株 作用前表面张力
mN ·m-1
作用后表面张力
mN ·m-1
降低率
%
L1 48.3 31.4 35
L2 44.6 26.8 40
L3 46.5 33.4 28
注:油样为花土沟原油 ,培养温度 35℃
1.3.2 乳化性能
取 3株菌的发酵液进行离心 ,取上清液 ,分别与液
体石蜡和柴油等体积混合 ,可以看出对液蜡乳化效果
非常好(图 2a),乳化程度达到 60%～ 95 %。原因可能
是筛选和分离菌株过程中常利用液蜡作为其碳源 。
L2则对柴油有较好的乳化性(图 2b)。
1.3.3 微生物作用前后色谱分析
色谱条件如下:原油在 80℃恒温 18 min ,以 3℃·
min
-1的速度升到 310℃ ,恒温 18 min;气化室和检测
器温度为320℃;尾吹:60 mL·min-1 ;载气为氮气 ,线
速度12 cm · s-1 ;燃气为氢气 ,流量40 mL · min-1 。
根据色谱峰面积 , 折算成不同碳数的百分比(图 3)。
结果表明:L1作用后 , C16 ～ C22短链烃增加;L2 对 C22
～ C28的长链烃分解能力很强 ,而 L3对 C14 ～ C22的烃
类分解能力较强。3株菌在对烃类物质代谢上存在明
图 2 乳化性能测试
Fig.2 Pictures of mixture of strain L1 and L2 , respectively
显互补性 ,这将有助于提高采收率。
图 3 微生物作用前后饱和烃组分变化
Fig.3 The contents of saturated hydrocarbon before and
after the degradation of microbes
1.3.4 岩心模拟驱替试验
模拟花土沟油藏 ,温度为 38℃,注入水为其注水
站所用注水 ,油为该油田原油(经脱水处理)。岩心为
非均质人造岩心 ,水相渗透率范围 0.50 ～ 0.90 μm 2 ,
岩心水驱速度为 0.4 mL ·min-1 。接种量为 5%,注
菌液时机为平均综合含水 70%左右;菌液体积为 1.0
PV ;以水驱油岩心实验采收率为空白对比值 ,计算本
源微生物驱油提高采收率值 ,结果见图 4。
图 4 微生物强化水驱和单纯水驱采收率对比
Fig.4 The comparison of recovery of MEOR with water flooding
由图 4可见 , L2 、L3与单纯的水驱相比可提高采
收率 10%～ 15 %。
李向前等:微生物强化水驱在高矿化度油藏的应用/ 2007 年第 1 期70
2 中试放大以及现场应用
由于所获得的 3株纯菌存在互补关系 ,因此分别
进行中试发酵 ,所用碳源为重蜡油 ,按照 50 L ※500 L
※10 m3 逐级放大 ,最后存储于灭菌的包装桶内 。
根据微生物本源区系调查结果以及微生物提高采
收率的相关选井标准[ 1] ,确定在青海花土沟油田的
N332X 、N 122X和 N132X进行矿场先导试验 。
2.1 现场施工工艺
2005年 9月份 ,用泵车 、罐车以及压风车将无机
营养物和空气同时通过注水井注入地层 ,注入方式为:
油管注入。关井 3天 ,促使油水界面区域的好氧微生
物大量繁殖 ,产生大量表面活性剂以及有机酸和气体 。
施工 4个月后再施工一次 ,以补充营养物质 。
2.2 现场跟踪检测效果
图 5 部分相关油井增油效果
Fig.5 The enhanced product ion of some relat ive oil wells
现场施工结束后 ,每个月从油水井采集样品 ,进行
细菌计数(MPN 法)和代谢产物分析 。结果表明多数
连通性好油井的细菌浓度都有所升高 ,尤其是 N132X
井和 N332X井 ,烃降解菌的数量都有 2到 4个数量级
的增加 。此外 ,其产油量也明显增加(图 5)。从增油
效果来看(以施工前 3个月的相关油井平均产量为基
数),进行矿场试验不到一年时间内 ,与 2口注水井关
联的油井共增产3200多 t ,如果考虑产量递减因素 ,则
增油量更大。如果每 t原油按 1000元计算 ,创造经济
价值 300多万元。
3 结论
(1)现场所用菌种都是芽孢杆菌 ,该类细菌来源于
油藏本身 ,环境不利时产生芽孢休眠体 ,对高矿化度环
境有很强的适应性 ,可以耐受油藏较高的矿化度 。
(2)该本源采油菌可以将原油中长链烃降解成短
链烃 ,并产生有机酸 ,一方面可以对油藏岩石产生弱酸
化作用 ,提高其渗流性能 ,另一方面又为激活本源的厌
氧细菌提供底物。由于产生表面活性物质 ,降低了界
面张力 ,改变了润湿性 ,从而提高了注入水的洗油能
力 。
(3)经过工业级的发酵可将该芽孢菌群制成每毫
升不低于 3×108个细菌的微生物制剂 。可进行长期
保存和运输。
(4)室内研究表明该本源菌群可提高采收率 10 %
以上 ,矿场试验的成功也证明该项技术广泛的应用前
景 ,为我国注水开发后期的油田提供了一项物美价廉
的新技术。
参考文献:
[ 1] 易绍金 ,佘跃惠.石油与环境微生物技术[ M].北京:中国地质大
学出版社 , 2002:220-221.
[ 2] 唐纳森 E C ,等著.金静芷 ,王修恒 ,等译.微生物提高石油采收率
[ M] .北京:石油工业出版社, 1995:10-17.
[ 3] 李虞庚 ,冯世功编译.石油微生物学[ M].上海:上海交通大学出
版社 , 1991:364-435.
[ 4] 张军竹 ,张心平,梁风来 ,等.一株地衣芽孢杆菌产生的生物表面
活性剂[ J] .南开大学学报(自然科学版), 2000 , 33(4):41-44.
[ 5] 乐建君 ,陈星宏.提高原油采收率试验菌的筛选和评价方法[ J].
油田化学 , 1996, 13 (2):157-161.
Application of MEOR in High Salinity Reservoir
LI Xiang-qian1 , SHE Yue-hui2 , ZHANG Zhong-zhi1
(1.China Universi ty o f Petroleum , Bei j ing 102249 , China ;2.Yangtze University , J ingzhou 434023 ,China )
Abstract:As far as Qinghai Oil Field is concerned it is very di fficult for ex si tu MEOR because of it s high
salinity .MEOR laboratory of Yang tze Unive rsity has obtained 3 Baci llus capable of adapting the environment
of Qinghai Oil Field by cul turing , screening , iso lating f rom the oi l f ield it self , and perfo rmance evaluation proves
the microbes are fi t fo r M EOR of the oil field .A n experimental study on ar tificial core f looding indicates that
the recove ry increases by more than 10% than w ater f looding , the pilo t t rials of MEOR have been made w ith
tw o flo oding w ells in Qinghai Oil F ield .In no more than one year , the oil recovery of the wells related to the tw o
f looding w ells have increased over 3000 ton.
Keywords:in si tu MEOR;high salinity ;laboratory research ;pi lot t rial
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 分析测试 Chemistry &Bioengineering 71
收稿日期:2006-09-13
作者简介:李蕾(1972-), 女 ,湖北武汉人 ,工程师 , 主要从事化工分析。
高效液相色谱法同时测定邻氯苯甲醛和苄叉丙酮的含量
李 蕾 , 陈文利
(武汉工程大学分析测试中心 ,湖北 武汉 430073)
摘 要:建立了高效液相色谱同时测定邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮含量的方法。采用 C18(250 mm ×4 mm , 5 μm)色谱
柱 , 以甲醇-水(90∶10 ,体积比)溶液为流动相 , 流速 1.0 m L·min -1 , 室温 , UV 220 nm 的色谱系统。样品中邻氯苯甲
醛的平均回收率为 98.7%、苄叉丙酮的平均回收率为100.1%,其 RSD(n=5)分别为 0.83%、0.87%, 邻氯苯甲醛的线性
范围为 1 ～ 200μg ·mL-1(R=0.9993)、苄叉丙酮的线性范围为 1 ～ 200μg ·mL-1(R =0.9998)。建立的方法用于电镀
添加剂中邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮含量的测定 ,结果准确 , 操作简便 、快速。
关键词:高效液相色谱;邻氯苯甲醛;苄叉丙酮
中图分类号:R 284 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0071-03
邻氯苯甲醛(2-Chlo robenzaldehyde),熔点 11 ～
12 ℃,沸点 213 ～ 214 ℃, 分子式 C7H5ClO , 分子量
140.57 ,无色或浅黄色油状液体 ,有强烈的醛味;苄叉
丙酮(Benzalacetone),熔点 41.5℃,沸点 260 ～ 262℃,
分子式C10H10O ,分子量 146 ,白色或淡黄色结晶 ,具有
香豆素味 ,遇光后其色泽逐渐加深 ,长时间受热易分
解 。邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮均微溶于水 ,可溶于苯 、乙
醇 、氯仿等有机溶剂 ,是重要的有机合成原料及电镀添
加剂。
邻氯苯甲醛分析方法主要有羟胺法 、亚硫酸氢钠
法 、光度法 、电位滴定法 、过氧化氢酸碱滴定法等[ 1] 。
羟胺法操作繁杂 ,终点颜色变化不敏锐 ,测定结果误差
较大;光度法受试样颜色的干扰很大;电位滴定法操作
简单 ,但被测溶液的 pH 值要严格控制;亚硫酸氢钠法
方法准确 ,重现性好 ,但终点不易掌握;过氧化氢酸碱
滴定法操作简单 ,终点易于掌握 ,但方法准确性欠佳;
另外 ,还有气相色谱分析法等。
苄叉丙酮难以用通常的化学分析法测定 ,因而商
品苄叉丙酮的含量常用熔点范围来表示。文献[ 2 ～ 4]
提出用氯化溴的加成反应测定苄叉丙酮含量的方法 ,
及采用紫外分光光度法和通过显色反应采用分光光度
法对镀液中苄叉丙酮的含量进行测定等。
以上测定方法各有缺点 。因此 ,寻找一种能快速 、
准确测定邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮及其混合物含量的方
法 ,对工业生产有重要实际意义 。作者采用高效液相
色谱法 ,建立了同时测定邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮含量的
方法。经实际样品测定 ,获得了令人满意的结果 。
1 实验
1.1 试剂和仪器
甲醇为色谱纯 ,邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮均为分析纯
(含量≥99%),水为二次蒸馏水;样品为电镀添加剂 。
德国诺尔高效液相色谱仪 , Smartline-2500型紫
外分光检测器 , C18色谱柱(250 mm ×4 mm , 5 μm),
HP8452A 紫外扫描仪 。
1.2 波长选择
以甲醇为参比液 ,分别将100 μg ·mL-1的邻氯苯
甲醛 、100 μg ·mL-1的苄叉丙酮的甲醇溶液及其混合
甲醇溶液 ,在 200 ～ 400 nm 进行紫外扫描 ,以确定紫
外吸收波长。
1.3 色谱条件
流动相为甲醇-水(90 ∶10 ,体积比)溶液 ,流速为
1.0 mL·min-1 ,检测波长为 220 nm ,柱温为室温 ,进
样量10 μL 。
1.4 对照品溶液
精密称取干燥至恒重的邻氯苯甲醛和苄叉丙酮各
20 mg ,置于 100 mL 容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至
刻度 ,得贮备液。准确移取该溶液 5 mL 于 50 mL 容
量瓶中 ,用流动相稀释至刻度 ,作为对照品稀溶液。
1.5 样品溶液
精密移取样品电镀添加剂 25 mL ,置于50 mL容
量瓶中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 。准确移取该溶液
5 mL于10 mL容量瓶中 ,加流动相稀释至刻度 ,作为
供试品溶液。
李 蕾等:高效液相色谱法同时测定邻氯苯甲醛和苄叉丙酮的含量/ 2007 年第 1 期72
2 结果与讨论
2.1 紫外波长的确定
分别对邻氯苯甲醛和苄叉丙酮进行扫描 ,发现邻
氯苯甲醛在 220 nm 、248 nm 处 ,苄叉丙酮在206 nm 、
220 nm 、284 nm 处有紫外吸收;然后对邻氯苯甲醛和
苄叉丙酮的混合甲醇溶液进行紫外扫描 ,结果见图 1。
图1 邻氯苯甲醛和苄叉丙酮的混合甲醇溶液紫外吸收光谱
Fig.1 Ultraviolet spectrogram of methanol solution of
2-chlorobenzaldehyde and benzalacetone
从图 1 可以看到 ,混合溶液在 206 nm 、220 nm 、
284 nm 处有紫外吸收。故选择 220 nm 为同时测定邻
氯苯甲醛和苄叉丙酮含量的最佳波长 。
2.2 色谱分离
在 1.3色谱条件下 ,邻氯苯甲醛和苄叉丙酮两组
分实现基线分离 ,其保留时间为苄叉丙酮 3.208 min 、
邻氯苯甲醛 4.589 min 。混合标准溶液和样品溶液的
色谱图分别见图 2 、图 3。
图 2 混合标准溶液色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of standard solution
2.3 线性关系
准确移取对 照品贮备液 0.1 mL 、 0.2 mL 、
1.0 mL 、5.0 mL 、10.0mL ,分别置于10 mL容量瓶中 ,
用流动相稀释至刻度 ,摇匀 ,进样 。以峰面积为纵坐
标 、相应浓度为横坐标进行线性回归 ,在一定的浓度范
围内 ,其浓度和峰面积之间具有良好的线性关系 ,结果
见表 1。
图 3 样品溶液色谱图
Fig.3 HPLC chromatogram of sample solution
表 1 邻氯苯甲醛和苄叉丙酮线性关系及标准曲线
Tab.1 Results of standard curve and linear relationship
组分 线性方程 相关系数 线性范围/μg ·mL-1
邻氯苯甲醛 Y =5.293×103 X-4.53×102 0.9993 1 ～ 200
苄叉丙酮 Y =1.789×104 X-3.56×103 0.9998 1 ～ 200
2.4 精密度及重现性
取对照品稀溶液 ,重复进样 5 次。邻氯苯甲醛和
苄叉丙酮峰面积积分值的 RSD 分别为 0.86%、
0.79%;对同一样品连续测定 5次 ,邻氯苯甲醛和苄叉
丙酮的 RSD分别为 0.83%、0.87%。
2.5 回收率实验
准确 移取 对 照 品 贮备 液 0.1 mL 、 1.0 mL 、
1.5 mL 、2.0 mL 、5.0 mL ,分别置于10 mL容量瓶中 ,
然后精密加入样品贮备液各2 mL ,用流动相稀释至刻
度 ,摇匀 ,进样 。读取峰面积 ,从标准曲线上求得含量
并计算回收率 。邻氯苯甲醛和苄叉丙酮的平均回收率
分别为 98.7%、100.1%。
2.6 样品测定
取样品供试品溶液和对照品稀溶液分别进样 ,读
取峰面积 ,按外标法计算含量 ,结果见表 2。
表 2 样品分析
Tab.2 Analysis of samples
组分 检测量/μg ·mL -1 平均含量/μg·mL -1 相对标准偏差/%
邻氯苯甲醛
125.23 , 125.03 , 125.44 ,
125.25 , 125.15
125.22 0.12
苄叉丙酮 2.37 , 2.43 , 2.18 , 2.33 , 2.28 2.32 4.08
3 结论
建立了高效液相色谱同时测定邻氯苯甲醛 、苄叉
丙酮含量的方法 。采用C18(250 mm×4 mm ,5 μm)色
谱柱 ,以甲醇 -水(90 ∶10 ,体积比)为流动相 ,流速
1.0 mL ·min-1 ,室温 , UV 220 nm 的色谱系统 。样
李 蕾等:高效液相色谱法同时测定邻氯苯甲醛和苄叉丙酮的含量/ 2007 年第 1 期 73
品中邻氯苯甲醛的平均回收率为 98.7 %、苄叉丙酮的
平均回收率为 100.1 %, 其 RSD(n =5)分别为
0.83%、0.87 %,邻氯苯甲醛的线性范围为 1 ～ 200 μg
·mL-1(R=0.9993)、苄叉丙酮的线性范围为 1 ～ 200
μg ·mL-1(R =0.9998)。该方法用于电镀添加剂中
邻氯苯甲醛 、苄叉丙酮含量的测定 ,结果准确 ,操作简
便 、快速 。
参考文献:
[ 1] 樊绍文 ,仇德乐 ,郑涛.GC/MS 分析工业邻氯苯甲醛[ J] .染料工
业 , 2001 , 38(2):42-43.
[ 2] 顾慰中.商品苄叉丙酮含量的测定[ J] .电镀与涂饰 , 1996 , 15(4):
30-32.
[ 3] 黄巍 ,黄逢春 ,范军亮.镀锌液中苄叉丙酮含量与消耗速率的测定
[ J] .材料保护 , 2002 , 35(8):48-49.
[ 4] 王孝熔.用分光光度法测定氯化物镀锌溶液中的苄叉丙酮[ J] .材
料保护 , 1997 , 30(1):30-32.
Simultaneous Determination of 2-Chlorobenzaldehyde and
Benzalacetone by HPLC
LI Lei ,CHEN Wen-li
(Analysis and Test Center ,Wuhan Insti tute of Technology ,Wuhan 430073 ,China)
Abstract:A high performance liquid chromatog raphy(HPLC)me thod w as established fo r the dete rmination
of 2-chlo robenzaldehyde and benzalacetone simultaneously .The chromatog raphic system w as as follow s:chrom-
atographic column C18(250 mm ×4 mm , 5 μm), using methano l-wate r (90∶10 , volume ratio)so lut ion as fluid
phase , flow rate 1.0 mL·min-1 , at room temperature , UV 220 nm .The average recovery of 2-chlo robenzalde-
hyde and benzalacetone in the samples we re 98.7% and 100.1 %, and their RSD(n=5)were 0.83 %,0.87%, re-
spectively .Linear range of both 2-chlorobenzaldehyde(R=0.9993)and benzalacetone(R=0.9998)was 1 ～ 200
μg ·mL-1 .Through the determinat ion of 2-chlo robenzaldehyde and benzalacetone in addi tive fo r elect roplating ,
the method w as proved to be accurate , simple and rapid.
Keywords:HPLC;2-chlorobenzaldehyde;benzalacetone
(上接第 44页)
[ 6] Balachandran S , Kenti sh S E , M aw son R , et al.Ult rasonic en-
hancement of th e su percri ti cal ex tract ion f rom ginger[ J] .Ult ra-
sonics Sonochemis t ry , 2006 , 13(6):471-479.
[ 7] Riera E , Golas Y , Blanco A , et al.Mass t ran sfer en han cem ent in
supercriti cal f luid s ext raction by means of pow er ul t rasound[ J] .
Ult ras onics Sonochemist ry , 2004 ,11:241-244.
超声强化密相 CO2萃取葵花籽油的研究
谭 伟 , 丘泰球 , 范晓丹
(华南理工大学 轻化工研究所 ,广东 广州 510640)
摘 要:进行了超声强化密相 CO2 萃取葵花籽油的研究 ,探讨了萃取温度 、压力 、时间 、CO2流速以及超声功率密度
和频率对葵花籽油萃取率的影响。结果表明 , 附加20 kHz 、100 W · L-1的超声波后 , 萃取压力 、时间和 CO 2流速分别降
低了 5 MPa、0.5 h 和 0.5 L · h-1。超声对萃取的影响主要是由于超声的机械波动效应。采用了响应曲面法对超声强化
萃取条件进行了优化 , 并得到优化后的萃取条件为:萃取温度 28.3℃、压力 28 MPa、时间 178 min 、CO 2 流速 3.0 L ·
h -1 、超声功率密度为 100 W · L-1 、超声频率为20 kHz。在优化条件下 , UDCE 与 DCE相比能够提高 19%的萃取率。
关键词:超声;密相 CO 2;葵花籽油;Soxhlet提取;响应曲面法
中图分类号:TS 225.15 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0039-04
2007, Vol.24 No.1化学与生物工程
Chemistry & Bioengineering74
收稿日期:2006-09-25
作者简介:陈瑞文(1983-),男 ,湖北武汉人;通讯联系人:董元彦(1944-),男 ,湖北人 ,教授 , 博导 , 主要研究方向为物理化学 、环境
化学。
生物柴油及其调和油理化性能的测定
陈瑞文 , 罗钰萌 , 王 运 , 董元彦
(华中农业大学理学院应用化学系 ,湖北 武汉 430070)
摘 要:测定了生物柴油及其与石化柴油的调和油的粘度 、燃烧热 、硫含量 、残炭 、灰分 、闪点 、水分和十六烷值的含
量。研究了温度对粘度的影响 , 并比较了生物柴油及其调和油与石化柴油的理化性能 , 结果表明生物柴油及其调和油某
些性能更优 , 应用前景良好。
关键词:生物柴油;调和油;理化性能
中图分类号:TQ 517.2 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0074-03
生物柴油是一种无毒 、可生物分解 、可再生的燃
料 ,其主要成分是脂肪酸甲酯 ,是以可再生资源(如油
菜籽油 、大豆油 、玉米油 、棉籽油 、花生油 、葵花子油 、棕
榈油 、椰子油 、回收烹饪油及动物油等)为原料制成
的[ 1] ,具备与石化柴油相近的性能 。和石化柴油相比 ,
生物柴油是一种清洁可再生能源 ,燃烧后可有效地减
少机动车尾气中氮氧化物 、硫化物以及总颗粒物的排
放 ,具有降低柴油机排放的潜力 。
在国外 ,较早开发和应用生物柴油的国家均制定
了相应的标准[ 2] ,并对生物柴油中的其它杂质确定了
相应的测定方法。我国生物柴油的开发和应用尚处于
起步阶段 ,未形成产业化 ,也未建立相关指标的标准分
析方法 。
作者在此按 0#柴油的国家标准方法着重对生物
柴油及其调和油的粘度 、燃烧热 、含硫量 、残炭 、灰分和
水分等理化性质进行了测试[ 3] ,探索了生物柴油及其
调和油的测试方法 ,为生物柴油的进一步研究和应用
提供了一系列的基础数据。
1 实验
1.1 原料
生物柴油 ,由华中农业大学理学院生物柴油课题
组提供 ,由菜籽油制备;市售 0#柴油 。
1.2 方法
1.2.1 粘度测定
参照GB/ T 265 -88对生物柴油及其与 0#柴油
不同配比的调和油进行测定。其中调和油的比例(生
物柴油∶0#柴油 ,体积比)分别为 5∶95 、10∶90 、20 ∶
80 、50∶50。测定其-4 ～ 40℃的动力粘度变化[ 4] 。
1.2.2 燃烧热测定
采用氧弹法测定生物柴油和 0#柴油燃烧全
热[ 4 , 5] 。
1.2.3 硫含量的测定
氧弹法与配位滴定法结合 , 用钡 -镁标准溶液
(0.05 mo l· L-1 +0.005 mol · L-1)吸收氧弹中燃
烧氧化产生的 SO 3 ,用 0.015 mol · L-1的 EDTA 标
准溶液间接滴定确定全硫含量[ 6] 。
1.2.4 残炭和灰分含量测定
先在 520℃进行残炭的测定[ 7] ,然后在 800℃煅烧
1 ～ 2 h后测定灰分的含量。由于灰分主要成分是无
机盐 ,这种处理方法对灰分测定的结果几乎没有影响 。
将 8 g 生物柴油(m1)置于坩埚中 ,在马弗炉内
520℃加热蒸发 、裂解 ,称量黑亮剩余物的质量(m2)至
恒重 ,残炭量为 m2/m1 。
上述黑亮的剩余物在马弗炉内 800℃继续加热 1
～ 2 h ,得到白色无机物 ,称量其质量 m3至恒重 ,灰分
含量为 m3/m1 。
1.2.5 其它指标测定
委托湖北荆门石化总厂油品检测中心测试生物柴
油的闪点 、水分和十六烷值 。
2 结果与讨论
2.1 粘度
生物柴油以及各种配比的调和油在不同温度下的
陈瑞文等:生物柴油及其调和油理化性能的测定/2007 年第 1 期 75
粘度变化如图 1所示。
图 1 温度对生物柴油及调和油粘度的影响
Fig.1 Effect of temperature on viscosity of biodiesel
and its blending oils
从图 1可以看到 , 0#柴油与生物柴油的粘度随着
温度的升高不断下降 ,最终比较接近;反之 ,随着温度
的降低粘度急剧上升 ,两者的差距显著拉大。在低温
阶段 ,生物柴油的粘度显著高于 0#柴油。说明生物柴
油低温流动性比 0#柴油差 ,即低温下纯生物柴油不能
完全替代石化柴油。但生物柴油粘度较大 ,具有润滑
作用 ,能减少机器的摩擦损耗。
由于生物柴油粘度显著高于石化柴油 ,随着生物
柴油在调和油中比例的增加 ,体系粘度也增加[ 1] 。生
物柴油与 0#柴油配比为 5 ∶95时 ,调和油与 0#柴油
的粘度基本一致 ,说明在 0#柴油中加入 5%的生物柴
油 ,对 0#柴油的粘度没有显著影响 ,能够满足低温下
流动性的要求 。
2.2 燃烧热
按照国家标准方法测得 0#柴油燃烧全热为
48.133 kJ· g -1 、生物柴油的燃烧全热为 43.53 kJ ·
g
-1 ,比轻柴油燃烧热文献值 48 kJ· g-1低 10%以上 。
这主要是因为生物柴油是一种酯 ,其中碳氢的含量低
于石化柴油 ,而氧含量高于石化柴油[ 8] ,更容易完全燃
烧 。在不调整柴油机进油量的前提下使用生物柴
油[ 8] ,需要其与石化柴油进行适当配比调和 。
2.3 硫含量
选择 1.6 MPa 、2.0 MPa、2.4 MPa 、2.7 MPa 、
2.9 MPa共 5 个不同氧弹压力进行了硫含量测
定[ 9 , 10] ,结果如图 2所示。
从图 2可以看到 ,要准确测得柴油的硫含量 ,最佳
的氧弹初始氧气压力条件为 2.6 ～ 3.0 MPa 。生物柴
油的硫含量为 7 mg ·kg -1 ,明显低于 0#柴油的60 mg
·kg -1 ,也低于欧盟生物柴油 Pr EN 14214 标准的
10 mg ·kg-1 。这是因为生物柴油的生产原料菜籽油
中硫含量远低于石化柴油 ,其燃烧对空气质量的影响
图 2 不同氧弹初始氧气压力下硫含量测定结果
Fig.2 The determination result of sulfur content with
variant air pressure of oxygen bomb
远远低于石化柴油 ,这是生物柴油替代石化柴油的重
要优势之一。
2.4 残炭和灰分含量
测定结果表明 ,生物柴油的残炭含量为 1.9 %、灰
分含量为 0.017%,与 0#轻柴油的文献值相当 ,同时
也低于欧盟的Pr EN 14214标准 ,可以替代石化柴油 。
2.5 其它指标
测定结果表明 ,生物柴油部分性能指标为:闪点
(开口)为 188℃,十六烷值为 48 ,水痕量。
生物柴油的闪点比石化柴油(55℃)高 130℃以
上 ,在运输安全方面有很大优势 。由于生物柴油用固
体碱催化制备 ,未经水洗 ,故不含水分 。生物柴油的十
六烷值与石化柴油接近 。故以生物柴油替代石化柴油
或进行调和使用 ,在某些性能上优于石化柴油。
3 结论
测定了菜籽油生物柴油及其与石化柴油的调和油
的粘度 、硫含量 、燃烧热 、残炭 、灰分 、闪点 、水分和十六
烷值的含量 ,结果表明 ,生物柴油以 5%的配比加入到
0
#柴油中可以达到 0#轻柴油的标准 ,有较好的流动
性 ,且燃烧性能和运输安全性也有保障 ,具有实用价
值 。尤其是在我国温度相对较高的南方 ,生物柴油有
很好的应用前景。
参考文献:
[ 1] 徐鸽 ,巫淼鑫 ,邬国英.生物柴油低温流动性能研究[ J] .江苏工
业学院学报 , 2004 , 16(4):14-16.
[ 2] 朱建良 ,张冠杰.国内外生物柴油研究生产现状及发展趋势[ J] .
化工时刊 , 2004 , 18(1):23-27.
[ 3] 黄小明 ,谢文磊 ,彭红,等.生物柴油的标准和质量控制[ J] .粮油
食品科技 , 2005 , 13(3):40-42.
[ 4] Gerhard Knothe , Kevin R S teidley.Kin ematic viscosity of biodiesel
fu el comp on ents and related compounds[ J] .Fu el , 2005 , 84(9):
1059-1065.
[ 5] Tate R E ,Watts K C , Allen C A W , et al.Th e viscosi ties of three
陈瑞文等:生物柴油及其调和油理化性能的测定/ 2007 年第 1 期76
biodiesel fuel s at temperatu res up to 300℃[ J] .Fuel , 2006 , 85(7-
8):1010-1015.
[ 6] 郑敏 ,孙明 ,莫言学 ,等.氧弹法快速测定煤中硫含量的研究[ J] .
建材技术与应用 , 2005 , (5):18-20.
[ 7] Lacoste F , Lagardere L.Quality param eters evolut ion during
biodiesel oxidation using Rancimat test[ J] .Eu r J Lipid Sci T echn-
ol , 2003 , 105(3):149-155.
[ 8] Frö hlich A , Rice B.E valuat ion of Camelina sativa oi l as a feed-
stock for biodiesel produ ct ion[ J] .Indu st rial C rops and Produ cts ,
2005 , 21(1):25-31.
[ 9] Perei ra M Gloria , Mudge Steph en M .Cleaning oiled shores:Labo-
ratory experiments testing the poten tial u se of vegetable oil
biodiesel s[ J] .Chemosph ere , 2004 , 54(3):297-304.
[ 10] 靳福泉 ,冯伟.燃烧热测定过程中氧弹内极限温度和极限压力的
预测[ J] .实验室研究与探索 , 2003 , 23(10):22-24.
The Determination of Physicochemical Characteristics of Biodiesel and Its BlendingOils
CHEN Rui-wen , LUO Yu-meng , WANG Yun , DONGYuan-yan
(Department of Applied Chemistry ,School of Science , Huazhong Agricultural University ,Wuhan 430070 ,China)
Abstract:The viscosi ty , combustion heat , sulfur content , carbon residue , ash , flash point , moisture and ce-
tane value of biodiesel and its blending oils wi th diesel w ere dete rmined.The influence of temperature on the
visco sity w as studied , and the physicochemical characteristics of biodiesel and its blending oi ls w ere compared
w ith diesel.The results indicated that biodiesel and its blending oils had some superior performances and good
applicat ion prospect .
Keywords:biodiesel;blending oil;phy sicochemical characteristic
(上接第 17页)且光照时间越长 ,溶液中亚甲基蓝的降
解越趋向完全 。
光源的强弱对降解也有影响 ,多次实验表明 ,阴天
的时候由于日光的减弱 ,亚甲基蓝降解的幅度比晴天
明显减小。
3 结语
研究了自制的纳米 TiO 2溶胶的光催化活性 。利
用此 TiO 2溶胶在日光下对亚甲基蓝进行光催化降解 ,
结果表明:在亚甲基蓝浓度为 4 ×10-6 mo l · L -1 、
TiO 2用量为 5.0 ×10-3 mo l· L-1 ,加入 3%的 H2O 2
1 mL 、日光照射30 min的条件下 , 其降解率可达到
80 %以上 ,取得了较好的降解效果 。该纳米 TiO 2 溶
胶具有较高的光催化活性 ,分散性能好 、方法简单 、费
用低 ,具有较好的实际应用价值 。
参考文献:
[ 1] 李红 ,王君.亚甲基蓝在 TiO 2上的吸附及对其催化超声降解的影
响 [ J] .染料与染色, 2005 , 42(6):52-54.
[ 2] 石建敏 ,李巧玲 ,周仁贤 ,等.二氧化钛光催化降解水溶液分散染
料的研究 [ J] .水处理技术 , 2002 , 28(2):105-107.
[ 3] 刘振荣 ,李红 ,王君 ,等.TiO2催化超声降解亚甲基蓝溶液 [ J] .化
学研究 , 2005 , 16(1):69-71.
[ 4] 张天永 ,李祥忠 ,赵进才.国产二氧化钛在光催化降解染料废水中
的应用 [ J] .催化学报 , 1999 , 20(3):356-360.
[ 5] T aked a K , Fujiw ara K.C haracteri st ics of the determination of
diss olved organic ni trogen com pound s in n atu ral w aters u sing t i-
tanium dioxide and plat inized t it anium dioxide m ediated pho tocat-
aly tic d egradation [ J] .Water Research , 1996 , 30 (2):323-
330 .
[ 6] Wang J Y , Yu J X , Liu Z H , et al.A sim ple new w ay to prepare
anatase TiO2 hydrosol wi th high photocataly tic activi ty[ J] .Semi-
conductor Science and T ech nology , 2005 , 20(8):36-39.
Photocatalytic Degradation of Methylene Blue by TiO2 Hydrosol with Solar Light
ZHENG Qi
1 , LI Zhong-ming1 ,WANG Jing-yu2 ,LIU Zhi-hong2
(1.Collegeo f Chemistry and Env ironmental Engineering , J ianghanUniversity , Wuhan 430056 , China;
2 .College of Chem istry and Molecular Sciences , Wuhan University , Wuhan 430072 , China)
Abstract:Using self-made TiO2 hydro sol as catalyst , the influent ial factors on pho tocataly tic deg radation o f
methy lene blue w ith so lar light we re studied.The experimental results indicated that T iO 2 hydroso l had high
pho to cataly tic activi ty.The degradation rate of methylene blue surpassed 80%under the selective condi tions.
Keywords:solar light;TiO 2 hydroso l;methy lene blue;degradat ion
化学与生物工程 2007, Vol.24 No.1 Chemistry &Bioengineering 77
收稿日期:2006-10-23
作者简介:李 (1975-), 女 ,山东荷泽人 ,博士研究生 , 主要从事天然产物化学的研究。 E-mail:iceli 2003@163.com。
野生植物金银忍冬营养成分的测定
李 1 , 2 , 3
(1.中国科学院海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.青岛科技大学化学与分子工程学院 ,山东 青岛 266042;
3.中国科学院研究生院 ,北京 100049)
摘 要:对野生植物金银忍冬的营养成分进行了分析 , 结果表明 , 金银忍冬中含有至少 17 种氨基酸 ,丰富的维生
素 、矿质元素及其它多种营养成分。为开发利用植物资源提供了科学依据。
关键词:野生植物;金银忍冬;营养成分
中图分类号:Q 946 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(2007)01-0077-02
金银忍冬(L.maackii Rupr.Maxim.)属忍冬科(Ca-
prifoliaceae)植物 ,其茎皮可制人造棉 ,种子油可制肥皂 ,叶
浸汁可杀棉蚜虫 ,花可作金银花用;全株入药 ,能祛风解
毒 、消肿止痛 ,主治头晕 、跌打损伤;本种也可作庭院和城
市绿化 、观赏树种。作者在此对金银忍冬的营养成分进
行了测定 ,拟为开发利用其植物资源提供科学依据。
1 实验
1.1 材料及处理
金银忍冬 。
维生素测定采用鲜样 ,氨基酸含量 、营养成分含量
和矿质元素含量测定均采用干样 。样品烘干 ,研细 ,过
40目筛 ,备用。
1.2 营养成分测定方法[ 1 , 2]
水分:重量法;
灰分:干灰化法;
粗纤维:粗纤维法;
粗脂肪:索氏浸提法;
蛋白质:凯氏定氮法;
总糖:费林试剂法;
维生素和 β-胡萝卜素:岛津 LC-6A型系列高效液
相色谱仪测定;
氨基酸:样品用标准蛋白水解法处理 ,采用 PICO-
TAG 型氨基酸自动分析仪测定;
矿质元素:样品经酸化消化法处理 ,采用日立 Z-
8000原子吸收分光光度计测定 。
每份样品重复三次测定 ,取平均值。
2 结果与讨论
2.1 氨基酸含量的测定
金银忍冬氨基酸含量的测定结果见表 1 。
表 1 金银忍冬氨基酸含量/mg· g-1
Tab.1 Amino acid contents of
L.maackii Rupr.Maxim./mg· g-1
氨基酸 含量 氨基酸 含量
谷氨酸 0.321 赖氨酸＊ 0.106
天冬氨酸 1.238 甘氨酸 0.268
丝氨酸 0.065 粗氨酸 0.319
组氨酸 0.146 丙氨酸 0.111
苏氨酸＊ 0.071 酪氨酸 0.167
脯氨酸 0.119 蛋氨酸＊ 0.099
缬氨酸＊ 0.126 异亮氨酸＊ 0.116
半胱氨酸 0.516 苯丙氨酸＊ 0.763
亮氨酸＊ 0.015
注:＊为人体必需氨基酸
由表 1可看出 ,金银忍冬至少含有 17 种氨基酸 ,
天冬氨酸含量最高 ,为 1.238 mg ·g-1 , 其中有7种是
人体必需的氨基酸 。
2.2 维生素含量的测定
金银忍冬中维生素含量的测定结果见表 2。
表 2 金银忍冬维生素含量/mg· g-1
Tab.2 Vitamin contents of L.maackii Rupr.Maxim./mg· g-1
维生素 含量 维生素 含量
V c 2.37 VB2 3.14
V pp 2.39 β-胡萝卜素 0.0489
VB1 2.16
由表 2可看出 ,金银忍冬中含有 V c 、V pp 、VB
1
、VB
2
和 β-胡萝卜素。其中VB
2
含量较高 ,为3.14 mg ·g-1 。
2.3 矿质元素含量的测定
李 :野生植物金银忍冬营养成分的研究及应用/ 2007 年第 1 期78
金银忍冬中矿质元素含量的测定结果见表 3 。
表 3 金银忍冬矿质元素含量/μg· g-1
Tab.3 Contents of mineral elements in
L.maackii Rupr.Maxim./μg· g-1
元素 含量 元素 含量
Na 89.23 C u 9.05
Mg 118.89 Zn 1.11
Fe 6.33 Co 0.22
K 301.17 P 36.87
Ca 356.76 M n 10.21
由表 3可看出 ,金银忍冬中含有 Na 、Mg 、Fe 、K 、
Ca 、Cu 、Zn 、Co 、P 和 Mn等矿质元素 ,其中 Ca 含量较
高 ,为 356.76 μg · g-1 。
2.4 其它营养成分的测定
金银忍冬中水分 、灰分 、粗纤维 、粗脂肪 、粗蛋白和
总糖含量的测定结果见表 4。
从表 4 可看出 ,金银忍冬有较好的营养价值 ,其
中 ,总糖含量较高 ,达到了 38.99%。
表 4 金银忍冬营养成分/ %
Tab.4 Common nutritional components of
L.maackii Rupr.Maxim./ %
营养成分 含量 营养成分 含量
水分 42.33 粗脂肪 2.36
灰分 4.22 粗蛋白 1.01
粗纤维 10.11 总糖 38.99
3 结论
野生植物金银忍冬含有至少 17种氨基酸 ,丰富的
矿质元素 、维生素和其它多种营养成分。对野生植物
金银忍冬的营养成分进行了分析 ,其中总糖含量 、天冬
氨酸含量 、VB
2
含量 、Ca 含量较高 。为开发利用植物资
源提供了科学依据 。
参考文献:
[ 1] 袁瑾 ,钟惠民.野生植物滇刺枣的营养成分[ J] .植物资源与环境 ,
1998 , 7(2):63-64.
[ 2] 李 ,王志奇 ,袁瑾 ,等.野生植物灰叶堇菜 、白术中氨基酸含量分
析[ J] .氨基酸和生物资源 , 2004 , 26(2):77-78.
Determination of Nutritional Components of Wild Plant L.maackii Rupr.Maxim.
LI Fang
1 , 2 , 3
(1 .Inst ituteo f Oceanolog y , Chinese Academy o f S ciences , Qingdao 266071 ,China ;
2.Insti tute of Chem istry and Molecular Engineering ,University of Science and Technology of Qing dao ,
Qingdao 266042 ,China ;3.Grad uate University , Chinese Academy of Sciences ,Bei j ing 100049 ,China)
Abstract:The analy sis of L.maacki i Rupr.Maxim.nutrients show ed that there a re mineral elements , fiber ,
proteins , carbonhydrates and vitamins including β-caro tene.And at least 17 kinds of amino acids are found in
L .maack i i Rupr.Maxim..It provided the basic data fo r the utilization of this w ild plant .
Keywords:w ild plant;L.maacki i Rupr.Maxim .;nutrit ional component
(上接第 46页)实验结果还表明 ,用紫外分光光度法测
定隔山牛皮消中总甾苷的含量 ,快速 、简便 、稳定性好 、
重现性好 ,可以广泛使用。
参考文献:
[ 1] 印梅 ,冯煦 ,董云发 ,等.白首乌化学成分与药理活性研究进展
[ J] .中国野生植物资源 , 2004 , 23(2):8-11.
[ 2] 宋俊梅 ,陶冠军 ,汤坚,等.白首乌中 C21甾甙元的分离与结构鉴定
[ J] .无锡轻工业大学学报 , 2002 , 21(2):176-178.
[ 3] 张兆旺 ,孙秀梅.试论“半仿生提取法”制备中药口服制剂[ J] .中
国中药杂志 , 1995 , 20(11):670.
[ 4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[ M] .北京:化学
工业出版社 , 2000:附录 63.
[ 5] 张瑞亭 ,张兆旺 ,孙秀梅.思维方式的转换与中药“半仿生提取法”
[ J] .中国中药杂志 , 1997 , 22(9):542.
Optimization of Semi-bionic Extraction Technology of Steroidal Glycosides
from Geshanxiao through Homogeneous Design Method
LI Yu-shan , HE Yan
(Hubei Province K ey Laboratory o f Natural Product Research and Development ,China Three
Gorges Universi ty Y ichang 443002 ,China)
Abstract:Choo sing content of steroidal g lycoside and yield of dry ext ract as indexes , the homogeneous de-
sign method w as applied to optimize the semi-bionic ex t raction of steroidal g ly co side f rom Geshanxiao.The opti-
mized ext raction conditions w ere determined as fol low s:the pH values during deco tion wi th w ater fo r three
t imes we re sequent ly 5.0 ,6.0 ,8.0;ref luxing and ext racting w ith 8 BV wate r for 2 h , 1 h ,1 h , respectively;the
total ex t raction time w as 4 h .The feasibility of the optimum techno logy w as veri fied through tests.
Keywords:geshanxiao;steroidal gly co sides;homogeneous design method