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PB实验设计联用CCD-RSM优化虎眼万年青多糖铁复合物的制备工艺



全 文 :第30卷第5期
2014年10月 
            
分 子 科 学 学 报
 JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCE
        
  Vol.30No.5
  October 2014
收稿日期:2014-02-16
联系人简介:闫 静(1962-),女,教授,主要从事药物化学研究.
E-mail:yanjing_002@163.com
[文章编号]1000-9035(2014)05-0369-07
PB实验设计联用CCD-RSM优化虎眼万年青
多糖铁复合物的制备工艺
尹玉婷,闫 静*
(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨150040)
[摘 要] 为了探究虎眼万年青多糖铁(Ⅲ)复合物(OPIC)的最佳合成方法,我们采用Plack-
ett-Burman设计对虎眼万年青多糖铁复合物制备工艺的主要影响因素进行考察,联用星点设
计(central composite design,CCD)效应面法对显著性因素的水平进行优化,以溶剂加入量、三
氯化铁加入量、多糖和柠檬酸钠加入量的比例、温度以及pH值为自变量,以虎眼万年青多糖
铁中铁含量为因变量,通过对自变量与因变量的完全二次响应曲面的回归拟合,用效应面法预
测最佳工艺.结果表明:温度、pH值和质量比对虎眼万年青多糖铁的合成有显著性意义;二项
式方程拟合度高,相关系数r=0.987 9.虎眼万年青多糖铁的最佳合成工艺:溶剂的加入量为
70mL,三氯化铁的加入量为6mL,温度80℃,质量比为3.5,pH值为8.最终利用Plackett-
Burman实验设计连用CCD确定了虎眼万年青多糖铁的最佳合成工艺,该方法简便,预测性
好,重现性高.
[关键词] 虎眼万年青;多糖铁;Plackett-Burman设计;星点设计;效应面法
[中图分类号] O 623   [学科代码] 150·20   [文献标识码] A
0 引 言
虎眼万年青(ornithogalum caudatum Ait)为百合科(liliaceae)虎眼万年青属(Ornithogalum)多年
生草本植物花卉[1],从虎眼万年青中提取的多糖(ornithogalum caudatum Ait polysaccharide,OCAP)能
有效的增强小鼠的非特异性免疫和体液免疫功能[2]和具有很高的抗肿瘤活性[3].很多多糖具有能与三
价铁反应生成多糖铁复合物(polysaccharide iron complex,PIC)的特性[4-5].由于多糖铁复合物具有很
高的水溶性,不会产生铁离子所致的胃肠黏膜腐蚀和刺激作用,副作用少,以分子形式存在容易被小肠
黏膜细胞吸收,生物利用度和生物活性都很高,如可调节血糖、降血压、促进血循环和纠正孕期贫血等,
可被机体利用和吸收,从而发挥效应[6-8].本实验以虎眼万年青为原料,从中提取虎眼万年青多糖与铁
(Ⅲ)络合形成复合物,研究其复合物的提取工艺,为进一步研究和开发虎眼万年青多糖提供理论依据.
1 仪器与材料
1.1 仪器
恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司);R-202旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);
DOI:10.13563/j.cnki.jmolsci.2014.05.004
SHB-Ⅲ循环水时多用真空泵(郑州长城科工贸易有限公司);GENIUS6K台式离心机(长沙鑫奥有限公
司);DF-101S集热恒温加热磁力搅拌器(上海越众仪器设备有限公司);梅特勒AL204电子天平(上海
速展机电有限公司)等.
1.2 试药与试剂
原料虎眼万年青(购于吉林省白山市长白县),经黑龙江中医大学李彦冰教授鉴定;柠檬酸钠、三氯
化铁、氢氧化钠氧、硫酸亚铁、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿和正丁醇等均为分析纯.
2 方法与结果
2.1 虎眼万年青多糖的制备
乙醚脱脂,再用95%乙醇回流提取,残渣烘干后置于圆底烧瓶中,按一定料液比水回流提取.残渣
提取后减压过滤,合并滤液,减压浓缩,加入定量无水乙醇,于室温下沉化24h,减压过滤,沉淀冷冻干
燥,得粗多糖.用Sevag法除蛋白后加定量无水乙醇使其沉淀,静置,离心,过滤,沉淀先后用无水乙醇、
丙酮和无水乙醚依次抽洗,真空干燥,得精多糖.用苯酚-硫酸法测定多糖含量为92.74%.
2.2 OPIC的合成工艺
称取干燥虎眼万年青多糖适量、柠檬酸三钠0.5g加入到250mL锥形瓶中,用适量蒸馏水溶解.在
热水浴中不停搅拌下滴加10%碳酸钠2mL,搅拌均匀,缓慢交替滴加2mol/L三氯化铁溶液和20%的
氢氧化钠溶液,控制溶液的pH值在8.0~9.0范围内,当反应液中出现棕红色不溶性沉淀时,立即停止
滴加三氯化铁和氢氧化钠溶液,继续在热水浴中搅拌1h.趁热离心3min(4 000r/min).取上层深红棕
色液体,加入约2倍量体积的无水乙醇,搅拌均匀,溶液中出现红棕色沉淀物质,静置过夜.离心分离,沉
淀分别用95%乙醇、无水乙醇以及无水乙醚各洗涤一次,真空干燥,得无定形红褐色粉末(粗品).将粗
品溶于纯净水,用水透析除盐后,醇沉.沉淀分别用95%乙醇、无水乙醇和无水乙醚各洗涤2次,真空干
燥,得OPIC(精品)[9].采用邻菲罗啉分光光度法测定铁含量[10].
2.3 Plackett-Burman实验方法
选出对虎眼万年青多糖铁合成工艺有显著性影响的因素,为下一步的响应面分析提供指导.
2.3.1 实验设计
根据合成过程中的影响因素选定5个因素分别为:溶剂加入量、三氯化铁加入量、多糖和柠檬酸钠
加入量的比列、温度以及pH值.5个因素进行12次实验,每个因素取高、低两种水平.Plackett-Burman
设计因素和水平见表1.
表1 Plackett-Burman设计的因素和水平
因素
水平
-1 +1
A:三氯化铁的加入量/mL  3  6
B:温度/℃ 70  90
C:pH值 7  10
D:质量比 2  5
E:溶剂的加入量 70  100
2.3.2 Plackett-Burman实验结果及分析
5个因素12次实验,按照Plackett-Burman设计表设计,每个实验号重复3次,虎眼万年青多糖铁
的铁含量取3次均值.Plackett-Burman设计及结果见表2.
073      分 子 科 学 学 报      第30卷 
表2 Plackett-Burman实验设计及响应值
编号
A:三氯化铁的
加入量/mL
B:温度
/℃
C:pH值 D:质量比
E:溶剂的
加入量
铁的质量
分数/%
1  1  1 -1  1  1  8.457 4
2 -1  1  1 -1  1  7.604 8
3  1 -1  1  1 -1  7.526 4
4 -1  1 -1  1  1  8.575 0
5 -1 -1  1 -1  1  7.242 2
6 -1 -1 -1  1 -1  7.536 2
7  1 -1 -1 -1  1  7.095 2
8  1  1 -1 -1 -1  7.585 2
9  1  1  1 -1 -1  7.418 6
10 -1  1  1  1 -1  7.879 2
11  1 -1  1  1  1  7.438 2
12 -1 -1 -1 -1 -1  7.438 2
13  0  0  0  0  0  7.439 6
14  0  0  0  0  0  7.439 4
15  0  0  0  0  0  7.439 8
16  0  0  0  0  0  7.439 6
  用Design expert8.0.7.1软件对数据进行处理.各因素显著性分析结果见表3.
表3 各因素效应值及显著性分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 1.98  5  0.4  15.68  0.000 3 *
A:三氯化铁加入量 0.047  1  0.047  1.88  0.204 1
B:温度 0.88  1  0.88  34.65  0.000 2 *
C:pH  0.21  1  0.21  8.2  0.018 7 *
D:质量比 0.76  1  0.76  30.2  0.000 4 *
E:溶剂加入量 0.088  1  0.088  3.49  0.094 7
曲率 0.13  1  0.13  5.23  0.047 9
残差 0.23  9  0.025
失拟误差 0.23  6  0.038  1.42E+06 <0.000 1
纯误差 8.00E-08  3  2.67E-08
总和 2.34  15
  从表3可以看出,温度、pH值和质量比有显著影响,而溶剂的加入量和三氯化铁的加入量没有显
著影响,结合相关实验和实际意义,选择溶剂的加入量为70mL,三氯化铁的加入量为6mL进行星点
设计-效应面优化实验.
2.3.3 星点设计-效应面优化实验方法
通过Plackett-Burman实验设计确定出 OPIC的合成工艺的主要影响因素为温度、pH 值和质量
比,确定上述因素的水平范围(见表4).
表4 星点设计因素水平表
因素
水平
-1.682 -1  0  1  1.682
A:温度 63.18  70  80  90  96.82
B:质量比 0.98  2  3.5  5  6.02
C:pH  6.32  7  8  9  9.68
173第5期   尹玉婷,等:PB实验设计联用CCD-RSM优化虎眼万年青多糖铁复合物的制备工艺
  运用Design-Expert8.0.7.1软件对实验结果进行分析,以评价指标(因变量)分别对各因素(自变
量)进行多元线性回归和二项式拟合,得到回归方程为:wFe=+7.51+0.98×A+0.025×B-0.44×C
+3.313E-003×A×B+0.20×A×C+0.033×B×C-0.24×A2-0.15×B2-0.16×C2.对该模型进
行方差分析,结果见表5.表5为不同合成条件下虎眼万年青多糖铁的铁的质量分数的相应变化.第15
-20次实验为6次重复的中心点实验,用于考察模型的误差.表6为实验的方差分析结果,经F检验显
示总模型方程显著(P<0.000 1),R2=0.976 0,r=0.987 9,表明该回归模型的拟合情况良好,回归方
程的代表性较好,能准确的预测实际情况.基于已经建立的数学模型,预测虎眼万年青多糖铁的最佳合
成条件为:温度80℃,质量比为3.5,pH值为8.从因素交互作用来看,当P<0.05,可以判断各因素之
间差异具有显著性的意义,温度与pH的交互影响在统计学上具有显著性意义(P=0.003 1),而温度与
质量比(P=0.951 1)和质量比与pH(P=0.546 4)的交互作用不具有显著性的意义.
表5 星点设计-效应面法优化实验结果与预测值表
编号
因素
A:温度 B:质量比 C:pH
wFe/%
1 -1 -1 -1  6.428 3
2  1 -1 -1  8.286 9
3 -1  1 -1  6.672 5
4  1  1 -1  8.091 3
5 -1 -1  1  5.369 2
6  1 -1  1  7.592 4
7 -1  1  1  5.291 9
8  1  1  1  7.981 4
9 -1.682  0  0  5.290 1
10  1.682  0  0  8.360 9
11  0 -1.682  0  7.091 5
12  0  1.682  0  7.081 9
13  0  0 -1.682  7.876 7
14  0  0  1.682  6.210 9
15  0  0  0  7.470 1
16  0  0  0  7.469 8
17  0  0  0  7.470 3
18  0  0  0  7.470 4
19  0  0  0  7.470 1
20  0  0  0  7.699 9
表6 二项式回归模型系数显著性检验表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 17.37  9  1.93  86.95 <0.000 1
A:温度 13.06  1  13.06  588.37 <0.000 1
B:质量比 8.67E-03  1  8.67E-03  0.39  0.545 9
C:pH  2.68  1  2.68  120.58 <0.000 1
AB  8.78E-05  1  8.78E-05  3.96E-03  0.951 1
AC  0.33  1  0.33  15.06  0.003 1
BC  8.65E-03  1  8.65E-03  0.39  0.546 4
A2  0.82  1  0.82  37.15  0.000 1
B2  0.31  1  0.31  14  0.003 8
C2  0.38  1  0.38  17.05  0.002
273      分 子 科 学 学 报      第30卷 
2.3.4 OPIC合成的复证实验
为了验证建立的模型与实验结果相符,确定实验模型的可靠性按照最优工艺条件进行验证.在温度
为80℃,质量比为3.5,pH值为8时,进行5次实验,取平均值与二项式方程预测值相比较,计算偏差
率.偏差率=[(真实值-预测值)/预测值]×100%.结果其虎眼万年青多糖铁中的铁含量的实验值为
(7.592 6±1.021 7)%,而预测值为7.508 1%,与理论预测值吻合良好,说明应用响应面优化法可靠
(见图1-3).
图1 温度和质量比以及相互作用对合成工艺影响的响应面
图2 温度和pH值以及相互作用对合成工艺影响的响应面
图3 质量比和pH值以及相互作用对合成工艺影响的响应面
373第5期   尹玉婷,等:PB实验设计联用CCD-RSM优化虎眼万年青多糖铁复合物的制备工艺
3 讨 论
利用水提醇沉的方法得OCAP,用Sevag法除蛋白后多糖含量为92.74%,用透析除盐的方法去掉
OPIC中的中性盐和其他小分子物质.OPIC合成过程中,对于pH 的控制要精准,及时把握滴定突跃,
以免pH发生急剧变化,导致实验失败.用邻菲罗啉分光光度法测定铁含量,操作过程简便、快速、人为
误差小以及灵敏度和准确度高等特点.
国内目前基本采用均匀设计和正交设计,此2种方法简便、实验次数少但建立的数学模型预测性较
差,实验精密度不够,而且不能考察各因素之间的交互作用.Plackett-Burman实验设计可以进行多个因
素、高低两种水平的实验设计,是非线性模型的实验设计,精密度显著高于一般线型模型设计方法,通过
较少次数从很多影响因素中筛选出显著影响的因素,从而避免在后期优化时由于部分因素不显著而浪
费资源.且该方法重现性好,预测性高[11-15].
本文实验采用Placket-Burman设计法对虎眼万年青多糖铁复合物形成的影响因素重要性进行考
察,发现温度、pH值和质量比有显著影响,而溶剂的加入量和三氯化铁的加入量没有显著影响.
目前尚未有Plackett-Burman实验设计联用星点设计-效应面优化法合成 OPIC的文献报道,但
OPIC的合成条件苛刻,有些因素很难精准控制,如需大量合成,还应增加合成工艺的稳定性和重复性.
4 结 论
利用Plackett-Burman实验设计连用CCD确定了虎眼万年青多糖铁的最佳合成工艺:溶剂的加入
量为70mL,三氯化铁的加入量为6mL,温度80℃,质量比为3.5,pH值为8.该方法简便,预测性好,
重现性高.实验结果为虎眼万年青多糖铁的合成及其进一步的应用提供了参考.
[参 考 文 献]
[1] 丁景,曾万章.药用植物学[M].上海:上海科学技术出版社,1985:225.
[2] 石磊,李娟,刘志强,等.[J].吉林大学学报:医学版,2002.28(03):232-234.
[3] 陈瑞战,李世哲,刘志强,等.[J].中国药学杂志,2011,46(21):1630-1634.
[4] KUDASHEVA D S,LAI J,UlLMAN A,et al.[J].Inorg Biochem,2004,98(11):1757-1769.
[5] DANIELSON B G.[J].J Am Soc Nephrol,2004,15:93-98.
[6] 王霞,尧金叶,韩艳枝.[J].中国医药指南,2013,11(9):545-595.
[7] 汤春妮.[J].安徽化工,2012,4(38):1-3.
[8] 孙志伟,邹翔,曲中原,等.[J].黑龙江医药,2013,03(26):378-379.
[9] 李琳,李稳宏,雒羽,等.[J].食品科学,2012,16(33):54-58.
[10] 李玉贤,游志恒,褚意新.[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(7):47-49.
[11] ZAGER R A.[J].Clin J Am Soc Nephro,2006,1:24-31.
[12] 吴伟,崔光华.[J].国外医学:药学分册,2000,27(5):292-298.
[13] 邱颖,朱玲,孙晓英.[J].海峡药学,2011,23(2):18-20.
[14] 刘艳杰,项荣武.[J].中国现代应用药学杂志,2007,24(6):455-457.
[15] NAVEENA B J,ALTAF M,BHADRIAH K,et al.[J].Bioresour Technol,2005,96(4):485.
473      分 子 科 学 学 报      第30卷 
Optimization on preparation of ornithogalum caudatum ait polysaccharide
iron complex based on Plackett-Burman design combined
with CCD response surface methodology
YIN Yu-ting,YAN Jing*
(Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)
Abstract:Object to choose the optimal synthesis method of Ornithogalum caudatum Ait polysaccharide
iron complexes(OPIC).The influential factors of preparation technology of OPTC were investigated
by Plackett-Burman design and optimized significant factors and level with the central composite de-
sign.The independent variables were dosage of solvent,dosage of ferric chloride,the ratio of polysac-
charide and dosage of sodium citrate(mass ratio),temperature and pH.The dependent variable was
the OPIC iron content.We find that temperature,pH,and mass ratio had significant influence on the
craft.Binomial equation fitted high,the correlation coefficient reached 0.987 9.The optimum condi-
tions for the preparation of the complex were folows:the dosage of solvent was 70mL,the dosage of
ferric chloride was 6mL,the mass ratio was 3.5,the temperature was 80℃,and the pH was 8.U-
sing the Plackett-Burman design combined with CCD response surface methodology establish the opti-
mal process of Ornithogalum caudatum Ait polysaccharide iron and the method is simple,good pre-
dictability,and high reproducibility.
Keywords:Ornithogalum caudatum Ait;polyferose;plackett-burman design;central composite de-
sign;response surface methodology
573第5期   尹玉婷,等:PB实验设计联用CCD-RSM优化虎眼万年青多糖铁复合物的制备工艺