全 文 ：1 9 9 4年 5 月
第 17 卷 第 3 期
四川师范大学学报 (自然科学版 )
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虎眼万年青的体细胞胚胎直接发生与植株再生
张 光 祥
(四川师范大学生物系 成都 6 10 0 6 6)
鲍 晓 明 何 孟 元
(东北师范大学遗传与细胞研究所 长春 1 3 0 0 2 4)
摘要 本文结果表明 , 在含 N A A 和 B A 各 0 . s m g l/ 的 M S 培养基上 ,体细胞胚以高
颇率直接发生于虎眼万年青休眠子鳞茎鳞片切段的近轴面原形态学基部一侧 . 体细胞胚
在残余的半干早培养基上失水处理后萌发率显著提高 , 并产生根系完整的健壮再生植
株 .
关银词 虎眼万年青 , 体细胞胚胎发生 , 失水处理 ,植株再生
中图分类号 0 17 .5 3
O 引言
植物体细胞胚与通过器官发生途径诱导的芽相比 , 具有个体间遗传背境更为一致 、发生量大 、
结构完整等优点 .l[ ’ 〕 ,在无性系快繁和植物遗传工程等方面的应用价值已受到高度重视〔3一 5] . 然而 ,
迄今为止还有很多有用植物的体细胞胚胎发生能力和诱导条件有待查明 . 至于如何提高体细胞胚
萌发并产生再生植株的频率 ,也是一个受到广泛关注的问题 [’ 一 5] .
观赏植物虎眼万年青 ( O rn l’t ho g al u m ca “ da ut m iA t . )是百合科的一种多年生常绿植物 ,通常
以产生子鳞茎方式行无性繁殖 , 繁殖系数低 . 该植物 的组织培养已有报道 〔幻 , 但繁殖率仍较低 . 本文
报道了从鳞片外植体诱导体细胞胚高频率直接发生的条件控制 , 以及促进体细胞胚正常萌发和提
高再生植株产生频率的改进方法 .
1 材料与方法
1
.
1 材料的准备
从三株盆栽的虎眼万年青母株上收集已发育成熟甚至已 自然脱落的子鳞茎贮于 4 ’ C 冰箱备
用 . 取直径为 6一 s m m 的子鳞茎经 95 %乙醇浸 5 分钟 ,无菌水漂洗 3 次后用 0 . 1%升汞表面灭菌
15 分钟 , 再经无菌水漂洗 5 次后剥去最外层鳞茎被膜 ,然后横切成 1 . s m m 厚的圆片 . 将圆片上各
层鳞片切段剥取下来 , 分别以正向 (即原形态学基部一侧与培养基接触 )和倒置两种方式接种于诱
导培养基上 .
1
.
2 培养条件
诱导培养基为附加了 a 一蔡乙酸 ( N A A )和 6一节基嚓吟 (B A )各 0 . sm g l/ 以及酪肮水解物 ( C H )
5。。m g 1/ 的 M s 培养基 . 用于体细胞胚萌发的培养基为无激素和 c H 的鲁M S 培养基 . 培养基 p H- 一 0 ’ 一 ` - 一 “ ” 一 ” “ ” 一 ’ `~ 一 ~ 一 ” ` 一 “ 矛 ` 一 / J ` “ , 叭 人 、 ” ’ 一一 ~ 2 一 ’ -一 ~ 7 ’ ~ 一目 7 ’ ~ t’ . `调到 5 . 8 后用 6 . 5 9 l/ 琼脂固化 ,在 121 ’ C 下热压灭菌 20 分钟 . 材料在白天 26 ℃ 、 1 8 0 0 1u x 光照 14
小时 、 夜间 10 小时 20 ℃不照光的条件下培养 .
1
.
3 组织切片
收稿 日期 1 99 3一 0 1一 0 2
四川师范大学学报 (自然科学版 ) 1 7 卷
分期取样用 F A A固定液固定 24小时 ,按常规方法经脱水 、 透明和石蜡包埋后切成 1 0拌 厚的
切片 ,番红染色 、 固绿对染 . 封片后光镜观察 .
L 4 扫描电镜观察
样品用 2 . 5 %戊二醛 固定 4 小时 , 3写高锰酸钾在 4 ℃下后 固定 12 小时 . 以后按常规操作 ,只是
在脱水前和脱水至 50 % 乙醇时 ,分别用碘化钾水溶液和醋酸双氧铀溶液各处理 30 分种作 电子染
色以取代喷金一步 . 样品用 JS H 一 8 40 扫描电镜在 15k V 下观察 ·
L S 植株再生
待大量体细胞胚形成后 ,一部份立即从母体组织上剥离下来 ,直接或经失水处理后才进入萌发
试验 . 另一部份经失水处理后才剥离下来 , 让其萌发 . 失水处理方法 , 一是将材料置于残存的半失水
干旱培养基上 3 至 4 周 ,相对湿度不低于 80 % , 光温条件与诱导期相同 . 二是将材料放在垫有湿润
滤纸的无菌培养皿内在相同条件下放置 10 天 .
2 结果与讨论
正向放置的外植体培养 1 周 ,外观略显肿胀 , 并在近轴面原形态学基部一侧开始体细胞胚的分
化 . 分化方式有两种 ,一是先形成扁平瘤状物 ,再在其中出现多个细胞分裂中心 ,进而分化 出多细胞
原胚 (图 I A ) . 再就是直接从表层分化 出多细胞原胚 (图 I B ) . 在 2周培养期内出现球形胚 (图 2 ) , 同
时在切 口处形成疏松的水样愈伤组织 . 此后球形胚逐渐增大成肉眼可辨的白色小点 (图 3 ) ,同时在
侧面 中部偏下位置出现 凹陷 ,开始子 叶分化 (图 4 ) , 并在第 4 周完成形态发生 ,形成一个大的绿色
顶生子叶 . 在培养的中 、 后期还相继 出现大量不同发育阶段的体细胞胚 (图 5) .
培养 25 天后的观察发现 ,正 向接种的外植体有 87 %产生体细胞胚 . 三次重复实验 2 0 多个外
植体统计 ,平均每个外植体产生 18 个体细胞胚 . 没有胚胎发生的外植体几乎都来自鳞茎最外层 鳞
片 . 这层鳞片相 比之下最薄 ,组织老化程度最高 ,而且在使用前的存放期间常有一定程度的失水变
软 . 倒置接种的环形外植体上始终未见体细胞胚胎发生 .
体细胞胚可从母体组织上剥离下来 (图 7) . 培养 28 天后立即剥离比较困难 ,且容易伤及胚根
端 , 除非在基部附带一些外植体组织 . 经失水处理后体细胞胚就很容易剥离下来了 . 剥离下来的单
个胚可在无激素培养基上萌发产生再生植株 (图 6) . 剥离前失水处理的体细胞胚不仅萌发率高 (表
1 )
, 而且产生的再生植株根系完整 (图 6) . 未经失水处理的单个胚在无激素培养基上不能萌发 ,发
育程度较低的反而渐渐死去 . 如转入新鲜的诱导培养基则萌发产生无根苗 ,这些无根苗只有在含
2
· 。m g l/ N “ A 和 2 0 9 l/ 蔗糖的音M S 培养基上才能很好生根 ·
表 1 不同处理方法对体细胞胚正常萌发的促进效果狱
失水处理方法
支撑物 ! 剥离时间
剥离下来的休
细胞胚数 (个 )
萌发产生的小
植株数 (株 )
萌发率
(% )
失水处理前
湿润滤纸
失水处理后
半失水的干
旱培养基
失水处理前
失水处理后
狱在第三次试验中考查了 39 个外植休 ,其中 19 个在失水处理前剥离 , 只剥下来 17 3 个休细胞胚 ;
另 20 个在失水处理后剥下来 3 25 个休细胞胚 .
四川师范大学学报 (自然科学版) 17 卷
分期取样用 FA A 固定液固定 24小时 ,按常规方法经脱水 、 透明和石蜡包埋后切成 1 0拌 厚的
切片 ,番红染色 、 固绿对染 . 封片后光镜观察 .
L 4 扫描电镜观察
样品用 2 . 5 %戊二醛 固定 4 小时 , 3写高锰酸钾在 4 ℃下后 固定 12 小时 . 以后按常规操作 ,只是
在脱水前和脱水至 50 % 乙醇时 ,分别用碘化钾水溶液和醋酸双氧铀溶液各处理 30 分种作 电子染
色以取代喷金一步 . 样品用 JS H 一 8 40 扫描电镜在 15k V 下观察 ·
L S 植株再生
待大量体细胞胚形成后 ,一部份立即从母体组织上剥离下来 ,直接或经失水处理后才进入萌发
试验 . 另一部份经失水处理后才剥离下来 , 让其萌发 . 失水处理方法 , 一是将材料置于残存的半失水
干旱培养基上 3 至 4 周 ,相对湿度不低于 80 % , 光温条件与诱导期相同 . 二是将材料放在垫有湿润
滤纸的无菌培养皿内在相同条件下放置 10 天 .
2 结果与讨论
正向放置的外植体培养 1 周 ,外观略显肿胀 , 并在近轴面原形态学基部一侧开始体细胞胚的分
化 . 分化方式有两种 ,一是先形成扁平瘤状物 ,再在其中出现多个细胞分裂中心 ,进而分化 出多细胞
原胚 (图 I A ) . 再就是直接从表层分化 出多细胞原胚 (图 I B ) . 在 2周培养期内出现球形胚 (图 2 ) , 同
时在切 口处形成疏松的水样愈伤组织 . 此后球形胚逐渐增大成肉眼可辨的白色小点 (图 3 ) ,同时在
侧面 中部偏下位置出现 凹陷 ,开始子 叶分化 (图 4 ) , 并在第 4 周完成形态发生 ,形成一个大的绿色
顶生子叶 . 在培养的中 、 后期还相继 出现大量不同发育阶段的体细胞胚 (图 5) .
培养 25 天后的观察发现 ,正 向接种的外植体有 87 %产生体细胞胚 . 三次重复实验 2 0 多个外
植体统计 ,平均每个外植体产生 18 个体细胞胚 . 没有胚胎发生的外植体几乎都来自鳞茎最外层 鳞
片 . 这层鳞片相 比之下最薄 ,组织老化程度最高 ,而且在使用前的存放期间常有一定程度的失水变
软 . 倒置接种的环形外植体上始终未见体细胞胚胎发生 .
体细胞胚可从母体组织上剥离下来 (图 7) . 培养 28 天后立即剥离比较困难 ,且容易伤及胚根
端 , 除非在基部附带一些外植体组织 . 经失水处理后体细胞胚就很容易剥离下来了 . 剥离下来的单
个胚可在无激素培养基上萌发产生再生植株 (图 6) . 剥离前失水处理的体细胞胚不仅萌发率高 (表
1 )
, 而且产生的再生植株根系完整 (图 6) . 未经失水处理的单个胚在无激素培养基上不能萌发 ,发
育程度较低的反而渐渐死去 . 如转入新鲜的诱导培养基则萌发产生无根苗 ,这些无根苗只有在含
2
· 。m g l/ N “ A 和 2 0 9 l/ 蔗糖的音M S 培养基上才能很好生根 ·
表 1 不同处理方法对体细胞胚正常萌发的促进效果狱
失水处理方法
支撑物 ! 剥离时间
剥离下来的休
细胞胚数 (个 )
萌发产生的小
植株数 (株 )
萌发率
(% )
失水处理前
湿润滤纸
失水处理后
半失水的干
旱培养基
失水处理前
失水处理后
狱在第三次试验中考查了 39 个外植休 ,其中 19 个在失水处理前剥离 , 只剥下来 17 3 个休细胞胚 ;
另 20 个在失水处理后剥下来 3 25 个休细胞胚 .
四川师范大学学报 ( 自然科学版 ) 1 7卷
本文结果表明 ,虎 眼万年青的子鳞茎鳞片组织具有很强的形态发生潜力 · 陈敏才 ( 1 9 8 4) 报道 ,
每个带有鳞茎盘的 、 长 1 . oc m 、宽 0 . sc m 的双鳞片外植体可从基部近轴面产生一至两个小鳞茎 6j[ .
在我们的试验中 ,大量体细胞胚以高频率直接发生于鳞片的环形横切段 ,并且只经一步培养就完成
发育过程 . 植物的体细胞胚直接发生已在很多双子叶和单子叶植物上诱导成功 ,如白车轴草川 、 鸭
茅草 s[] 、 香雪兰图等 , S h ar p 等 ( 1 9 8 0) 认为体细胞胚的直接发生是起源于外植体上的预存胚性决定
细胞 ( P E D C’ . )l[ 。〕 , 这个假说后来有了很大发展 ,认为只要外植体组织中存在这样的胚性细胞 ,提供
一个能刺激细胞重新启动分裂的条件 , P E D C ` : 就能分裂增殖并保持胚性状态 ,一旦在这种胚性细
胞与相邻的非胚性细胞之间形成特定的极性离子梯度或内源激素分布梯度和存在 比例 , 便可开始
体细胞胚的分化和发育 [’. ” 〕 . 本文结果可能是支持这一假说的 , 至于详细的组织学分析 , 还有待进
一步研究 .
体细胞胚胎发生的巨大应用潜力已有不少评述 [’, “〕 . 但是在许多物种上这种潜力的发挥还不同
程度地受到体细胞胚萌发困难 、 萌发率不够高的限制 . 在已经报道的促进体细胞胚正常萌发的许多
方法中 , 最简单的方法就是 G r ay 等 ( 1 9 8” 介绍的在垫了湿润滤纸的器皿中利用空气相对湿度控
制 的逐步失水处理 l[ ’ 〕 , 该方法对葡萄 l[ ’ ] 、 大豆 la[ ] 、 美洲 山核桃 l[ `〕和小麦 l5[ 〕等的体细胞胚都是有效
的 . 但是这种单纯的逐步失水处理在本试验中效果有限 ,而且与 A t er e 等 ( l ” 1) 在其预备试验 中
所得结论一样 , 必须让体细胞胚保留在母体组织上经受失水处理 l[’ 〕 .
由于单纯的失水处理效果有限 ,人们就配合使用高浓度蔗糖 、 甘露醇或聚乙烯乙二醇等 ,造成
类似于天然合子胚成熟期的渗透压环境.5[ ’ 幻 ,或用外源脱落酸人工诱导休眠 l[, ’ 司 . 这些措施的共同
点是促进体细胞胚在萌发前积累必要的贮藏物 ,并允许发育程度较低的体细胞胚继续完成其发育
进程 . 元英进等 ( 1 9 9 3) 发现 ,残余培养基对长春花培养组织和细胞具有促进贮藏物积累的明显作
用 l[ ’ 〕 . 我们的试验结果首次证明 ,将体细胞胚生长发育过程中用过的 、 已处于半失水干旱状态的残
余培养基作为支撑物 , 用于体细胞胚的失水处理 , 具有 良好的促进萌发效果 . 不少发育程度较低的
体细胞胚经过这样的失水处理后也能很容易地从母体组织上剥离下来 ,并且正常萌发 . 至于这个效
果良好的简便方法是否对其它植物具有普遍意义以及是否促进了体细胞胚内贮藏物质的积累 ,还
有待进一步研究 .
参考文献
1 刘志学 . 植物体细胞胚发生的细胞学和分子机制间题的研究进展 . 见 : 中国遗传学会编全国高校青年教师
遗传学进展报告文集 , 全国遗传学教学研讨会暨青年教师遗传学进展报告会 , 长春 : 中国遗传学会 . 1 9 9。 :
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第 3期 张光祥等 :虎眼万年青的体细胞胚胎直接发生与植株再生
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1 9 9 1 ; 6 8 : 5 1 9一 5 2 5
元英进 ,胡宗定 . 植物生理学通讯 . 1 9 9 3 ; 2 9 ( 3) : 18 5一 18 7
1人,`,JJ任巴J决Dtl1,1,1,1.
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