全 文 ：第 7 期
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（责任编辑 昌炎新）
收稿日期：2009－06－04
基金项目：湖北省自然科学基金项目（2006ABA002）；湖北省科技攻关项目（2006AA201C59）
作者简介：陈双建（1983－），男，湖北巴东人，在读硕士研究生，研究方向为分子生物学与生物化学；通讯作者，李亚男，副教授，硕士生导师，
（电话）13972378818（电子邮箱）yananlee＠yahoo．com．cn。
第 48 卷第 7期
2009 年 7月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.7
Jul．，2009
薏苡丙酮酸脱羧酶 1（PDC1）基因片段 cDNA克隆
与分析
陈双建，陈大清，李亚男
（长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）
摘要：参考水稻、玉米的 PDC1 蛋白保守序列以及甘蔗的 PDC 基因片段，设计 1 对简并引物，从薏苡中
克隆了 PDC 基因片段。 经测序和在 NCBI 数据库进行序列相似性搜索，结果表明，该序列与甘蔗 PDC 基
因同源性为 96％，与玉米 PDC3 和水稻 PDC2 同源性分别为 94％和 90％，推测该序列为薏苡 PDC1 基因
片段。
关键词：薏苡；丙酮酸脱羧酶 1（PDC1）；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号：Q781；S519 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）07－1543-03
cDNA Cloning and Analysis of the Pyruvate Decarboxylase 1 Gene Fragment
from Coix lacrymajobi
CHEN Shuang－jian，CHEN Da－qing，LI Ya－nan
（College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）
Abstract： A pair of degenerate primers were designed to amplify the PDC1 gene fragment from Coix lacrymajobi by referenc-
ing the conservative sequence of the PDC1 protein from Oryza sativa，Zea mays and the DNA fragment of PDC in Sarrcharym
officinarum． The homology search was made in the NCBI database after the fragment had been sequenced． The results
showed that the sequence had a homologous of 96％ to that of Sarrcharym officinarum，it also had a homologous of 94％ to
the PDC3 in Z． mays and a homologous of 90％ to the PDC2 in O． sativa． It was speculated that the sequence was most
probably the PDC1 gene fragment of C． lacrymajobi L．
Key words： Coix lacrymajobi L； pyruvate decarboxylase 1（PDC1）；gene cloning；Bioinformatics analysis
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2009.07.044
湖 北 农 业 科 学 2009 年
厌氧条件下植物有氧呼吸受到抑制，乙醇发酵
途径可以作为一种代谢拯救途径，这是植物厌氧条
件下的代谢适应［1，2］，丙酮酸脱羧酶处于这一途径的
关键部位 ， 对于植物耐受低氧有重要作用 。
Kursteiner 等报道了乙醇发酵途径中的 PDC 基因在
淹水胁迫中的作用 ［3］，他们通过实时荧光定量 PCR
在拟南芥中分析发现，在正常生长情况下，当拟南
芥遭受低氧胁迫时，PDC 基因大量表达， 但是 PDC
基因家族中只有 PDC1 基因受到诱导表达。 进一步
通过拟南芥 PDC1 功能缺失分析表明， 缺失突变体
对低氧胁迫失去抗性，但是对其他非生物胁迫仍具
有抗性。 Dolferus在拟南芥中的研究也表明，参与发
酵的 PDC 基因在低氧胁迫下会大量诱导表达 ［4］；
Shiao 等的研究表明， 超表达 PDC 基因能显著提高
拟南芥根系对低氧的耐受性［5］。由此可见，发酵途径
是植物耐受低氧胁迫的一种重要代谢适应方式。 薏
苡是典型的湿生植物，具有明显的耐渍特性，我们
从薏苡中克隆 PDC基因片段，将有助于该基因的全
长克隆和功能分析，同时对开拓丰富的耐涝基因资
源，阐明作物耐涝分子机制以及通过转基因技术培
育耐涝作物新品种奠定必要的理论和工作基础。
1 材料与方法
1．1 材料
薏苡（Coix lacrymajobi L）种子，由长江大学生
命科学学院植物发育分子生物学实验室保存。
薏苡种植参考陈成斌等［6］的方法并作适当修改，
首先采用 0．2 mol·L－1硝酸溶液浸泡薏苡种子 24 h，
然后用清水冲洗 30 min， 播种于蛭石培养基质上，
种子发芽后浇洒 1 ／ 2 MS 培养液。三叶一心时，拔取
长势旺盛的薏苡苗进行淹水处理。
1．2 总 RNA的提取
取淹水处理的薏苡根尖为材料， 采用 Trizol 法
提取 RNA， 试验步骤按照 Trizol 试剂盒说明书进
行 ； 分装于－70℃保存 ，2％琼脂糖凝胶电泳检测
RNA质量，紫外分光光度计测 OD260 ／ OD280值检测纯
度。
1．3 cDNA第一链合成及 PCR扩增
用 3 μL 总 RNA 为模板， 采用 M－MLV 酶反转
录合成 cDNA 第一链， 试验步骤按照说明书进行。
用设计的简并引物对 cDNA 模板扩增，50 μL 反应
体系如下： 模板 cDNA，10 μL；Buffer，5 μL；Mg2＋，3
μL；dNTP，0．75 μL；上游简并引物，2．5 μL；下游简并
引物，3．75 μL；Taq酶，0．5 μL；灭菌双蒸水，24．5 μL。
反应程序如下：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，
56℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，30 循环 ；72℃ 10
min；4℃保存。
1％琼脂糖电泳检测产物，Axygen 凝胶回收试
剂盒回收目的产物，试验步骤按照凝胶回收试剂盒
说明书进行。将回收产物连接 pMD－18 T vector，转
化大肠杆菌 DH5α，在 含 50 μg·mL－1氨苄青霉素的
LB 平板上筛选阳性菌落， 序列测定由上海生工完
成。
1．4 引物设计
参考与薏苡亲缘关系较近的水稻（Oryza sativa
L.）和玉米（Zea mays L.）的 PDC1 蛋白保守序列，以
及甘蔗 （Saccharum officinarum L.）的 PDC 基因片
段， 借助 Primer5．0 和 Oligo6．0 等软件设计简并引
物。
1．5 试剂
dNTP，Taq DNA 聚合酶购自博大泰克公司 ，
pMD－18 T vector 购自 TaKaRa公司，Trizol RNA提
取试剂盒购自 Invitrogen 公司，M－MLV 逆转录酶，
Axygen 凝胶回收试剂盒。 其他试剂均为国产分析
纯。
1．6 仪器
扩增用 PCR仪为 ABI公司生产的 2720型。
2 结果与分析
2．1 RNA提取
RNA电泳如图 1 所示。由图 1 可以清晰地看出
5S、18S，28S 3 条带，18S、28S 两条带轮廓清晰，且
28S亮度约为 18S 的 2 倍，点样孔没有杂质，说明所
提取 RNA 完整性较好，纯度较高，能满足基因克隆
要求。
2．2 简并引物扩增 PDC基因
根据设计的简并引物推测目的序列的长度在
450～500bp， 由扩增产物的电泳图 （图 2） 看出，在
470bp处有非常特异的扩增产物带， 初步推测是目
的基因片段。 将其回收转化，随机挑取 10个克隆进
行 PCR检测，结果如图 3 所示，有 8 个为阳性克隆。
将这些阳性克隆送上海生工测序 ， 测序结果在
图 1 总 RNA 电泳图
1544
第 7 期
NCBI 数据库进行序列相似性搜索， 表明克隆的序
列与甘蔗 PDC基因相似度最高为 96％，与玉米和水
稻 PDC1基因家族成员同源性也在 90％以上， 暗示
我们可能获得了薏苡 PDC1 基因片段（表 1）。 下一
步我们将应用分子杂交进行验证，在此基础上应用
RACE技术克隆薏苡 PDC基因全长。
3 结论
我们应用 Blast 在线比对发现， 从薏苡中克隆
的序列与甘蔗 （S． officinarum）、玉米 （Z． mays）、稗
（Echinochloa crus －galli var． formosensis）和籼稻
（O． sativa indica）的 PDC 基因家族的基因序列或片
段的最大相似度均超过 90％ 以上。应用 MEGA 4．0
软件，采用邻接（NJ）法依据蛋白质和 DNA 序列构
建了分子进化树（图 4 和图 5），推演的进化地位显
示，我们克隆的薏苡 PDC1 基因与水稻 PDC2、玉米
PDC3 基因三者间都有很高的亲缘性， 暗示我们可
能获得了薏苡 PDC1基因的片段， 这为我们克隆该
基因的全长奠定了基础。
参考文献：
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（责任编辑 王贵春）
M 为 DNA 分子量标准（DL2000）；1 为扩增产物
图 2 目的片段电泳图
M 1
M 为分子量标准（DL2000）；1－10 为 10 个不同的单克隆菌落
图 3 PCR 检测质粒
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PDC 基因片段所属物种
甘蔗（S. officinarum）PDC 片段（AJ251246）
玉米（Z. mays）PDC2 基因（EU970907)
玉米（Z. mays）PDC3 基因（AF370005）
稗(Echinochloa crus-galli var. formosensis)
PDC 片段（AF497855）
籼稻（O. sativa indica Group）PDC2 基因（U27350）
粳稻（O. sativa japonica Group）PDC2 基因（EU267985）
表 1 薏苡与几个亲缘关系相近物种的 PDC 基因相似度
最大相似度/%
96
94
94
92
90
89
图 4 水稻、玉米、拟南芥和薏苡 PDC 基因家族系统进化树
C.lacrymajobil PDC1
Z.mays PDC3
O.sativa PDC2
Z.mays PDC2
A.thaliana PDC2
A.thaliana PDC1
A.thaliana PDC3
O.sativa PDC3
O.sativa PDC1
Z.mays PDC1
0.02
92
97
61
90
88
48
94
图 5 水稻、玉米、拟南芥和薏苡 PDC 蛋白系统进化树
C.lacrymajobil PDC1
Z.mays PDC3
O.sativa PDC2
Z.mays PDC2
A.thaliana PDC2
A.thaliana PDC1
A.thaliana PDC3
O.sativa PDC3
O.sativa PDC1
Z.mays PDC1
0.02
92
94
59
65
92
97
96
陈双建等：薏苡丙酮酸脱羧酶 1（PDC1）基因片断 cDNA 克隆与分析 1545