全 文 ：2008年第 1期 Vol.22 No.1植物检疫 PLANT QUARANTINE
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使用起始剂量48 g/m3 ，处理时间13 h，对遭受虫
害木材的表面和内部（顺着木纹，距离尾部5cm、
10cm和15 cm处）及熏蒸箱内的不同虫态几乎所有
害虫均可杀灭。
参考文献
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and Protection. 1984. 54.
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进境碱茅上腥黑粉菌新记录的初步研究*
黄国明　罗加凤　刘　勇　廖　芳　刘跃庭　崔铁军
（天津出入境检验检疫局　300456）
Preliminary study on a new record of Tilletia species on Puccinellia distans. Huang Guoming, Luo Jiafeng, Liu
Yong, Liao Fang, Liu Yueting, Cui Tiejun (Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin, 300456)
Abstract Most of reticulate-spored species of Tilletia are the causal agents of grass seed bunt of the Gramineae. We
intercepted the bunted seeds in Puccinellia distans from the US in 2004. It was a new record of Tilletia species on
Puccinellia distans, and there is no related research report about this new record. This paper discussed the taxon of
this new record of bunt fungus based on morphology of teliospore physiological character of its germination, and the
analysis of ITS and IGS sequences. The results showed that this new record of bunt fungus is more closely related
to T. bromi among the genus Tilletia and a putative new species of Tilletia.
Key words Puccinellia distans, Tilletia, teliospore, morphology, germination, sequence alignment
摘要　腥黑粉菌主要侵染禾本科植物。2004年曾从来自美国的碱茅草种中检出一种腥黑粉菌，是碱茅
上腥黑粉菌的新记录，迄今国内外尚无其相关研究的报道，本文从冬孢子形态、萌发生理特性及基因序列比
较等几方面对该菌进行了初步研究，讨论了该菌的分类地位，根据研究结果，该菌与Tilletia bromi具有较
近的亲缘关系，为腥黑粉菌潜在新种。
关键词　碱茅 腥黑粉菌 冬孢子 形态学 萌发 序列比对
中图分类号　S432.4，S 1-32
*本研究由国家质检总局课题（2004IK037）和科技部“十一五”检验检疫专项课题（2006BAK10B06）资助。
收稿日期：2007-08-20
碱茅是禾本科多年生草本植物，具有抗寒、耐
旱、耐盐碱特性，在世界干旱及盐碱地区广泛种植，
是开发改造盐碱地的优良生态型牧草，具有可观的
生态效益、经济效益和社会效益，近年来在国内得
到大力推广，全国已有10多个省市栽培种植，在我
国东北、西北、华北有野生分布。2004年，作者从
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来自美国的草种碱茅 [Puccinellia distans（weeping
alkaligrass）]中截获一种腥黑粉菌，查证文献资料，
国内外尚无腥黑粉菌侵染碱茅的报道。本研究从病
原菌形态特征、萌发生理特性及ITS和IGS基因序
列等方面对该碱茅上腥黑粉菌新记录进行了初步研
究。
1　材料
试验用的材料来自美国进境碱茅中检出的菌瘿。
引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR
扩增相关试剂均为大连宝生物（TaKaRa）工程公司
产品。采用上海生工基因组DNA纯化试剂盒（编号
SK1252）提取菌丝DNA。
2　方法
2.1　菌瘿检查
碱茅种子个体较小，健康种子和菌瘿通过肉眼
较难区别，在体视解剖镜冷光源下检查菌瘿。
2.2　形态测定
用解剖针刺破菌瘿，挑取少许冬孢子置于滴有
席尔氏液的玻片上，放置12h后，100倍油镜下测定。
2.3　萌发试验
在Eppendorf离心管中加入适量0.25%的次氯酸
钠溶液，挑取一定数量的冬孢子放入，用涡旋振荡器
混和，消毒50s后，以3000r/min离心1 min，立即
用微量加样器吸去上清液，混和与离心处理时间不
超过3min，加无菌水离心清洗2次，将冬孢子沉淀
物转至3%水琼脂平板上培养，每一培养温度重复3
个培养皿。培养条件：5℃、10℃、15℃、20℃，连
续光照。
2.4　ITS和IGS的序列同源性分析
培养20d的菌落，用无菌水冲洗至PDA上15℃，
光照下继续培养30~45d后，将菌落挑出，置-70℃
下备用。提取基因组DNA，并进行ITS和IGS基因
序列的扩增、测序和序列比对。
3　结果
3.1　病原菌形态特征
腥黑粉病病菌侵染的碱茅种子被病菌粉状冬
孢子代替形成菌瘿，菌瘿较健康种子粗短、饱满，
长×宽为0.5～0.7mm×0.9~1.3mm，两端通常残
留种柄，外被一层薄且易碎的寄主果皮，暗灰色、
褐色或黑褐色，冬孢子堆深褐色或黑褐色（见封底
图1）。各菌瘿间冬孢子形状差异较大，冬孢子一
般球形、椭圆形，也有不规则多角形，黄棕色至棕
黑色，直径21~28µm，大多23~26µm，胞壁文饰
网状，网脊较密，锥状或刺状，高0.8~2.1µm，平
均1.2~1.6µm；网目细小，少数孢子网目脑纹状，
冬孢子直径上网目5~12个，平均7~8个；不孕孢
无色或淡黄色，12~18µm，壁厚1.2~1.6µm（见封
底图2、3）。
3.2　萌发特性
4个温度下冬孢子萌发情况各不相同，最适温度
为10℃，培养7d开始萌发，萌发高峰期在培养后10d
左右，最高萌发率可达60%，5℃也可萌发，但时间
推迟且徒长较多，15℃仅有极个别孢子萌发，20℃
下不能萌发，不同温度下冬孢子萌发情况见表1。萌
发时初生担孢子较细长，8~24个，“H”型结合普遍
存在，次生担孢子新月形（见封底图4）。
表1　不同温度下冬孢子萌发情况
培养温度
萌发项目 5℃ 10℃ 15℃ 20℃
起始萌发时间 10d 7d 15d —
萌发高峰时间 15d 10d — —
最高萌发率(%) 42~55 45~60 0.1~1—
萌发状态 部分徒长， 正常萌发， 徒长 —
不产生担孢子 产生担孢子
3.3　ITS和IGS基因序列同源性比对结果
对与碱茅腥黑粉菌形态上相似的Tilletia属部分
种类的ITS和IGS基因序列进行了扩增和序列测定，
ClustalX同源性比对，结果表明碱茅上的腥黑粉菌与
雀麦腥黑粉菌T. bromi较为相近（另文发表）。
4　讨论
腥黑粉菌属主要依据形态学、萌发生理、细胞
学诸方面的特性及寄主专化性这些传统方法进行分
类，近年来，随着分子生物学技术的不断发展，各
国研究者应用分子生物学技术结合传统分类方法对
腥黑粉菌属进行了深入研究，新的腥黑粉菌种类相
继被发现。1988年Guillemette[1]用细胞学方法分析
担孢子中细胞核数目并结合寄主专化特性，将采自
反曲早熟禾Poa reflex上的腥黑粉菌从分类争议较
多的综合种T. fusca中独立出来定为新种T.
togwatii。1998年Boyd和Carries[2，3]从寄主专化性、
分子生物学及细胞学三方面阐述了侵染Vulpia的专
化型和侵染Bromi的专化型的不同，建议将综合种
T. fusca分为两个独立的种，即侵染Vulpia
microstachys和Vulpia octoflora 的T. fusca；侵染
Bromi、Festuca、Nardurus、Ventenata和Vulpia属
其它种的T. bromi。近年来，PCR方法应用最成功
的例子是将黑麦草中与小麦印腥（T. indica）相近
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的腥黑粉菌区分开，确立了新种 T. walkeri [4、5],从
而解决了困扰小麦和草种的国际贸易难题。作者
2003年从美国紫羊茅中、2003年和2005年分别从
澳大利亚和德国多年生黑麦草种子中截获一种腥黑
粉菌，与黑粉菌专家美国华盛顿州立大学Lori M.
Carris 及美国农业部农业研究局Lisa A. Castlebury
进行了共同研究，证实为新种，将在近期发表。
经查阅国内外文献资料均无碱茅上被腥黑粉菌
侵染的相关研究报道[6～10]，证实该种腥黑粉菌在碱
茅上是新记录，初步研究结果是：该菌从形态上与
小麦矮腥黑穗病菌（T. controversa）、雀麦腥黑粉菌
（T.bromi）相似；冬孢子萌发生理与T.bromi相似。
ITS和IGS序列同源性比对结果与形态学和冬孢子
萌发生理特性研究结果相符合。根据形态、萌发生
理及序列同源性的初步研究，认为该菌可能是
Tilletia属一新种，但还需进一步开展致病性及寄主
范围的研究。
参考文献
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大豆疫霉卵孢子微量、快速检测方法的建立
秦国勋　张　睿
（连云港出入境检验检疫局　222042）
The detection techniques for the tittle zoospores of Phytophthora sojae Quicklys. Qin guoxun, Zhang Rui
(Lianyungang Enter-Exit Inspection and quarantine Bureau, Lianyungang,222042)
Abstract The zoospores of Phytophthora sojae inoculated artificially in the soil are gathered with molecular sieves,
while inoculating to measure to 104, 103, 102, 101 and 100 as a result, enrich to gather percentage respectively for 45.9%,
39.6%, 11.8%, 1.7%, 5.6%. After the glass plates are used to crush the tittle zoospores, a PCR technique used to detect
quickly DNA in the tittle zoospores. While distilling DNA in 10, 5 or 1 zoospore, success rate of PCR-amplification is
83.3%, 33.3% or 0. When distilling DNA in 10 zoospores carried on PCR-amplification, 2 repeat appeared a nonspe-
cific PCR products.Restriction enzyme Msp I can digest specific PCR products into a 204 bp and 124 bp two parts;
Restriction enzyme Rsa I can digest specific PCR products into a 242 bp and 86 bp two parts.
Keyword the zoospores of Phytophthora sojae, molecular sieves, enrichment, PCR technique, detecting quickly,
Restriction enzyme digestion
摘要　采用套筛富集人工接种于土壤中的大豆疫霉卵孢子。结果表明，当接种量为104、103、102、101、
100时，富集百分率分别为45.9%、39.6%、11.8%、1.7%、5.6%。采用玻片压碎法提取微量卵孢子中DNA
后，采用PCR技术快速进行检测的结果表明，提取10，5，1个卵孢子中DNA进行PCR扩增成功率分别为
83.3%、33.3%、0。提取10个卵孢子中DNA进行PCR扩增时，2个处理出现非特异性PCR产物。内切酶
Msp I能将特异性PCR产物消化为204bp和124bp两个片段；内切酶Rsa I能将特异性PCR产物消化为242bp
和86bp两个片段。
收稿日期：2007-05-21