全 文 ：山 东 农 业 科 学 2015，47(6):93 ～ 96 Shandong Agricultural Sciences
DOI:10． 14083 / j． issn． 1001 － 4942． 2015． 06． 022
收稿日期:2015 －03 －23
基金项目:国家“863”计划资助项目(2011AA10A206)
作者简介:李健(1986 －) ，男，助理研究员，博士。E － mail:lijian910@ 163． com
* 通讯作者:李美，研究员。E － mail:limei9909@ 163． com
马唐生防真菌 ZC201301 的筛选及其致病力测定
李健，李美* ，高兴祥，房锋
(山东省农业科学院植物保护研究所 /山东省植物病毒学重点实验室，山东 济南 250100)
摘 要:从发病马唐叶片上分离得到菌株 ZC201301，对其培养特征和 16S rDNA序列比对分析后，确认该
菌株为厚垣孢镰刀菌。盆栽试验表明，该菌株分生孢子液对马唐有很好的防治效果，鲜重防效达 90． 2%;对
反枝苋、播娘蒿效果也较好，鲜重防效分别达到 72． 8%和 50． 7%;但对狗尾草和稗草防效较差，仅为 27． 9%和
30． 0%。进一步分析表明，菌株 ZC201301 对马唐的致病力受接种孢子浓度、接种温度等因素影响。作物安全
性试验表明，该菌株分生孢子液对小麦、大豆、玉米均相对安全。以上结果表明，菌株 ZC201301 有开发为生
物除草剂的潜力。
关键词:厚垣孢镰刀菌;ZC201301;生物防治;马唐;作物安全性
中图分类号:S476． 12 文献标识号:A 文章编号:1001 －4942(2015)06 －0093 －04
Isolation and Pathogenicity Detection of Biological
Control Fungi ZC201301 to Digitaria sanguinalis
Li Jian，Li Mei* ，Gao Xingxiang，Fang Feng
(Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences /
Shandong Key Laboratory of Plant Virology，Jinan 250100，China)
Abstract Strain ZC201301 was isolated from diseased Digitaria sanguinalis leaves． According to its
culture characters and 16S rDNA sequence analysis，the strain was identified as Fusarium chlamydosporum．
The pot experiment showed that the fresh weight control effects of conidium liquid on Digitaria sanguinalis，
Amaranthus retroflexus，Descuminia Sophia were better，which were 90． 2%，72． 8%，50． 7% respectively．
The control effects on Setaria viridis and Echinochloa crusgalli were only 27． 9% and 30． 0% ． The further a-
nalysis showed that the pathogenicity of strain ZC201301 to Digitaria sanguinalis was limited by spore concen-
tration，inoculation temperature and other factors． The crop safety analysis showed that the strain ZC201301
was safe to Triticum aestivum，Glycine max，Zea mays． In summary，the ZC201301 might be a potential mi-
crobial herbicide．
Key words Fusarium chlamydosporum;Biological control;Digitaria sanguinalis;Crop safety
马唐(Digitaria sanguinalis)是世界上公认的
分布广泛的 18 种恶性杂草之一［1］，主要危害小
麦、大麦、玉米、水稻、高粱等禾本科作物，也是蔬
菜田常见的主要杂草［2］;马唐环境适应能力强，
生长迅速，消耗地力，目前主要依赖人工和化学防
除［3］;在中国，由马唐引起的作物损失占秋熟旱
作粮田杂草总损失的一半以上［4］。
近年来，化学除草剂的长期使用引起抗性杂
草的产生和环境污染，同时伴随人们环保意识逐
渐增强，对农药残留低的绿色食品的需求越来越
高［5］。因此，研制生物除草剂进行目标杂草的防
除，已成为生产上的迫切需求。我国生物除草剂
研制时间较早，20 世纪 60 年代中期研制并推广
的“鲁保 1 号”菌剂对当时大豆菟丝子的防治起
到了重要作用［5］。近年来，我国杂草研究机构在
马唐 －画眉草弯孢［6］、稗草 －新月弯孢［7］、阔叶
杂草 －出芽短梗霉［8］等菌草体系的研究中取得
了进展，但目前我国生物除草剂登记产品仍然较
少，而全世界已经开发的生物除草剂产品已经有
20 余种［9］。
微生物除草剂应具备对目标杂草强致病性和
对作物安全两大特点［10］。但是微生物除草剂在
使用过程中又受到来自于环境条件的限制，往往
只能在一定的环境范围和区域内发挥防治作用。
本实验室于 2013 年对山东省主要杂草病原真菌
进行调查和分离，并从采自济南的感病马唐叶片
上分离得到 1 株具有强致病力的菌株 ZC201301
(专利公开号:CN104250620A)，对其进行形态学
和分子生物学鉴定、生防效果和作物安全性评估，
以期为其进一步深入研究提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试植物:马唐(Digitaria sanguinalis)、反枝
苋(Amaranthus retroflexus)、播娘蒿(Descuminia so-
phia)、狗尾草(Setaria viridis)和稗草(Echinochloa
crusgalli)等杂草种子均为本实验室采集并保存。
玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)和小麦
(Triticum aestivum)种子均购自种子公司。
试剂与培养基:次氯酸钠、CTAB、氯仿·异戊
醇、吐温 80 等购自上海生物工程有限公司;Taq
酶等 PCR 相关试剂购自日本 Takara 公司。马铃
薯葡萄糖琼脂培养基 (potato dextrose agar，
PDA):马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 18 g、水
1 000 mL。
1． 2 病原菌的分离纯化
从山东省济南市采集感病的马唐叶片，放于
信封内，直接用于病原菌分离或 4℃保存。剪下
病叶的病健结合部位，无菌水冲洗 2 次，2%
(V /V)次氯酸钠溶液表面消毒 6 min，70%
(V /V)乙醇表面消毒 1 min，无菌水漂洗 3 次后将
这些叶片组织转移到空的灭菌培养皿内，以上步
骤均在超净工作台内完成。待叶片组织吹干后置
于 PDA培养基上，25℃培养箱培养至长出菌落，
挑取部分菌丝至新的 PDA培养基内培养至产孢，
经过单孢子分离得到菌株，并编号。
1． 3 菌株的鉴定
将菌株 ZC201301 在 PDA 平板上培养 10 d，
观察其菌落形态。同时洗下分生孢子，显微镜下
观察，按照真菌鉴定手册进行初步鉴定［11］。
CTAB法［12］提取菌株的基因组 DNA，用引物 ITS4
(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3)和 ITS5 (5
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3)进行 PCR 扩
增。PCR 反应条件为:94℃预变性 4 min;94℃变
性 1 min，53℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 29
个循环;最后 72℃延伸 10 min。将 PCR 产物回
收测序。利用 NCBI Blast对所测序列进行比对分
析，利用 Clustal X 2． 0 和 Mega 6 软件构建系统发
育树。
1． 4 ZC201301 菌株致病力影响因素测定
25℃、光 照 /黑 暗 12 h /d 交 替 条 件 下，
ZC201301 菌株在 PDA 培养基上培养 14 d 后，收
集孢子并配制成浓度为 1 × 108 个 /mL 的孢子悬
浮液(含 0． 1%吐温 80)。
将浓度为 1 × 108 个 /mL 和 1 × 105 个 /mL 的
孢子悬浮液用手持小喷壶分别喷施于 2 ～ 3、4 ～ 5
叶期的马唐植株上，黑暗条件下放于不同温度和
湿度人工气候箱内 48 h，之后持续光照条件下培
养，14 d后记录致死株数和称量植株鲜重，计算
鲜重防效，以喷施 0． 1%吐温 80 的植株为对照，
每处理重复 3 次。
1． 5 寄主范围测定
收集并配制浓度为 1 × 108 个 /mL 的孢子悬
浮液喷施于 2 ～ 3 叶期反枝苋、播娘蒿、狗尾草、稗
草(以上杂草种子均采自山东省济南市)等杂草
上;25℃、黑暗保湿培养 48 h，之后持续光照培养。
接种 14 d 后记录发病程度和鲜重防效，以喷施
0． 1%吐温 80 的植株为对照，每处理重复 3 次。
1． 6 ZC201301 作物安全性测定
培养 ZC201301 菌株并收集分生孢子，将浓
度为 1 × 108 个 /mL的孢子悬浮液喷施于 3 ～ 4 叶
期的小麦、大豆、玉米植株上，培养方法同 1． 5。
接种 14 d 后记录发病程度和鲜重防效。参考李
永龙文献［8］，按以下标准记载发病程度:NS 表示
无症状(一直无病斑，植株正常生长);LS 表示有
轻微反应(初期叶片分布零星斑点，14 d 后鲜重
49 山 东 农 业 科 学 第 47 卷
不受抑制);MS 表示中等感病(叶面出现较多病
斑，14 d后鲜重受到抑制);SS 表示严重感病(叶
片病斑连成一体，14 d后鲜重受到严重抑制)。
2 结果与分析
2． 1 病原菌的分离与鉴定
ZC201301 菌株在 PDA 培养基上培养 10 d
后，菌落质地紧密，边缘规则，呈厚絮状，生长初期
呈白色，逐渐产生粉红色色素。培养过程中产生
两种孢子，一种为镰刀形大孢子，一种为类椭圆形
厚垣孢子。提取基因组 DNA，克隆 16S rDNA 基
因序列，回收测序后进行序列分析。表型观察和
系统发育树(图 1 )分析表明，ZC201301 菌株为
厚垣孢镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)。
图 1 ZC201301 进化树分析
2． 2 保湿时间和接种浓度对致病力的影响
由表 1 可以看出，湿度对菌株 ZC201301 影响
较大，喷接相同浓度孢子液，90%湿度下马唐受抑
制率明显高于 40%湿度条件下。而在相同湿度
条件下，喷施不同浓度孢子液的马唐受抑制率存
在一定差别，但是差异不显著(P ＜ 0． 05)。
表 1 湿度和接种浓度对菌株 ZC201301
致病力的影响
湿度
(%)
1 × 105 个 /mL
致死率(%) 鲜重防效(%)
1 × 108 个 /mL
致死率(%) 鲜重防效(%)
90 30． 1 ± 11． 1b 86． 7 ± 4． 1a 45． 2 ± 5． 2b 90． 2 ± 1． 4a
40 15． 2 ± 6． 2b 41． 6 ± 6． 8a 17． 8 ± 2． 8b 51． 5 ± 0． 7a
注:表中数值为平均值 ±标准误(n = 3)，同行数据后不同字
母表示在 0． 05 水平上差异显著。
2． 3 接种温度和接种时期对致病力的影响
由表 2 可以看出，菌株 ZC201301 对马唐的致
病力受接种时期和温度影响较大。相对于 22℃
的接种条件，30℃下菌株 ZC201301 对相应叶期
的马唐防效均显著下降。而在相同接种温度下，
菌株 ZC201301 对 2 ～ 3 叶期马唐的防效要远好于
4 ～ 5 叶期马唐。
表 2 接种温度和时期对菌株 ZC201301
致病力的影响
温度
(℃)
2 ～ 3 叶期
致死率(%) 鲜重防效(%)
4 ～ 5 叶期
致死率(%) 鲜重防效(%)
22 43． 2 ± 3． 2a 88． 6 ± 2． 9a 18． 7 ± 2． 3a 68． 4 ± 5． 7a
30 28． 5 ± 5． 1b 80． 2 ± 2． 1b 3． 6 ± 3． 3b 27． 9 ± 4． 8b
注:表中数值为平均值 ±标准误(n = 3)，同列数据后不同字
母表示在 0． 05 水平上差异显著。下同。
2． 4 菌株 ZC201301 对不同杂草致病力分析
菌株 ZC201301 孢子液喷施 2 ～ 14 d 后对反
枝苋、播娘蒿、狗尾草、稗草的平均鲜重防效分别
达到 72． 8%、50． 7%、27． 9%、30． 0%，对反枝苋
防效最好，播娘蒿次之，二者之间差异显著，均显
著优于狗尾草和稗草(表 3)。
表 3 菌株 ZC201301 对不同杂草的生物防效
杂草种类 致死率(%) 鲜重防效(%)
反枝苋 Amaranthus retroflexus 49． 6 ± 3． 4 72． 8 ± 1． 3a
播娘蒿 Descuminia sophia 0 50． 7 ± 2． 6b
狗尾草 Setaira viridis 10． 7 ± 5． 0 27． 9 ± 2． 7c
稗草 Echinochloa crusgalli 0 30． 0 ± 5． 3c
2． 5 作物安全性分析
试验结果(表 4)表明，菌株 ZC201301 孢子液
对供试作物相对安全，大豆(中黄 57、鲁豆 10)和
小麦(济麦 22、山农 15 号)无致病性(NS)，玉米
(鲁单 981、登海 6702)表现为轻微反应(LS)，接
种初期叶片可见少量黑点，14 d 后病斑未增多或
扩展，鲜重未受到抑制。
表 4 作物安全性试验
作物种类 株高抑制率(%) 感病程度
大豆
中黄 57 0 NS
鲁豆 10 0 NS
小麦
济麦 22 0 NS
山农 15 号 0 NS
玉米
鲁单 981 3． 5 ± 2． 2 LS
登海 6702 4． 3 ± 1． 9 LS
3 讨论与结论
随着人们生态意识的增强，微生物除草剂逐
渐成为当前除草剂研制和开发的热点［13］。本试
验菌株 ZC201301 是从当地罹病马唐植株上采
得，未经任何基因修饰，环境适应性强，使用时不
会造成生态环境的隐患。经培养观察和分子生物
59第 6 期 李健，等:马唐生防真菌 ZC201301 的筛选及其致病力测定
学鉴定，将该菌株归为厚垣孢镰刀菌。该菌在
PDA培养基上易于培养，产生紧密、呈厚絮状菌
落。该菌株生长温度范围广，生长速度快，产孢量
高，具备开发为杂草生防菌的基础条件。
不同于化学除草剂，真菌除草剂对环境条件的
要求较为苛刻［14］。室内生测试验表明，菌株
ZC201301对马唐的致病力受到湿度的影响，在接
菌后湿度为 90%条件下，其对马唐的鲜重防效达
到 90． 2%;而在湿度为 40%条件下仅为51． 5%;相
对于湿度对菌株 ZC201301 致病力的影响，接种孢
子液浓度对其致病力影响较小。这表明菌株
ZC201301孢子致病力较强，仅需在较低的浓度下
就能达到防治效果，但是其致病力的发挥需要较高
的湿度条件，受到一定环境因素的限制。进一步的
研究显示，菌株 ZC201301对接种温度有较高要求，
相对于 30℃条件，22℃接种条件下生防效果更佳;
相同接种温度下，对 2 ～ 3 叶期马唐防效明显好于
4 ～5叶期。这可能是由于高温条件下马唐生长较
快，而菌种产生致病效果需要一定时间，这在一定
程度上限制了菌株生防效果的发挥。同时作物安
全性试验表明该菌株对小麦(济麦 22)、大豆(中黄
57)和玉米(鲁单 981)安全，表明该菌有望作为生
物除草剂候选菌。
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