全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 1期，第 10-14页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.1, 10-14
研究报告
Research Report
碱茅(Puccinellia tenuifolra) Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达
吴建慧 1 高野哲夫 2 柳参奎 1*
1东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心,哈尔滨, 150040; 2东京大学亚洲生物资源环境研究中心,东京, 188-0002,日本
*通讯作者, shenkuiliu@nefu.edu.cn
摘 要 从碱茅根 cDNA文库分离得到 Put-Cu/Zn-SOD全长 cDNA，其序列全长为 2 700 bp，该基因的开放
读码框为长 615 bp，所编码的蛋白由 204个氨基酸组成，其预测分子量约为 20.6 kD、理论等电点约为 5.63。
Put-Cu/Zn-SOD氨基酸序列与水稻 Cu/Zn-SOD序列有较高的同源性为 87%。将 Put-Cu/Zn-SOD基因构建到
酵母表达载体 pYES2，并转化至酵母(INVSc1)。对 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验。
结果表明：重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照(pYES2转化酵母)，结果显示了碱茅的 Cu/Zn-SOD基因
在酵母表达中，具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力。
关键词 碱茅, Cu/Zn-SOD基因,酵母,抗逆性
Cloning of a Cu/Zn Superoxide Dismutase Gene from Puccinellia tenuifolra
and its Expression in Yeast
Wu Jianhui 1 Takano Tetsuo 2 Liu Shenkui 1*
1 Alkali Soil Natural Environmental Science Center (ASNESC), Stress Molecular Biology Laboratory, Northeast Forestry University, Harbin, 150040;
2 Laboratory of Environmental StressTolerance Mechanism, Asian Natural Environmental Science Center (ANESC), University of Tokyo, Tokyo,
188-0002, Japan
* Corresponding author, djinyou@sina.com
Abstract The full sequence of cDNA sequence of Cu/Zn-SOD gene was cloned from Puccinellia tenuifolra. The
Cu/Zn-SOD gene is 2 700 bp in length. It has an open reading frame (ORF) of 615 bp, encoding a protein of 204
amino acid residues, with protein molecular weight of 20.6 kD and isoelectric point of 5.63. The similarities between
the Cu/Zn-SOD from Puccinellia tenuifolra shared the highest similarities (87%) in amino acid sequence with that
from maize. The Cu/Zn-SOD gene was transformed into yeast cells (saccharomyces cerevisiae) for expression. The
recombinant yeast INVSc1 (harboring ppYES2-SOD) and control INVSc1 (harboring empty pYES2) were treated
with salt and oxidation stresses. The results revealed that the recombinant yeast cells have a higher stress resistance
than control cells. It also proved that the Cu/Zn-SOD from Puccinellia tenuifolra has the ability of salt and oxidation
resistance.
Keywords Puccinellia tenuifolra, Cu/Zn-SOD gene, Yeast, Stress resistance
基金项目：本研究由国家 863计划(2002AA241111)和黑龙江省杰出青年基金(JC200609)资助
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是
一种含金属的抗氧化酶，在植物界普遍存在而且具
有多种类型。1938年，它以血铜蛋白的形式从牛的
血红细胞中被分离出来从而被发现，直到 1969年，
McCord和 Fridovich才揭示了 SOD的生物学功能。
SOD对于清除氧自由基，防止氧自由基破坏细胞的
组成、结构和功能，保护细胞免受氧化损伤具有十
分重要的作用。SOD按其结合的金属离子的不同，
主要可分为 3 类：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD 和 Fe-SOD
(梁毅等, 1995,湖北化工, 12 (3): 20-22;杨卫健和张
双全, 2002)。铜锌超氧化物歧化酶是活性氧清除酶系
中最重要的酶(王瑞刚等, 2005; Song et al., 2006)，与
植物的抗旱、抗盐碱、耐低温以及高温等多种逆境有
密切关系(张怡等, 2005;冯昌军等, 2005;郭丽红等,
2005; Song et al., 2006)。现已从水稻、马铃薯、玉米以
及棉花等植物中克隆出该基因(Kanematsu and Asada,
1990; Lin et al., 1995; Kernodle and Scandalios, 1996;
胡根海等, 2007)。目前 SOD基因的植物遗传转化研
究，也已经取得了可喜的成果，获得了过量表达的转
基因植株，转基因烟草的耐衰老能力和抗氧化能力都
增强，在转基因苜蓿植株的研究表明其抗冷能力明显
增强(马淑娟等, 2007; van Camp et al., 1996; McKersie
et al., 1993)。尽管如此也有研究表明不同种类的
SOD基因经转化，在植物的抗逆性产生不同效果。
覃鹏等(2006)研究发现，外源 Mn-SOD 基因的
导入能提高烟草抗旱能力，而 Fe-SOD基因的导入
虽能提高烟草体内的 SOD活性水平，但不能提高
烟草的抗旱性，因此不论从基础理论研究还是应用
研究关于 SOD基因的研究都具有广阔的研究前景
和研究价值。
由于多数的报道表明 SOD基因与植物的多种
逆境有关，在 NaHCO3逆境胁迫下研究碱茅的 SOD
基因，对其进行功能解析，将会从一个侧面阐述碱
茅抗逆性极强的缘由。碱茅是一种重要的抗盐牧
草，是我国北方盐渍化草地的主要建群种及重要的
先锋植物，也是植物抗逆领域研究的珍贵材料，并
具有极强的抗寒、耐旱、耐盐碱性特性(王艳梅和李
果珍, 2001)。本研究克隆的碱茅 SOD基因，经序列分
析表明与 Cu/Zn-SOD 同源性较高，因此命名为
Put-Cu/Zn-SOD，同时利用酵母表达体系，对盐碱及
氧化逆境等胁迫下的抗逆性进行了初步解析。
1材料与方法
1.1植物材料与菌株
碱茅根的 cDNA文库(150 mmol/L NaHCO3处理)
由本实验室构建。大肠杆菌(E. coli) Jm109、pYES2载
体、各种限制性内切酶购于MBI；胶回收试剂盒、T
载体购于 TaKaRa。
1.2 Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及全序列分析
根据生物学软件设计载体通用引物扩增碱茅
SOD基因全长片段。上游为：5-ACTGCTCCTCAGT
GGATGTT-3，下游为：5-CCCTCACTAAAGGGA
GATCC-3。以碱茅根 cDNA文库分离得到 Put-Cu/
Zn-SOD克隆的质粒(S04106_xx_xx)模板 PCR扩增，
扩增后的产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收，克
隆至 pMD18-T Vector，DNA 测序由 TaKaRa 完成。
将得到的 cDNA片段进行序列分析，并根据其核酸
序列推测其氨基酸序列，将其与同源性较高的几种
SOD的 cDNA进行氨基酸同源性比较。
1.3酵母表达载体 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD的构建及
其转化酵母的抗逆性解析
利用 pT-SOD 重组质粒进行 PCR，使 SOD 的
ORF 两端添加 BamHⅠ和 XbalⅠ酶切位点，再用
BamHⅠ和 XbaⅠ双酶切，1% Agarose电泳分离回收
双酶切产物。pYES2载体用 BamHⅠ和 XbalⅠ双酶
切，1% Agarose电泳分离回收双酶切产物。将前面得
到的双酶切产物用 T4 DNA连接酶连接，转化至大肠
杆菌 JM109中，进行 PCR检测。构建的重组质粒命
名为 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD。将构建好的质粒
pYES2-Put-Cu/Zn-SOD 和载体 pYES2 通过醋酸锂
转化法，导入到酵母菌株 INYScI中。
分别在 YPD固体培养基中添加不同的 Na2CO3、
NaHCO3和 H2O2等逆境处理，把 pYES2-Put-Cu/Zn-
SOD和 pYES2的转化酵母菌株稀释成不同浓度，点
在平板上培养。原始浓度为OD600=1.5，浓度分别稀释成
10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，后在 30℃培养，直观生长状
态，从而比较重组转化体酵母对逆境的适应状况。
2结果与讨论
2.1 Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆与序列解析
在前期的研究中构建了用碳酸盐处理碱茅的
cDNA文库，并对大量克隆进行了部分序列测定，并通
过数据库的同源分析，建立了部分碱茅基因数据库。选
取了与 SOD同源性较高的克隆(编号 S04106_xx_xx)。
采用载体通用引物(上游为: 5-ACTGCTCCTCAGTG
GATGTT-3,下游为: 5-CCCTCACTAAAGGGAGA
TCC-3)进行 PCR扩增，克隆至 T-载体，经序列测定
获得了基因的全长序列及其所编码的氨基酸序列如
图 1。其全长为 2 700 bp，阅读框架(ORF)为 615 bp，
ORF所编码的蛋白由 204个氨基酸组成，基因编码
的蛋白预测分子量为 20.6 kD，等电点 5.63。
在蛋白质数据库中通过 BLAST对 Put-Cu/Zn-
SOD基因编码的蛋白的氨基酸序列进行同源性检索
(NCBI)，结果表明：Put-Cu/Zn-SOD基因编码蛋白的
氨基酸序列与水稻 Cu/Zn-SOD (Accession number:
4346329 Os08g0561700) 具有 87%同源性，与玉米
Cu/Zn-SOD (Accession number: 100136885)具有 84%
同源性，与拟南芥 Cu/Zn-SOD (Accession number:
817365)具有 80%同源性(图 2)。这个结果表明 Put-Cu/
Zn-SOD可推测为碱茅的 Cu/Zn-SOD基因之一。
碱茅(Puccinellia tenuifolra) Put-Cu/Zn-SOD基因的克隆及在酵母中的表达
Cloning of a Cu/Zn Superoxide Dismutase Gene from Puccinellia tenuifolra and its Expression in Yeast 11
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2.2 Put-Cu/Zn-SOD 基因在酵母中表达及其抗逆性
分析
将构建好的质粒 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD 的
DNA用 BamHⅠ和 XbalⅠ双酶切，电泳检测插入片
段的正确性，正确切下的 DNA片段大小约为 615 bp
左右，证实获得重组质粒。
为了解析 Put-Cu/Zn-SOD 基因与逆境的关系，
对转 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD 的酵母菌株进行了抗
逆性分析，结果如图 3所示。正常情况下(图 3)，转
pYES2-Put-Cu/Zn-SOD 与转 pYES2 的酵母在无逆
境处理情况下的生长情况相似。但在 8 mmol/L
Na2CO3，8mmol/LNaHCO3和 12mmol/LNaHCO3等盐
碱胁迫下，转 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD的酵母菌株生长
却明显好于转 pYES2的酵母菌株。说明Put-Cu/Zn-SOD
基因的表达提高了酵母菌株在盐碱胁迫下的存活
率，使 INVSc1 (pYES2-Put-Cu/Zn-SOD)耐盐碱能力
明显增强。在不同浓度的 H2O2氧化逆境胁迫下，转 p
YES2的酵母菌株随H2O2胁迫浓度的增加长势越来越
弱。当 H2O2浓度达到 5 mmol/L时，转 pYES2的酵母
菌株几乎不能生长，而转 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD酵
图 1碱茅 Cu/Zn-SOD基因组序列及其所编码的氨基酸序列
Figure 1 Genomic sequences and the amino acid sequences of
Put-Cu/Zn-SOD
图 2碱茅 Put-Cu/Zn-SOD基因所编码的氨基酸序列的差异比较分析
Figure 2 Comparision of amino acids sequences of Put-Cu/Zn-SOD
12
母生长良好。说明，Put-Cu/Zn-SOD基因的表达提高
了酵母在氧化胁迫下的存活率，使 INVSc1 (pYES2-
Put-Cu/Zn-SOD)耐氧化胁迫能力明显增强。
Cu/Zn-SOD 在转基因植株中的过量表达能不
同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力，相关研
究报道已有不少。过量表达棉花叶绿体 Cu/Zn-SOD
基因的转基因烟草，抗衰老能力增强 (马淑娟等 ,
2007)；过量表达小麦 Cu/Zn-SOD基因的转基因烟
草，耐盐能力增强(张海娜等, 2008)。这些工作有力
地证明了 Cu/Zn-SOD 基因在植物抗逆中所具有的
重要作用。
本研究试图通过在酵母中过量表达碱茅
Cu/Zn-SOD基因，检测酵母在盐碱和氧化胁迫条件
下的生长状况，来验证碱茅 Cu/Zn-SOD 基因的功
能。酵母抗逆性的实验结果表明，转 Put-Cu/Zn-SOD
基因酵母的抗盐碱能力及抗氧化逆境能力明显好
于对照。在高浓度 H2O2的胁迫条件下，对照几乎不
能生长，而转基因酵母生长良好，这个结果表明了
图 3转化 pYES2-Put-Cu/Zn-SOD基因酵母的抗逆性分析
注: CK图:转化 Put-Cu/Zn-SOD和 pYES2的酵母菌株在 YPD培养基的生长情况;其它图为在 YPD培养基中添加不同浓度
NaHCO3, Na2CO3, H2O2等逆境处理后的 Put-Cu/Zn-SOD和 pYES2的酵母菌株生长情况
Figure 3 Hyper-resistance of Put-Cu/Zn-SOD overexpressing cells to various abiotic stresses
Note: Yeast cells containing pYES2-Put-Cu/Zn-SOD and pYES2 vector were respectively incubated in YPD medium plus 0.5 μg au-
reobasidin A/mL overnight at 30℃ ; The overnight cultures were adjusted to OD600 at 1.5, and then diluted to 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5-fold with appropriate YPD medium, and then 4 μL of each dilution series were spotted onto YPD agar plates supplemented with
different concentrations of NaHCO3, Na2CO3, H2O2 as indicated; Growth was monitored for 3 days at 30℃
转入的 Put-Cu/Zn-SOD基因在酵母体内表达后，能
够提高酵母在胁迫状态下的生长状况，对组织和细
胞起到了保护作用，从而提高酵母的抗逆性。也暗示
碱茅 Cu/Zn-SOD具有良好的抗盐碱和耐氧化能力。
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