全 文 ：研究报告
Research Report
碱茅(Puccinellia tenuifolra)全长 cDNA酵母文库中与铝胁迫相关基因的
初步筛选
孙博 1 卜媛媛 1 张梅华 1 高野哲夫 2 柳参奎 1*
1东北林业大学东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,盐碱地生物资源环境研究中心,哈尔滨, 150040; 2东京大学亚洲生物资源环
境研究中心,东京, 1880002
*通讯作者, shenkuiliu@nefu.edu.cn
摘 要 利用碱茅全长 cDNAs酵母表达文库，经不同浓度 AlCl3筛选得到 19个不同克隆可增强酵母的耐铝
性，经过同源性比对后，将这 19个对 Al3+胁迫敏感的抗性克隆大体分为以下几类：结构功能蛋白、酶类、有跨
膜结构的蛋白、与光合作用相关蛋白以及功能未知蛋白。为了了解该 19个单克隆对于胁迫的耐受特异性，本
研究中将这 19个克隆与转空载体的酵母分别在以下各种胁迫条件下进一步进行解析：AlCl3、NaCl、H2O2。结果
显示大部分筛选所得克隆对 AlCl3在浓度为 5.5 mmol/L时表现出耐受性。在 NaCl、H2O2条件下不同克隆之间
表现出不同的耐性。
关键词 碱茅, cDNAs,铝胁迫,酵母
The Full-length cDNA Library with Yeast Screening of Resistant
Aluminum-related Genes fromPuccinellia tenuifolra
Sun Bo 1 Bu YuanYuan 1 Zhang Meihua 1 Takano Tetsuo 2 Liu Shenkui 1*
1 Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field (SAVER), Ministry of Education, Alkali Soil Natural Environmental
Science Center (ASNESC), Northeast Forestry University, Harbin, 150040; 2 Asian Natural Environmental Science Center (ANESC), University of
Tokyo, Tokyo, 1880002
* Corresponding author, shenkuiliu@nefu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.001310
Abstract The Puccinellia tenuifolra cDNA libraries were expressed in yeast (Saccharomyces cerevisiae) and
screened on agar plates containing different toxic concentrations of aluminum. Ninteen cDNAs were isolated that
enhanced the aluminum tolerance of yeast. Through homologous BLAST, they were devided into five types:
Structural and functional proteins, enzymes, proteins with transmembrane helix, proteins related to photosynthesis,
and proteins with unknown functions. This 19 clones were spoted respectively on the YPG medium containing
AlCl3, NaCl, H2O2. The result showed that most of these clones had resistance to AlCl3 at 5.5 mmol/L that it exhibit
different resistance under NaCl, H2O2.
Keywords Puccinellia tenuifolra, cDNAs, Aluminum stress, Yeast
基金项目：本研究由中国教育部科研创新团队计划(IRT13053)资助
铝是地壳中含量最为丰富的金属元素。土壤中
的铝主要以对生物无毒害的硅酸铝盐的形式存在
(May and Nordstrom, 1991)。但是，在酸性条件中，铝
以 Al3+、Al(OH)2+和 Al(OH)2+等几种形式溶于土壤
中，成为影响农作物产量的一个主要的限制因素
(Foy, 1988)。在碱性环境下，铝也是以离子形式存在
(Al(OH)2+, Al(OH)2+, Al(OH)4-)，这种离子形式同样会
对植物造成一定的危害。在微摩尔浓度的 Al3+胁迫
条件下植物最明显的变化是根伸长受到抑制(Zhang
and Rengel, 1999)。研究表明，铝毒害会引起植物细
胞一系列的生理生化反应，比如，打破细胞质内 Ca2+
离子平衡(Barcelo and Poschenrieder, 2002)，改变细
胞骨架动态变化(Rengel and Zhang, 2003)以及扰乱
根尖细胞内源性的 NO水平(Illes et al., 2006)。
基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 6期，第 1310-1318页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.6, 1310-1318
在以往人们对基因功能研究的过程中，人们专
注于研究单个基因的特征性解析，但是，生物体具有
复杂的生理调节过程，某一个性状需要一个基因家
族或者一个基因调节网络的参与，针对于此，在功能
基因研究方面，人们转向研究与某一性状相关的一
连串的基因及蛋白的特性解析。近年来随着分子生
物学的快速发展。cDNA文库、基因芯片、抑制消减
杂交等技术均被研究者们广泛应用于筛选和分离特
定胁迫下相关基因。其中，cDNA文库在具体研究某
类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能
鉴定方面具有特殊得优势。Snowden 和 Gardner
(1993)最先构建了小麦根尖铝敏感和抗铝型的 cDNA
文库，并在文库中克隆出 5个受铝诱导的 cDNA，并
命名为 wail1-wail5。wail1编码产物与金属硫蛋白同
源；wail4编码产物与苯丙氨酸解氨酶同源，而 wail2、
wail3和 wail5则为功能未知蛋白。
目前，植物根尖有机酸的分泌(如苹果酸和柠檬
酸等) 被研究者认为是植物抗铝的一个非常重要的
机制，许多研究都发现，苹果酸通道蛋白 (ALMT1,
aluminum-activated malate transporter 1)和柠檬酸通
道蛋白(MATE, multi-drug and toxin extrusion)控制
着植物体内苹果酸和柠檬酸的分泌。目前，苹果酸
通道蛋白和柠檬酸通道蛋白在多种耐铝植物中被
发现(Delhaize et al., 2007)。在拟南芥中已经被证明，
在铝诱导下 AtALMT1 和 AtMATE 能够调控体内
苹果酸和柠檬酸的分泌(Hoekenga et al., 2006; Liu et
al., 2009)。在植物中，Nramp蛋白家族对维持金属离
子的平衡和运输中起到了重要作用(Nevo and Nelson,
2006)，其中当酵母中过表达 Nrat1 (Nramp aluminum
transporter 1)基因时，只有三价的铝离子能够被 Nrat
转运，而不是其它二价金属离子。水稻中 Nrat缺失
的突变体后对铝的吸收增加，并对铝变的敏感(Xia
et al., 2010)。可见，Nrat在植物解除铝毒中起到了至
关重要的作用。
近年来，一些与铝毒害相关的基因被克隆出来，
这使植物受到铝毒害时的应答反应在分子水平上得
到了解释(杨建立等, 2005)，但是，植物体内主要的耐
铝胁迫机制仍然是未知的。目前关于铝毒害的研究大
多集中在探讨酸性环境下植物的反应机制，而碱性环
境下铝的毒害作用研究甚少。为此，本实验室以盐碱
地多年生草本植物碱茅为材料构建了全长 cDNA文
库，并用 AlCl3筛选与铝毒害相关的基因，为盐碱土壤
中植物铝毒害应答机制的研究提供理论依据。
1结果与分析
1.1 AlCl3胁迫下筛选敏感性转基因酵母
将碱茅 cDNAs酵母表达文库大约为每 3 000~
5 000个克隆涂布在分别含有 5 mmol/L、6 mmol/L、
7 mmol/L、8 mmol/L、9 mmol/L AlCl3的 YPG培养基
上，对照为不含 AlCl3胁迫的 YPG培养基，抗性平板
每个浓度涂布 10个重复，以含盖更为全面的酵母文
库内容。在 30℃培养箱中倒置培养 2~6 d后，在含有
浓度为 9 mmol/L以及 8 mmol/L AlCl3的 YPG培养
基上没有单克隆出现，7 mmol/L AlCl3培养基上几个
单克隆，6 mmol/L AlCl3培养基上出现较多单克隆，
并且克隆有大有小，5 mmol/L AlCl3培养基上出现的
单克隆更多一些，克隆大小有差。而对照板上克隆密
布，约有 4 000左右。
在 5mmol/L、6mmol/L、7mmol/LAlCl3培养基上
挑取约 100个长势较好的单克隆，提取其 DNA，然后
利用通用引物进行 PCR检测，选取其中片段大小在
650~1 500 bp的 28个克隆，进行胶回收、与 pMD18-T
载体连接、转化大肠杆菌 JM109，挑取单克隆摇菌，
BamHⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定，将阳性克隆送往北京
华大基因公司测序。经过 DDBJBLAST核苷酸比对以
及 NCBIBLAST氨基酸序列比对，发现其中有 9个相
同基因，最终，通过加入 AlCl3胁迫在碱茅 cDNAs酵
母表达文库中筛选得到 19个不同的抗性克隆。
1.2抗性克隆的生物信息学分析
经测序后获得 19个抗性克隆序列，利用各种生
物信息学网站及软件如：Bioedit、NCBI BLAST、DDBJ
BLAST、CBS等预测这 19 个基因的同源性和跨膜
区，目的是找到与 Al3+直接相互作用的转运蛋白。经
过各种解析后，将 19个不同抗性克隆分为以下 5
类：酶类、一些结构功能蛋白、具有跨膜区的蛋白、与
光合作用相关的蛋白以及功能未知蛋白(表 1)。
筛选得到 4个编码产物为酶类的耐铝基因(表 1)，
004基因与拟南芥柠檬酸合成酶基因同源性较大，
有研究报道，该酶的过量表达可以缓解铝毒害，这
是由于该酶控制柠檬酸的合成，进而影响柠檬酸的
分泌；014基因与拟南芥中 NCED4有一定同源性，
该酶是植物激素 ABA合成中的关键酶，与干旱和
盐胁迫相关；019基因与玉米和拟南芥中的 GST同
源性很大，该酶的过量表达可以对铝毒害引发的氧
化胁迫提供还原力。
在 19个抗性克隆中，通过同源比对发现有 6个
碱茅(Puccinellia tenuifolra)全长 cDNA酵母文库中与铝胁迫相关基因的初步筛选
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基因编码一些结构功能蛋白(表 2)，其中 003基因与
玉米富含氨基乙酸的细胞壁结构蛋白有一定同源
性，由于铝毒害能够破坏细胞壁的稳定性，因此该基
因的过量表达可能会缓解铝离子引起的毒害作用。
013基因产物与拟南芥中泛素类似蛋白 UBL5同源
性较大，该蛋白是一种新型的 UBL基因，具有多重
生物学功能，如参与 mRNA前体剪接、调控细胞周
期、调节能量代谢以及抗压等，铝胁迫能够影响
DNA复制模板的活性，干扰正常的细胞分裂过程，
诱导细胞程序性死亡，因此该基因可能与铝胁迫相
关。015基因编码蛋白与玉米、拟南芥中的金属硫蛋
白有同源性，该蛋白在缓解重金属胁迫中起到很重
要的作用，重金属胁迫的作用机制之一是引发氧化
胁迫，这与铝胁迫可以引起氧化胁迫作用机制一致，
因此该蛋白可以缓解铝胁迫。017基因编码产物与铁
蛋白有很高的同源性，该蛋白具有抗氧化功能，并且
有研究表明，铝胁迫会干扰 Fe3+的还原，引发缺铁
症，因此该基因的过量表达能够缓解这种阻碍作用。
在 19个抗性克隆中筛选得到两个与光合作用
相关的功能基因(表 3)，由于铝毒害能够影响叶绿体
的含量和结构从而降低光做作用效率。研究表明，铝
胁迫下，1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶的活性大大降低，
并且叶片叶绿素 a/b含量也有一定的下降趋势，因此
这两种蛋白的过量表达能够有效缓解铝离子的毒
害。由于酵母中不含有叶绿素以及不进行光合作用，
在酵母表达文库中筛选得到与光合作用相关的基因
原因可能是这两种蛋白正常行使功能需要金属离子
Mg2+的螯合，而铝毒害会影响 Mg2+的吸收或代替
Mg2+螯合，因此过量表达这两种蛋白可以增加Mg2+
的吸收能力。
本研究的目的是在碱茅 cDNAs酵母表达文库
中筛选得到与 Al3+直接作用，将其转入细胞膜或者
转入液泡中的转运体或其相关因子。在筛选得到的
19个抗性克隆中根据文献介绍以及生物软件预测，
002以及 018基因的表达产物具有跨膜结构(表 4)，
002 基因编码产物与拟南芥中 AtSTE24 同源性很
高，都具有 424 aa，定位于内质网膜上，具有 7个跨
膜区，该蛋白是一种异戊二烯蛋白酶，催化生物体内
一类 C端以 CAAX结尾的蛋白翻译后修饰过程，未
有报道表明其与抗逆性相关。018基因编码产物是一
种未知功能蛋白，编码蛋白 177 aa，具有两个跨膜结
构，预测定位于细胞膜上。
最后，在 19个抗性克隆中含有 5个功能未知基
因 (表 5)，除了 018 基因外，还有 005、007、008 和
图 1 转入碱茅 pAUR101-cDNA的 19 个酵母菌株与转入空
pAUR101载体的酵母菌株在 AlCl3, NaCl和 H2O2胁迫下的抗
性分析
Figure 1 Growth assay of 19 yeast strains expressing pAUR101-
cDNA and pAUR101 vector under the stress of AlCl3, NaCl and
H2O2
010，这四个基因经同源比对后有一定同源性，但同
源性很小，具体其功能以及与铝胁迫间的应答关系
还需进一步加以解析。
1.3在不同抗性条件下对筛选所得酵母进行抗性检测
将 19 个抗性酵母菌株以及含对照 (pAUR101
载体)酵母在 YPD液体培养基中过夜培养，次日取出
菌液，测其 OD600数值，然后将每个菌株 OD600值调至
0.6，用无菌水清洗菌液 2次，去除培养液中的葡萄糖，
以免影响外源基因的表达，将调至 0.6的菌液作为母
液，利用YP培养液将其分别稀释 10-1倍、10-2倍、10-3
倍、10-4倍和 10-5倍，将稀释好的菌液每 5滋L点于各种
抗性的培养基上，30℃培养箱倒置培养 2~6 d (图 1)。
如图 1所示，在未添加 AlCl3、NaCl和H2O2的条
件下，CK与 19个筛选菌株长势一致。在 5.5 mmol/L
AlCl3条件下，CK长势较弱，19个筛选菌株长势有一
定差异，有的耐铝性比较不明显，如：001~006、011、
019；有的耐铝特性比较明显，如：007、008、009、010、
012、013、014、016、017和 018。在 1.2 mol/L NaCl条
件下，可以发现，013克隆对 NaCl有很明显的抗性，
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除此之外，其它克隆对于NaCl胁迫的抗性较小。001、
006、011和 015克隆在NaCl胁迫下长势不如对照，对
于NaCl胁迫有很大的敏感性。在 3.5mmol/LH2O2氧
化胁迫下，007、008、012、013、014、016和 018克隆长
势较好，对氧化胁迫有一定的耐受性；而 001、006和
015克隆弱于 CK，对氧化胁迫比较敏感。
综合以上结果可知，该 19个抗性克隆中有的与
氧化胁迫相关，有的与干旱和盐胁迫相关，有的与重
金属胁迫相关，有的与细胞维持正常的结构与功能，
如细胞壁和细胞骨架稳定性、光合作用以及细胞分
裂等相关，这些特性都与铝胁迫做引起的一些植物
细胞的生理反应相关，因此，这些基因的过量表达能
够有效缓解铝离子的毒害作用。除此之外，本研究通
过在添加 AlCl3、NaCl和 H2O2胁迫的 YPG培养基上
进行抗性分析，发现在筛选所得的 19个抗性克隆表
现不一，抗性特异性也有一定差异。
2材料与方法
2.1菌株与载体及所用培养基
碱茅全长 cDNA酵母表达文库(本实验室构建)，
大肠杆菌(E. coli) Jm109，酵母菌株(Saccharomyces
cerevisiae) INVSC玉，穿梭型酵母表达载体 pAUR101
Vector (TaKaRa)，pMD18-T Vector (TaKaRa)。
常用培养基：
LB培养基：5 g/L酵母菌液，10 g/L 胰蛋白胨，
10 g/L NaCl。
YP培养基：10 g/L蛋白胨。20 g/L蛋白胨。
YPD培养基：YP培养基+20 g/L葡萄糖。
YPG培养基：YP培养基+2%半乳糖。
固体培养基就为上述各培养基中加入 15 g/L琼
脂粉。
2.2 AlCl3胁迫下筛选敏感性转基因酵母
配制含有不同浓度(0mmol/L,5mmol/L,6mmol/L,
7 mmol/L, 8 mmol/L, 9 mmol/L) AlCl3 的 YP-U 固体
培养基。经计算，将大约含有 3 000~5 000个克隆的
酵母菌液涂布于上述培养基中，每个浓度设 10个重
复，即基本含盖了全部碱茅 cDNAs。将平板置于
30℃的培养箱中倒置培养 2~6 d。从高浓度到低浓度
选取大约 100个抗性克隆，提取其 DNA，进行 PCR
检测，酶切鉴定后测序。
2.3在不同抗性条件下对筛选所得酵母进行抗性检测
将上述阳性克隆所对应的酵母菌株经过夜培养
后，将其浓度调整到 OD600=0.6后，稀释成不同梯度，
分别取 4 滋L点于含有以下各种抗性及离子的 YPD
培养基上：AlCl3、NaCl和 H2O2。30℃倒置培养 3~7 d，
观察转化空载体的酵母与转化重组质粒的酵母的长
势，分析其与胁迫的应答关系。
作者贡献
孙博是本研究的设计者和执行人，独立完成了
本论文初稿的写作；张梅华是本研究中所用碱茅 cD-
NA酵母表达文库的构建者；卜媛媛和高野哲夫参与
实验设计及相关数据的统计分析；柳参奎教授是项
目的构思者和负责人，指导了整个研究的实验设计，
相关数据的统计分析，以及论文的修改。全体作者都
阅读并同意此最终的文本。
致谢
本研究由中国教育部科研创新团队计划
(IRT13053)资助。
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