全 文 ：　　
高羊茅种子内生真菌的消毒方法
张志飞1 , 2 ,饶力群1
(1.湖南农业大学生物科学技术学院 ,湖南长沙 410128;2.湖南农业大学农学院 ,湖南长沙 410128)
摘要:在高羊茅 Festuca arundinacea 组织培养中最常用的外植体是成熟种子 ,而种子中共生的半知菌亚门
内生真菌 Neotyphodium coenophialum 使消毒较为困难 ,污染率高。为了研究温水处理对富含内生真菌的
高羊茅种子发芽率 、污染率和出愈率的影响 , 以不同温度(40 , 50 , 60 ℃)、不同时间(10 , 20 , 30 min)的温水浸
泡和次氯酸钠配合使用处理高羊茅种子 ,并进行发芽率试验和愈伤组织培养。经统计学分析发现 , 适用于
富含内生真菌的高羊茅种子的最佳消毒组合为 50 ℃温水浸泡 10 min , 再经 70%酒精处理 5 min , 然后用次
氯酸钠处理 15 min。消毒方法在保证较高种子发芽率的前提下 , 可降低种子污染率 , 提高出愈率。该消毒
技术对于解决高羊茅因内生真菌造成的严重污染 、出愈率低等现象有重要作用 , 并为高羊茅再生体系构建
奠定重要的试验基础。
关键词:高羊茅;内生真菌;种子;消毒
中图分类号:S351.2;S432.4 +4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2008)06-0093-05
＊ 　高羊茅 Festuca arundinacea 是我国目前较为
常用的草坪草种 ,成熟种子是高羊茅再生体系构
建中最常使用的外植体材料[ 1 , 2] 。外植体的彻底
消毒是组织培养成功的关键因素之一。多数高羊
茅种子中含有一种可以提高其抗性的半知菌亚门
内生真菌 Neotyphodium coenophialum , 这类真
菌整个生活周期都是在宿主个体内进行 ,不产生
子实体和孢子 ,菌丝在宿主早期发育过程中侵入
胚 ,以菌丝体的形式存在于胚叶和胚芽鞘原基
中[ 1] ,随着种子的萌发 ,菌丝体侵入幼苗的分裂组
织(生长点)。 N .coenophialum 菌丝体的生长需
要较高的蔗糖浓度[ 3] ,目前常规使用的愈伤组织
诱导培养基(如 MS培养基 、N6培养基)的蔗糖浓
度都较低 ,菌丝体在培养基上生长要比愈伤组织
的萌动推迟几天或十几天 ,往往待愈伤组织萌动
后 ,培养基才表现污染状态 ,这严重影响了出愈
率。尽管人们已经认识到内生真菌的存在给高羊
茅种子消毒带来很大的困扰 ,并试图解决这一问
题 ,但表面消毒对于寄生在种子内部的内生真菌
效果不佳 。Welty 等[ 4] 研究表明 ,湿热作用可以
杀死高羊茅种子中的内生真菌 。韩建国等[ 5] 在研
究综述中也提到 57 ℃湿热处理 40 min 、37 ℃热
处理 3周 、50 ℃热水浸泡 20 min 均可使内生真
菌失活。试验利用 40 ～ 60 ℃温水浸泡和消毒剂
配合使用的消毒方法处理高羊茅种子 ,探讨温水
处理对高羊茅种子活力 、污染率和出愈率的影响 ,
选择适合的温度和浸泡时间组合 ,在保证种子较
高发芽率的前提下 ,降低种子污染率 ,提高出愈
率 ,为高羊茅再生体系构建和获得高频再生植株
奠定重要的试验基础 。
1　材料和方法
1.1 材料　2个富含内生真菌的高羊茅品种:爱
瑞 3号(A rid Ⅲ)和交战 2号(Crossfi reⅡ),均购
自北京中种草业有限公司 。
1.2 方法
1.2.1种子内生真菌的检测　采用苯胺蓝染色
法[ 6]检测高羊茅种子内生真菌。每品种随机选取
适量均匀饱满的种子 ,置于三角瓶中 ,加入适量苯
胺蓝溶液 ,小火煮沸 25 min ,直至种子透明而不
消融为止 ,停止加热后种子用蒸馏水冲洗干净。
剥去颖壳和种皮放到显微镜下压片观察 ,有内生
真菌的种子可观察到蓝色菌丝 ,反之则无 。每品
种随机检查 100粒种子 ,计算内生真菌带菌率。
1.2.2温水浸泡处理种子　采用 3 ×3二因子设
25 卷 6 期
Vol.25.No.6 草　业　科　学PRA TACULTU RA L SCIENCE 936/ 2008
＊收稿日期:2007-07-08
作者简介:张志飞(1977-),女 ,湖南邵东人 ,讲师 ,在读博士生。
通讯作者:饶力群　E mail:raoliqun@163.com
94　
计不同温度(40 ,50 ,60 ℃)和浸泡时间(10 ,20 ,30
min)水平处理高羊茅成熟种子 ,处理后的种子用
于发芽试验和进一步消毒 。
1.2.3发芽试验　随机选取上述温水浸泡处理的
种子 100粒 ,放置于有灭菌湿润滤纸的培养皿上 ,
25±1 ℃,暗培养 , 15 d后统计发芽率。对照为室
温下不经浸泡的种子。仅经过 70 %乙醇和次氯
酸钠消毒后的种子也进行发芽试验 。每个处理重
复 3次。
1.2.4浸泡后种子消毒　将上述温水浸泡处理的
种子进行第 2步消毒 ,首先在 70%乙醇中浸泡 5
min ,无菌水冲洗 1 次后 ,再用次氯酸钠溶液(含
5.25%质量浓度 NaOCl)处理15 min ,无菌水冲洗 5
次。对照种子仅经过 70%乙醇和次氯酸钠消毒。
1.2.5愈伤组织培养　将消毒后的高羊茅种子接
种于愈伤诱导培养基(MS +8 mg/L 2 , 4-D +500
mg/L 水解酪蛋白)中 ,每个处理接种 20瓶培养
基 ,每瓶中接种 30粒种子。(25±1)℃,暗培养。
30 d后统计污染率和出愈率。
考虑到同一瓶培养基中有一粒种子带菌就会
污染瓶内其他种子 ,为了反映实验的可操作性 ,定
义污染率为感菌瓶数与总接种瓶数的比值。另
外 ,考虑到愈伤组织形成过程中有的种子不萌发
而直接产生愈伤 ,定义出愈率为未感菌的接种瓶
内有愈伤组织形成的种子数与接种种子数的比值
的平均值 。
1.3 数据统计与分析　所有数据均采用 SAS
8.1统计分析软件进行处理。对 2个品种常规种
子的发芽率和经 70 %乙醇和次氯酸钠处理的种
子发芽率进行均数差异显著性检验(t检验);对 2
个品种不同温水处理和对照的种子发芽率和出愈
率进行最小显著差数法多重比较(LSD);对种子
发芽率 、感菌率 、出愈率进行不同温度和浸泡时间
的双因素方差分析;以降序排列各品种的发芽率
和出愈率 ,以升序排列污染率 ,对不同处理的消毒
效果进行秩和比(RSR)排序 。
2　结果与分析
2.1 内生真菌带菌率和发芽率结果　苯胺
蓝染色结果发现爱瑞 3 号内生真菌带菌率为
67%;交战 2号内生真菌带菌率为 56 %。爱瑞 3
号和交战 2 号的种子发芽率分别为 89.0%和
84.0 %,经过乙醇和次氯酸钠消毒后种子发芽率
分别为82.9%和81.8%。 t检验结果表明消毒前
后 2 个品种的种子发芽率差异不显著(P <
0.05),说明 70%乙醇 5 min ,次氯酸钠15 min的消
毒处理对种子发芽率没有显著影响。这就排除了
因消毒液因素造成种子活力下降而引起出愈率降
低的现象 ,充分反映不同温度 、不同时间浸泡处理
下对种子的愈伤组织和内生真菌生长的影响情况 。
2.2 温水处理的发芽率结果　最小显著差数
法多重比较结果表明 , 2个品种不同处理间的种
子发芽率差异极显著(P <0 .01)。由表 1 可知 ,
爱瑞 3 号对照组的发芽率最高 ,与 40 ℃处理
30 min , 50 ℃处理 30 min , 60 ℃处理 10 、20 、
30 min的组合之间;40 ℃处理 30 min 与 60 ℃处
理 10 、20 、30 min 的组合之间;50 ℃处理 30 min
与 60 ℃处理 10 、20 、30 min的组合之间存在极显
著差异 ,其他组合间差异不显著 。交战 2 号对照
组的发芽率最高 ,与 40 ℃处理 30 min , 50 ℃处理
20 、30 min ,60 ℃处理 10 、20 、30 min的组合之间;
40 ℃处理 30 min与 50 ℃处理 10 、30 min ,60 ℃
处理 10 、20 、30 min 的组合之间;50 ℃处理
30 min和 60 ℃处理 10 、20 、30 min的组合之间存
在极显著差异 ,其他组合间差异不显著 。
双因素方差分析结果表明 ,温度和浸泡时间
总处理间对爱瑞 3号和交战 2号发芽率有极显著
影响(F爱瑞3号 =89.07 , P <0.01 ;F交战2号 =83.09 ,
P <0.01), 温度(F爱瑞3号 =248.30 , P <0 .01;
F交战2号 =232.37 , P <0 .01)、时间(F爱瑞3 =56.87 ,
P <0.01 ;F交战2号 =66.28 , P <0 .01)以及温度时
间互作(F爱瑞3号 =25.56 , P <0 .01 ;F交战 2号 =
16.86 ,P <0.01)对爱瑞 3 号和交战 2 号的发芽
率均有极显著影响。由表 2可知 ,爱瑞 3 号和交
战 2号种子在 40 ℃温水处理的发芽率显著高于
60 ℃温水处理的发芽率 ,但与 50 ℃温水处理的
发芽率差异不显著 。预备试验发现 ,在 70 ℃水温
下浸泡 ,2个品种的高羊茅种子发芽率均下降到
30%以下(数据未显),而 60 ℃温水处理对种子的
PRATACULT URAL SCIENCE(Vo l.25.No.6) 6/ 2008
95　
表 1　不同水温处理下种子发芽率 、感菌率和出愈率的比较
温度 时间 发芽率(%)爱瑞 3号 交战 2号
污染率(%)
爱瑞 3 号 交战 2 号
出愈率(%)
爱瑞 3 号 交战 2 号
综合排序
爱瑞 3 号 交战 2 号
CK 89.0A 84.0A 70 70 67.8DC 59.1D 0.53 0.57
10 min 86.5AB 81.9AB 70 75 72.8BC 63.3DC 0.57 0.60
40 ℃ 20 min 87.2AB 83.4A 65 60 71.9C 67.5BC 0.47 0.47
30 min 84.6BC 78.6BC 50 55 78.7A 73.7A 0.47 0.47
10 min 87.2AB 84.1A 35 40 77.2BA 71.7BA 0.37 0.30
50 ℃ 20 min 85.4AB 79.2BC 15 20 70.4C 59.6D 0.47 0.47
30 min 81.5C 75.9C 15 30 63.7D 52.4E 0.63 0.63
10 min 76.9D 70.9D 10 15 55.0E 46.3F 0.60 0.63
60 ℃ 20 min 65.8E 66.2E 5 10 46.3F 40.2G 0.63 0.63
30 min 49.7F 50.1F 10 10 41.3G 37.6G 0.77 0.73
　注:不同大写字母表示处理间在 0.01 水平有显著差异;RS R值越小说明消毒效果越好。
表 2　时间 、温度处理对发芽率和污染率平均数的多重比较
发芽率(%)
爱瑞 3 号 交战 2 号
污染率(%)
爱瑞 3 号 交战 2 号
温度 40 ℃ 86.10A 81.30A 61.67A 63.33A
50 ℃ 84.70A 79.73A 21.67B 30.00B
60 ℃ 64.13B 62.40B 8.33B 11.67C
时间 10 min 83.53A 78.97A 38.33A 43.33A
20 min 79.47B 76.27B 28.33A 31.67AB
30 min 71.93C 68.20C 25.00A 30.00B
　注:不同大写字母表示处理间在 0.01 水平有显著差异。
发芽率影响较大 ,因此 60 ℃以上的温水不适宜用
于种子浸泡 ,适宜的浸泡温度应该为 40 ～ 50 ℃。
爱瑞 3号和交战 2号种子在不同浸泡时间组间的
发芽率有极显著差异 ,可见 ,在 40 ～ 50 ℃选择较
为合适的浸泡时间对于保证较高的种子发芽率有
重要意义 ,这可能是因为湿热作用对内生真菌的
杀死效果除受到温度影响外 ,还受到作用时间的
影响 ,另外较长时间湿热作用对种子生活物质也
会有一定破坏。
2.3 温水处理的污染率结果　双因素方差分
析结果表明 ,温度和浸泡时间总处理间对爱瑞 3
号和交战 2 号污染率有极显著影响(F爱瑞3号 =
23.26 ,P <0.01;F交战2号 =38 .00 , P <0 .01),其中
温度组间对爱瑞 3号和交战 2号的污染率的影响
具有极显著差异(F爱瑞3号 =43.79 , P <0.01;
F交战2号 =70.57 ,P <0.01);而浸泡时间组间对爱
瑞 3号和交战 2号的污染率的影响没有显著差异
(F爱瑞3号 =2 .74 , P >0.05;F交战2号 =5.43 , P >
0.05)。由表 2 可知 , 40 ℃温水处理爱瑞 3号和
交战 2号的污染率显著高于 50和 60 ℃温水处理
的;50和 60 ℃温水处理对爱瑞 3 号的污染率影
响没有显著差异;50 和 60 ℃对交战 2 号污染率
的影响有极显著差异 ,即 40 ℃温水处理的种子污
染率较高 ,不适宜用于种子消毒 。结合发芽率结
果可知 ,适宜的浸泡温度应为50 ℃。
爱瑞 3号不同浸泡时间组间的污染率差异不
显著 ,交战 2 号 10与 30 m in浸泡时间组间的污
染率差异显著 ,而与 20 min的组间差异不显著。
2.4 温水处理的出愈率结果　由表 1可知 ,爱
瑞 3号在 40 ℃温水浸泡 30 min处理的种子出愈
率最高 ,与 50 ℃温水浸泡 10 min组合的出愈率
之间没有显著差异 ,与其他组合间存在极显著差
异;50 ℃温水浸泡 10 min 处理的出愈率与 40 ℃
温水浸泡 10 min组合间的出愈率没有显著差异 ,
与其他组合间存在极显著差异;对照与 40 ℃处理
30 min , 50 ℃处理 10 min , 60 ℃处理 10 、20 、30
min的组合间差异极显著;50 ℃处理 10 、20 、30
min和 60 ℃处理 10 、20 、30 min 的组合之间差异
极显著 。
交战 2号在 40 ℃温水浸泡 30 min处理的种
子出愈率最高 ,与 50 ℃温水浸泡 10 min组合间
没有显著差异 ,与其他组合间存在极显著差异;50
℃温水浸泡 10 min处理的出愈率与 40 ℃温水浸
泡 20 min组合间没有显著差异 ,与其他组合间存
在极显著差异;对照与 50 ℃处理 20 min的组合
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间没有显著差异 ,与其他组合间差异显著;50 ℃
处理 10 、20 、30 min和 60 ℃处理 10 、20 min的组
合之间差异极显著。
双因素方差分析结果表明 ,温度和浸泡时间
总处理间对 爱瑞 3 号和交战 2号的出愈率的影
响有极显著意义(F爱瑞 3号 =82.01 , P <0.01;
F交战2号 =69.63 , P <0.01);温度组间(F爱瑞3号 =
16.56 , P <0.01;F交战 2号 =13.24 , P <0.01)和浸
泡时间组间(F爱瑞3号 =16 .77 , P <0.01;F交战2号 =
17.15 , P <0.01)对爱瑞 3号和交战 2号出愈率的
影响均极显著。
2.5 发芽率 、污染率和出愈率的 RSR排序
　由表 1可知 ,在保证较高爱瑞3号和交战 2号种
子的发芽率的同时 ,出愈率较好 ,而污染率较低的
最佳消毒组合是:50 ℃温水浸泡 10 min ,再经 70%
酒精处理 5 min ,然后用次氯酸钠处理15 min。
3　讨论与结论
3.1 高羊茅种子的消毒　植物组织培养中的
污染主要是由外植体带菌 、接种操作污染 、培养室
污染等原因造成 ,后两者可以通过熟练操作过程
和提高培养室洁净度而避免 ,而外植体带菌就需
要选择适合的消毒方式。目前常用的高羊茅种子
消毒方法根据对种子的机械处理可分为三类 ,一
类是针对种皮的 ,如通过手工去除种皮[ 7] ,或用
50%硫酸软化种皮[ 8] ,或是砂纸打磨种皮[ 9] ;另一
类是切除胚乳[ 7 , 10] ;第三类对种子不进行物理处
理 ,直接消毒。消毒液的使用主要是 70%乙醇和
0.1%升汞配合使用[ 7 , 9] 或 70%乙醇和次氯酸钠
配合使用[ 11] 。升汞是应用最广泛的一种消毒剂 ,
有剧毒 ,消毒后难以除去残余汞对外植体的杀伤
作用;而次氯酸钠主要是利用其分解产生的氯气
进行杀菌 ,对组织毒害作用较小 ,因此试验选择次
氯酸钠为消毒液 。以上消毒方法虽然可以在一定
程度减少种子的带菌率(其中包括种皮携带的腐
生菌),但对于隐藏在种子胚中的内生真菌[ 11] 却
很难杀死。虽然有报道称高羊茅种子中的内生真
菌在室温条件下贮藏 1 ～ 2年即失去活性 ,但组织
培养中用到的种子量少 ,为了保持其较好的生活
力 ,一般冷藏于冰箱 ,而在 4 ℃相对湿度 45%～
50 %的条件下贮藏 1年以上的种子中带菌量仍可
达到 70%以上[ 12] 。因此组织培养时杀死内生真
菌对于高羊茅种子的彻底消毒尤为重要。
3.2 内生真菌与发芽率 、污染率的关系　
Joost
[ 13]研究发现携带内生真菌的高羊茅种群发
芽率显著高于不携带内生真菌的种群 ,这主要是
因为在种子吸涨过程中 ,内生真菌降低了相对水
分的获得 ,而在吸涨中 ,吸收过量的水会降低种子
发芽率 。任安芝等 [ 14] 也发现携带内生真菌的黑
麦草 Lolium mult i f lorum 种子发芽率(87 .6%)
要显著高于未携带内生真菌的种子发芽率
(78.4%)。试验结果也证明经温水处理后的种子
发芽率低于对照种子的发芽率 。由于携带内生真
菌的种子与未携带内生真菌的种子在形态上没有
差异 ,因此只能通过试验所用的染色后镜检法 、高
效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)或
PCR等对内生真菌或其产生的生物碱进行检测
鉴定。由于苯胺蓝染色法仅能检测到内生真菌菌
丝的有无 ,不能判断短时间湿热处理后的内生真
菌的存活与否 ,因此不能对不同处理下内生真菌
的存活量做直观判断 ,也就无法说明发芽率与内
生真菌的定量关系。另外 ,试验定义的污染率在
反映内生真菌存活情况的同时 ,也反映消毒处理
对种子表皮微生物的作用 ,这可能会更真实的反
映湿热处理和 70%乙醇 、次氯酸钠配合使用对高
羊茅种子的真实消毒效果。
研究发现 50 ℃温水浸泡 10 min 对高羊茅种
子的发芽率没有显著影响 ,而且试验观察发现 ,经
过浸泡的种子其出愈时间较未经浸泡的种子早
(数据未显),这可能是因为温水浸泡软化了种皮 ,
促进了种子的萌动 。因此以高羊茅种子作为外植
体来源时 ,经过简单的温水浸泡再进入消毒过程
可以有效的降低污染率 ,提高出愈率 ,甚至缩短出
愈时间 。研究将杀灭内生真菌的方法和普通消毒
技术结合在一起 ,有效地解决了因为内生真菌作
用造成高污染率的现象 ,并且此方法对种子活力
没有显著影响 ,还适用于内生真菌消亡的高羊茅
种子。这些研究工作为解决高羊茅种子内生真菌
的消毒 、高羊茅再生体系的培育及高羊茅转基因
育种和体细胞突变技术育种的实施有着重要意
PRATACULT URAL SCIENCE(Vo l.25.No.6) 6/ 2008
97　
义。我们将通过验证本消毒方法在同样富含内生
真菌的黑麦草中的效果 ,对该种消毒方法进一步
分析 ,以期获得更为理想的内生真菌湿热消毒技
术。
参考文献
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Sterilization method of endophytic fungi in tall fescue seeds
ZHANG Zhi-fei1 , 2 , RAO Li-qun1
(1.Bioscience &Bio technolog y Co lleg e of Hunan A gricultural Universi ty , Chang sha 410128 , China
2.Agronomy College of Hunan Ag ricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract:Seed w as of ten used as explant in tall fescue tissue culture , but Neotyphod ium coenophi-
alum , endophyt ic fungus , symbiosed wi th tall fe scue , caused high contamination.To study the effect
of dif ferent w arm w ater t reatment on germination rate , contamination rate and callus rate of seeds
containing endophy tic fungi , tall fescue seeds we re sterilized by w ater wi th dif fe rent temperature(40 ,
50 , 60 ℃)fo r different period o f t ime(10 , 20 , 30 min), as w el l as sodium hypochlorite solution.Seed
germination rate and callus cul ture w ere dete rmined.S tati stical analysis show ed that the opt imal steri-
lization treatment w as 50 ℃water for 10min , then dipped in 70 %alcohol for 5 min , follow ed by sodi-
um hypochlo ri te solution t reatment for 15 min .The sterilization method could decrease contamination
rate and increase callus rate , would play an impo rtant ro le in reducing contamination rate and increase
callus rate in tall fe scue tissue culture , and providing refe rence to it s regeneration sy stem const ruc-
tion .
Key words:Tall fescue;endophy tic fungi;seed;sterili zation
6/2008 草　业　科　学(第 25 卷 6 期)