全 文 ：5 年 四 川 夫 学 学 报 第 1 期
川中南星 (Aris a ` ma ` w 滋。 ni: E呵) 凝集素
的纯化友其部份性质的研究
肖智雄 曾仲奎
摘 要
用猪甲状腺球蛋白一对氨基苯眠乙基一交联凉脂作袭和及附利 , 从川中
南星的块茎中分离得到一种凝集素 . 其亲和层析样品 , 翘碱性聚丙烯酞胺凝胶
速糟电泳显示为两条带 , 分子量分别为 24 , 0 0和 1 100 0 , 前者为糖蛋白 . 氨
蒸醉分析表明含硫氨莽峥少, 辫坪抑鲍吟瞬集下限为 另移加卜不凝集人 A 、 B 、 0 血型的耗血球 . 其凝集活性受 D 一 G a1 N A c 的抑制 . 它能促使人
外周血淋巴捆胞有林分裂 . 具校强的抗热性 . 体外实碳对人肝庙袖胞有抑制
趋势 .
中草药是我国一大宝库 , 目前对中草药有效 成分的研究多局 限于生物碱 、 贰类 、 菇
类等小分子物质 . 而对很多具有特殊生物学功能的生物大分子 , 凉口糖蛋 白 , 则 研 究 较
少 . 天南星科天南星属川中天南星 ( A ir s舫m a W il so in i E n gl ) 的块茎是一种具多种药
汀 「 · ’ ` . ’ 一
甩功能的中药 . 本文报道了用亲和层析方法纯化其具凝血活性的蛋白组份 , 并对部份性
质作了测定和探讨 .
材 料 和 方 法
一
.1 川中南星采自大邑县双河公社 。 一 块茎洗净去皮 , 以高速组织捣碎机捣碎 , 滤液
置冰箱保存 . 或块茎切片 , 置烘箱 40 ℃ 干燥 .
2
. 猪甲状腺球蛋白一对氨基苯讽乙基一交联琼脂 (简称 P T G 一 A B S E 一 A g a r ) 的制
备 : 参照袁中一 仁` 〕 和李士云川 等方法 . 湿重 3 5 克 A B S E 一 交联琼洛旨 ( A B S E 含量为
7 2微克分子 /克琼脂 ) 与 1克猪甲状腺球蛋白偶联 . F ol i-n\ 酚法〔 ` 3测其偶联率为 2 8% ,
偶联后的亲和吸附剂浸入悬有 a 一 蔡酚的饱和醋酸钠水溶液 ( nI l g加 l) 中 , 冰箱处理过
夜 , 封闭残存的重氮盐 . 制备好的亲和吸附剂为深桔红色 , 分别用蒸馏水和 I M N “ CI 洗
涤数次 , 装柱平衡待用 .
对 一 B一 硫酸醋乙枫基苯胺 ( S E S A ) 为上海染化八厂工业品 . N H 4 S O N H : 为 E ·
M er ck 产品 , 猪 甲状腺球蛋白为上海生化所东风试剂厂生产 .
3
. 血凝活性测定 , 制备 2 % 新鲜无纤兔红血球生理盐溶液 . 凝集活性采用小试管
系列稀释法进行测定 。 糖抑制实验时 , 将凝集素释释后与单糖混台 , 再叻日红 细胞 。 人
A
、
B
、
o
、
A B 型血细胞由中国医科院成都输血研究所馈赠 , 免红细胞采 自本 系 饲 养
场 . N 一 乙酞半乳糖胺 、 L 一 岩藻糖为 S i g m “ 公 一司亡品 , 其余单糖及双糖均为国厂分析
月\文 J: 198改年 5 ) J 2 4 } I收至口.
第 1 期 川中南星 ( A I.1 ` 。 m“ w nso ni Eng ) l凝集素的纯化及其部份性质的研究 3 9
纯或生化试剂 .
译. 聚丙烯酸胺盘状凝胶电泳〔豹 : 采用 P H S. 9Tri 。 一 D ETA N a Z 一 硼酸缓冲液连续系
统 . s s D一 凝胶电泳测定分子量 〔 , , . A cr 为国产化学纯 , iB 、 为 A l dr i c h hc e m ica l c o tL d
产品 : 用前分别重结晶 , S D s 为 s o vr a 产品
1 3
, 7 0 0 )
, 胃蛋白酶 ( 3弓, 0 0 0 ) , 辣 根 过 氧
均为上海生化所东风试剂厂产品 。
. 用于分子量测定的标准蛋 白 R N as 。 ( M w 每
化物酶 ( 40 ,0 0 ) 和牛血白清蛋白 汁 8 , 0 0 0 )
弓. 氨基酸组成分析 : 样品水解 24 小时后 , 用 日立 一 8 35 型氨基酸自动分析仪测
定 。
6
. 促有丝分裂活性的测定 : 以 P H A 作对照 , 按常规方法培养 , 测定转化细胞和
分裂 细胞数 . ` 一七叹
7 , 体外抑制人肝癌细胞实验 . 采用美兰试管法 〔` “ , 人肝癌细胞得自四川医学除肿
瘤研究所 , 用 1 6 4 0 培养液反复洗涤数次 , 相差显微镜下 细胞形态完整 . 最终细胞浓度
为 1 0 6个 / m l . 凝集素经小试管系列稀释 , 加入 。 . 2m l 人肝癌细咆 , 总体积 0 . 目m l , 3 7℃
保温 刁h , 加入 。 · “ % 美兰溶唯 0 · l m l , 继续于 3 7℃ 保温 2一 2随 , 观察美兰颜色的变
化 , 并与未加凝集素.的对照管比较 . 、 -
.8 抗热性试验 : 取 4m l 凝集素生理盐溶液 ( .0 工m g l/ m l) 于试管内 , 在恒温水浴上
取不 同温度 沁℃ 、 8。℃ 、 8 5℃ 、 9。℃ 分别保温 5 ` 、 .cJ ` 、 2 0, , 取 。 . 工一。 . 2m l 于 白色
瓷板 一上 , 滴加 o 。 l m l免红细胞 , 室温放置 0 . 5一仆 , 镜检凝集情况 ,对照以 一乳 9纬N “ lC ;溶
液代替凝素集 .
实 验 结 果 -一 一 泛 -
1
. 川中南星凝集素的亲和层析纯化 :将娜中南星 DZ O克以生理盐水浸泡 , 高速组织
捣碎机打碎 , 置冰箱 4℃ 过夜 . 滤渣再用生理盐水浸取一次 , 合并滤液为 士幼 t叻 J . 加
固体硫酸饮分步沉淀 . 取 。 . ?一。 ; 8 饱和度部份的沉淀 , 透析除盐后冷冻干燥得祖品 .
粗品用生理盐水溶坎叨 、 9% 到。 c1 )溶解 , 且对其平衡透析 , 出现沉淀时离心弃去 , 上
清液加到用 0 . 9 % N a cl 平衡好的
P T G
一
A B s E
一纯衅 亲和柱上 , 待洗
去杂蛋白后渗 换用 6M 脉水溶液解
吸附 , 得凝集素活性峰 . 见图 互 .
2
. 纯度鉴定 : 经 6M 豚洗脱
所得具血凝活性部份 , 透析去腮 后
冷冻干燥 . 所得制品经 P H S几9 T ir : -
E D T A N a
: 一 硼酸缓冲系统 连 续 电
泳 , C O m m a s ie 亮兰 R 一 2叨 染色呈
现两条蛋白带 . s ih f’ s 试剂平行染
色表明较大分子量的蛋 白 为 糖 蛋
白 . 见图 n .
3
. 分子量测定 : 川中南星凝
集素亲和层析 制 品 , 经 S D吕处理
佘香如希
勺三口l`卞
次
?二月
:扛; `冲 , ’ 石, 服
了 J
7子
图 1 . 川中南星凝集素亲乖层析 图
柱 : 功.1 工一 x书oc m 上样蛋白量 17 m g
一 流速 : s m l/ 管 · _10 分钟矛
四 川 大 学 学 报 1 9 8弓年
图 n . 聚丙烯跳胺凝胶盘状连续电泳
凝胶浓度 7 . 5%
上样量: 3 0产g
电流 : 3 . s m A /管
时间 : 1 . 5h
室温 。
(
a
)
。
C Om m a s i e 亮兰 R 一 2 5 0 染 色 . ( b ) . S h i f f , s 试 lA] 染 色
( a ) ( b )
后 , 采用 s D s 一 磷酸缓冲系统的聚丙烯酞胺凝胶 电泳 , 以几种 已知分子量的蛋 白质作标
准 , 电泳图谱见图 n l . 测定并计算各自的相对迁移率 ( lR 值 ) , 用标准蛋 白质分子量的
对数作纵座标 , 以 R , 值为横座标作图 , 求得两条蛋 白带的分子量各为 2 4 , 。0 和 1 1 , 0。。 ,
见表 I 和图 VI .
蘸鬓…黔蘸鬓蘸纂冲扮次 : 环 5另 ,日 水, 黝 图 I n : S D S 连续凝胶 电泳0 . I M p H 7 . 2 磷 酸缓 冲液含 0 . 戈% S D s凝胶浓度 : 1 0%电流强度 : 7 . s m A /管
电泳时 间: 4 h
( a ) 核糖核酸酶 ( b ) 胃蛋白酶
c( ) 辣根过氧化物酶 ( d) 牛血清白蛋白
(e ) 川中南星凝集素样品
( a ) ( b ) ( e ) ( d ) ( e )
样 品 名 称
牛 血 清 白 蛋 白
辣根过氧化物酶
胃 蛋 白 酶
核 糖 核 酸 酶
川中南星凝 集素
分 子 量
6 8
,
0 0 0
4 0
, 0 0 0
3 5
, 0 00
1 3
, 7 0 0
1 1
, 0 0 0
2 4
一
e 0 0
l o g M
一
W
4 , 8 3 3
4 , 6 0 2
刁, 5 4 4
4 , 1 3 7
4 , 0 4 2
4 , 3 7 9
R f
0 , 1 2 0
0 , 3 8 3
0 , 3 0 4
0 , 8 0 2
0 , 8 8 7
0 , 5 39
表 I 川中南星凝集家及标准蛋白的分子彝和 fR 值
第 1 期 川中南星 ( A r i s a e m a W i l s o n i : E n g l )凝集素的纯化及其部份性质的研究 9 5
牛血清白委白
过载化抬酶
` 币厂刃 J口少
嘴蛋日前
\ 伽州
“ “
4
. 氨基酸组成分析 : 经 日立
一
83 5 型氨基酸自动分析仪侧定 , 结
果见表 1 .
弓. 糖的抑 .}: }{实验 : 糖类对川中
南星凝集索凝集兔红细胞时的抑制
作用 , 结果见表1 1 . 从表可见 , 川
中南星凝集素的糖结合专 一 性 为
N
一乙吼 一 D 一 半乳糖胺 .
6
. 人血型专一性实验 : 用系
列稀释法 , 以兔红细胞作对照 , 当凝
集素浓度仅 彻 g / m l 时 , 兔红 细胞
就能发生凝集 , 而对人 A 、 B 、 0 以
及 A B 型血 , 凝 集 素 浓 度 高 达
。 . 勿书 g /m l ,
一也不发生凝集 , 同时以
C on A 作平行实验 , 则凝集很快发
生 。
诀·气矛
\才缨份
卿ù刀飞一夕
户仁ǔ`
图 lV 建续 S D S 一 凝胶电泳测分子量标准曲线
· 代表标准蛋白 ; 乙 代表样品
. 一 ~ , , 钾 . ~ . 甲. . 冲` , 、 .如 , , “ , ~ . 日~一 , 馆 ,一一~ . . . . ~ . . . 润 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一q诊81ō9,工/O乃自月了
丙 氛
5
。
2
。
3
。
1
。
酸氛
故酸
无酪祯苯9 . 6 7米
4 3
。
8
1
.
3 0
3
。
62
1
。
4 8
木汉J
酸
氛效”武,
组精脯色
门冬氛酸
苏 氛 酉变
丝 氛 百复
谷 氛 酸
甘 氨. 酸
丙 氛 酸
半此氛酸
蝴 氛 酸
甲硫氛酸
异亮氛酸
名. 9 9
4
.
2 2
6
。 招
4
.
3 6
工. 9 0
0
.
69 4
礴 . 招
0
.
2 5
2
. 么台一一一~ ~ 困一一一呜 .一一一 沈一 . , . ~ . ~ ~ . ~ 两~ ~ ~ .表 亚 : 川中南星凝集素的氨基酸组成 帝 每 i以克蛋白质的氨爹酸残基克数7 . 川中南星凝集素的促有丝分裂活性 : 该凝集素对人外周血淋巴细胞有较强的促有丝分裂活性 . 经 7 5℃ 2 。 分钟热处理后的样 : ;人仍表现 出较高的活性 . 见表万 .
8
. 抗热性试验 : 川中南 ’星凝集索在较 i泊勺温度作用后 , 仍能保持其凝血活性和促
有丝分裂活性 , 表明它具有较强的抗热能力 . 结果见表 开和表 V .
9
. 川中南星凝集素在体外与人肝癌细胞的作用 . 加入美兰液继续保温后 , 观察其
颇色未变 , 提示该凝集索对人肝癌细胞有抑制趋势 .
讨 论
川中南星在四川大邑等地又称天南星 , 入药时亦称黑南里或南星 , 为历史悠久的中
药之一 , `常用于解毒消肿 , 软 坚 散 结 . 有报道天南星对于小白鼠的肿瘤有抑制作用 ,
鲜天南星的提取浪对 H c il a 乡田饱有较强门抑制半「三1 , 近年米用鲜南星制成南星阴道拴剂
第 1 期 川中南星 ( A r i s a e m a W i l s o n i : E n g l )凝集素的纯化及其部份性质的研究 9 5
牛血清白委白
过载化抬酶
` 币厂刃 J 口少
嘴蛋日前
\ 伽州
“ “
4
. 氨基酸组成分析 : 经 日立
一
83 5 型氨基酸自动分析仪侧定 , 结
果见表 1 .
弓. 糖的抑 .}: }{实验 : 糖类对川中
南星凝集索凝集兔红细胞时的抑制
作用 , 结果见表1 1 . 从表可见 , 川
中南星凝集素的糖结合专 一 性 为
N
一乙吼 一 D 一 半乳糖胺 .
6
. 人血型专一性实验 : 用系
列稀释法 , 以兔红细胞作对照 , 当凝
集素浓度仅 彻 g / m l 时 , 兔红 细胞
就能发生凝集 , 而对人 A 、 B 、 0 以
及 A B 型血 , 凝 集 素 浓 度 高 达
。 . 勿书 g /m l ,
一也不发生凝集 , 同时以
C on A 作平行实验 , 则凝集很快发
生 。
诀·气矛
\才缨份
卿ù刀飞一夕
户仁ǔ`
图 lV 建续 S D S 一 凝胶电泳测分子量标准曲线
· 代表标准蛋白 ; 乙 代表样品
. 一 ~ , , 钾 . ~ . 甲. . 冲` , 、 .如 , , “ , ~ . 日~一 , 馆 ,一一~ . . . . ~ . . . 润 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .一q诊81ō9,工/O乃自月了
丙 氛
5
。
2
。
3
。
1
。
酸氛
故酸
无酪祯苯9 . 6 7米
4 3
。
8
1
.
3 0
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。
62
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。
4 8
木汉J
酸
氛效”武,
组精脯色
门冬氛酸
苏 氛 酉变
丝 氛 百复
谷 氛 酸
甘 氨. 酸
丙 氛 酸
半此氛酸
蝴 氛 酸
甲硫氛酸
异亮氛酸
名. 9 9
4
.
2 2
6
。 招
4
.
3 6
工. 9 0
0
.
69 4
礴 . 招
0
.
2 5
2
. 么台一一一~ ~ 困一一一呜 .一一一 沈一 . , . ~ . ~ ~ . ~ 两~ ~ ~ .表 亚 : 川中南星凝集素的氨基酸组成 帝 每 i以克蛋白质的氨爹酸残基克数7 . 川中南星凝集素的促有丝分裂活性 : 该凝集素对人外周血淋巴细胞有较强的促有丝分裂活性 . 经 7 5℃ 2 。 分钟热处理后的样 : ;人仍表现 出较高的活性 . 见表万 .
8
. 抗热性试验 : 川中南 ’星凝集索在较 i泊勺温度作用后 , 仍能保持其凝血活性和促
有丝分裂活性 , 表明它具有较强的抗热能力 . 结果见表 开和表 V .
9
. 川中南星凝集素在体外与人肝癌细胞的作用 . 加入美兰液继续保温后 , 观察其
颇色未变 , 提示该凝集索对人肝癌细胞有抑制趋势 .
讨 论
川中南星在四川大邑等地又称天南星 , 入药时亦称黑南里或南星 , 为历史悠久的中
药之一 , `常用于解毒消肿 , 软 坚 散 结 . 有报道天南星对于小白鼠的肿瘤有抑制作用 ,
鲜天南星的提取浪对 H c il a 乡田饱有较强门抑制半「三1 , 近年米用鲜南星制成南星阴道拴剂
第 1 期 川中南星 ( A r i s a e m a W i l“ o n i i E n g l )凝集素的纯化 及其部份性质 的研 究 9 7
一 曰 . . . . . . . . 口 . . . . 曰 . . . . . . . . .门, 硬 , , . 刁曰口 . . r 月 . . . . 侧 . . . . 户 . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . .洗脱 .解吸过程中 , 用 O . SM G I C 一 0 . 9% N a C I , o . sm G a l 一 0 . 9 % N a C I , 0 . SM N a e l , o . SM
脉均不能将活性成分解吸下来 。 用 ZM脉能得到一活性峰 , 但再用 6 M 服再洗时也仍出
现一较小的活性峰 , 这种现象与李士云报道的情况相似 2丁. 盘状 电泳检 测 ZM 脉和 6M
脉洗脱的样品 , 带型一致 .
P T G
一
A B s E
一
A ga
r 是非专一性的亲和吸附剂 , 它带有多种结构不 同的糖链经’ , 在分
离纯化凝集素的种类上和以胎球蛋 白作为配基的亲和吸剂附相似「 ’ 。 】, 即不论糖专一性是
单糖的 (如对 jG c 、 M a n 、 G al 或 N A N A ) 还是低聚糖的 (如 甲壳二糖 、 甘露聚糖等 )
的凝集素都能吸附 . 据报道已有多种凝集素在此亲和柱上可被吸附 〔“ 1 . 这种 “ 通用亲和
吸附剂 ” 恰恰又带来它的弊病 , 即亲和层析所得样品不容易是均一的纯品 . 木文报道的
)l }中南星凝集素就是一例 . 这 与然由于它具不 同的糖链结构 , 也许还与非专一的次级键
作用有关 (如疏水区的作用等 ) . 但无论如何 , 利用这一亲和柱 , 可以去掉大 量 杂 蛋
白 , 为进一步纯化提供 良好条件 . 另外 , P T G 偶联于 A B S E 一 A g a r 是在较温和条 件下
( P H 7
.
0
一
7
. 匀 进 行的 , 这是澳化氰活化载体法须在强碱条件 ( P H功 左右 ) 下进行所不
及灼 . 当然这两种方法偶联 P T G 后在纯化凝集素的质和量的比较上尚未进行 . o s a w -a 也
只报道了用 p T G 一活化 S e p h a r o s e 纯化 p H A 的方法 〔 ` 王」 .
糖抑制实验过程中 , 发现低浓度的各单糖和双糖 ( I Om M , Z Om M ) 对川中南星凝集
素不能抑制 , S Om M 时 D 一 G a NI A c 才表现出抑制 , 但不十分强 , 这提示实验所用各糖似
乎还不是最佳的 专一抑制搪 . 据报道有些凝集素的专一结合糖不是单糖和双糖 , 而是聚
糖二” 了, 那么是否川中南星凝集素的糖结合位点更适合于某种低聚糖 ? 也许川中南星凝集
素除了 D 一 G a 1N A c 的结合位点外 , 还有另外的糖 (如聚糖 ) 结合位点? 即出现凝集素的
糖结合专一性不严格 〔 ’ 3 〕 .
川中南星凝集素的抗热性非常有趣 . 80 ℃ 切 分钟热处理尚能保持较好的凝血 .活性 .
经 7 5℃ 20 分钟处理的凝集素粗品还能被亲和柱吸附 , 同时并表现出较高的促有丝分裂
活性 . 这种抗热性是否与糖 一蛋 白复合物的结构特点相关 ?
川中南星凝集素对兔红细胞的凝集效价很高 , 凝集素浓度仅达 2群g加 1 时就能发生
凝集 , 但对人 A 、 B 、 o 血型的血细胞却无作用 , 这一现象与天南星科半夏 属 三 叶半
夏 「’ ` 以及犁头尖属白附子凝集素的凝血情况极为相似 , 提示了川中南星凝集素不仅具有
供血动物的种属专一性 , 还暗示了同一科不同种属植物凝集素在凝血作用上的相关性 .
文献报导鲜夭南星有抑癌能力 , 亲和纯化的川中南星凝集素在体外也表现出一定的
抑癌趋势 , 这其中有无某种联系 , 值得深入探索 .
很多外源凝集素已成为生物膜 、 免疫学 、 生殖生理学 、 细胞生物学和生物化学 、 生
物物理学研究中强有力的工具 , 也越来越多地用于分离和鉴定含糖生物高分子 . 内源凝
集素在自身生物体内的功能也日益受到重视 . 川中南星凝集素的亲和纯化又提供了一种
新的凝集素 , 对其性质和功能以及在中药入药时的药理作用等 , 值得开展更多更细致的
工作 。
致谢 : 细胞研 完室 陈文元副教授 、 王子淑讲师测 定促有丝分裂活性 , 大 邑县 中药材
公司衷志 中老师协助采集材料和标本 , 特此致谢 .
9 3 四 川 大 学 学 报 9 8 15年
参 考 文 献
袁 「 1”一等 : 生小勺化学与生之吻物理学报 · 飞3 3 () , 108 1 , 29 1 ·
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L o w r y
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0
.
H
.
e t a l
. ,
J
.
B i o l
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C h e m
. ,
19 5 1
,
1 93
,
2 65
,
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W e b
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s t u d i C s o n t h e c a r o o h y d r a t e u l
飞
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o f t h y r o g l o b u l i n
·
J
19 7 2
,
247
,
18 25
.
B i o l
.
C h e m
. ,
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,
B
·
A
· 夕t a l · , I s o j a t i o n o f l e c ti o n “ o f d i f f e r e n t “ p e c i f i c i ti e s
a b s o r b e n t
.
J
.
B i 0 1
.
C h e m
. ,
1马7 5 , 250 , 7 5 35 .
M a t s u m o t o
,
1
.
a n d O s aw
a , T
, ,
T h e s p o e i f i e p u r i f i c a t i o h o f v a r i o u s
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王克夷 : 生物化学与生物物理学报 1 5 ( 3) 19 83 , 2 6 5 .孙 i措等 : 生物化学与生物物理学报 , 2 5 (透) , 1匀8 3 , 3 33 .
O n a
s宝n g l e a f f i n i t y
e a r b o h y d r a t e一 b i n d i n g
ù .Jfl J, .J砂ùUJ .lq口gJ点UJ. .1, .`L, 11r卫`r
.L. rL,尸
O N T H E P U R I F cI A T I O N A N D C E R T A I N P R O P E R IT E S
O F T H E L E C IT N F R O M A R I S A E M A 丫VI L S O N l l E N G L __ /
X i a o Z h i
一
X i o 刀 9 2 人e n g Z ho 7 zg 一 K 盆 i
A B S T R C T
A I e e t i n 0 f p 1a n t O r ig i n w a s i s o j a t ed f or m t h
e t ub e r o f A r i穷a e m a w i l s o n i i
, a e h i n e s e t r a d主t i o n a l
m e d i e i n e
.
P u r i f ie a t i o n w a s e a灯 i e d o u t b又 a f f i n i t y e址 o m a t o g r即hy o n 孙 r e ien t h” o g l o b u l i n -
A B S E一 tC o s s一 iL n k e -d A 只 a r
.
T h e p u r i f i e d l e e t i n 只i v e s wt o b a n d s o n d i s e e l e e t r o P h o r es i s
。 a n d t h e
m o l e e u l a r w e i g h t s a s e s t im a t e d by S D S
一P o l y a e r y l a m i d e g e l e l e e t or P h o r e s i s a r e 24
,
0 U0 a n a 1 1
,
UU U
r e s p e o t i v o l y
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I t e o n t a i n s v e r y s m a l l a m o
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