全 文 ：28卷 06 期
Vol.28 , No.06
草　业　科　学
PRA TACULT URAL SCIENCE
969-973
06/2011
小花碱茅 HKT1;4基因片段的
克隆与序列分析
李 剑 ,赵常玉 ,吴永娜 ,包爱科 ,马清 ,郭 强 ,王锁民 ,张金林
(兰州大学草地农业科技学院 农业部草地农业生态系统学重点开放实验室 ,甘肃兰州 730020)
摘要:为研究小花碱茅(Puccinel lia tenui f lora)拒 Na+的分子机制 , 根据 GenBank 中已登录的植物 HKT1;4 基因
保守序列设计一对简并引物 ,从小花碱茅幼根中提取总 RNA , 采用 RT-PCR 方法扩增出 HKT1;4 基因片段并连
接到 pM D19-T Simple载体上 , 经亚克隆 , PCR阳性检测后测序 ,得到一段长629 bp 的序列。序列分析表明 , 该片
段编码 209个氨基酸 , 与 GenBank 中注册的高等植物 HKT1;4 基因核苷酸序列同源性在 74%以上 , 与 HKT1;4
蛋白氨基酸序列同源性在 60%以上 ,最后将其命名为 PutH KT1;4。
关键词:小花碱茅;HKT1;4 基因;克隆;序列分析
中图分类号:Q943.2;S543 +.903　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2011)06-0969-05
＊ 　大多数农作物不能在高盐环境下生长 ,灌溉地盐
渍化对农业生产力造成了严重威胁[ 1-2] 。盐渍化土
壤中 ,Na+是一种毒害离子 , 它可以抑制 K +的吸
收 ,降低酶活性 ,影响植物新陈代谢 ,最终表现为植
株生长缓慢甚至死亡[ 3-4] 。K+是植物生长发育所必
需的矿质元素之一 ,也是植物细胞中最丰富的一价
阳离子 ,占植物干质量的 2%～ 10%,它参与调节细
胞膨压 、电荷平衡 、气孔开闭和酶活性等许多重要的
生理生化过程[ 5-6] 。在盐胁迫下 ,限制 Na+吸收 ,增
加 Na+外排 ,同时提高对 K +的选择性吸收能力 ,维
持细胞中高的 K+/Na+是植物抗盐性的关键[ 7] 。
大量研究发现 ,高亲和性 K +转运蛋白(high-aff inity
K+ t ranspo rter , HK T)在高等植物拒 Na+和选择性
吸收 K +过程中发挥着重要作用[ 8-9] 。Schachtman
和 Schroeder[ 10]首次从小麦(Trit icum aest ivum)幼
根中克隆到 TaHKT2 ;1 ,随后相继在其他植物中也
发现了 HKT 类蛋白 。根据异源表达差异 , Platten
等[ 11]将 HK T 类蛋白分为两类:第 1 类以拟南芥
(Arabidopsis thal iana)A tHK T1;1为代表 ,主要转
运 Na+ ,在 Na+回收中发挥作用 ,包括水稻(Oryza
sat iva)OsHK T1;5 、一粒小麦(T .monococcum)Tm-
HKT1;4-A2 、T mHKT1 ;5-A1和小麦 TaHKT1 ;5-
D1;第 2 类以小麦 TaHKT2;1 为代表 , 为 K +和
Na+的共转运体 ,在 K + 、Na+选择性吸收中发挥重
要作用 ,包括水稻 OsHK T2;1和 OsHK T2;2等 。
小花碱茅(Puccinell ia tenui f lora)广泛分布于
我国东北和西北地区 ,是禾本科碱茅属多年生优质
牧草 ,耐盐碱[ 12-13] 。近年来 ,小花碱茅极强的抗盐碱
性引起人们的广泛关注 。阎秀峰等[ 14] 通过洗叶技
术 ,认为小花碱茅的耐盐机制是其具有泌盐能力。
韦存虚等[ 15] 采用扫描电镜和 X 射线电子探针研究
发现蜡质层泌盐可能是其正常功能。但解剖学和叶
表面观察都没有发现盐腺或泌盐结构[ 16-18] 。研究表
明 ,小花碱茅根部对 K +/Na+选择吸收能力很强 ,
约是小麦的 2倍[ 19] ;最新研究表明 ,叶片泌盐并不
是小花碱茅耐盐的主要机制;限制 Na+单向内流速
率 ,减少体内 Na+净积累 ,维持高的 K +/N a+则是
小花碱茅抗盐的关键[ 20] 。本研究在已经克隆小花
碱茅 Actin[ 12] 和 AKT1[ 13] 的基础上 ,进一步克隆其
HK T1;4基因片段 ,旨为进一步探明小花碱茅拒
Na+的分子机制奠定基础。
1　材料与方法
1.1 材料　小花碱茅种子 2010年采自甘肃省张掖
市临泽县白寨村。Escherichia coli DH5a 菌株由农
业部草地农业生态系统学重点开放实验室保存 。
1.2 主要试剂　植物总 RNA 提取试剂盒(生工生
＊收稿日期:2011-04-10　　接受日期:2011-04-18基金项目:兰州市科技发展计划项目(2010-1-39);教育部“春晖计划”合作科研项目(Z2008-1-62004)和中央高校基本科研业务费专项资金(lz ujbky-2010-2)、(lzujbky-
2009-2);教育部博士基金(20090211110001)作者简介:李剑(1985-),男 ,河南济源人 ,在读硕士生 ,主要从事牧草逆境生理与分子生物学研究。
E-m ail:lijian2009@lzu.edu.cn共同第一作者:赵常玉(1987-),女 ,甘肃西峰人 ,在读硕士生 ,主要从事牧草逆境生理与分子生物学研究。
E-m ail:zhaochy09@lzu .edu.cn通信作者:张金林　E-m ail:jlz hang@lzu.edu.cn
PRATACULTURAL SCIENCE(Vol.28 , No.06) 06/ 2011
物工程上海有限公司生产),反转录试剂盒(宝生物
工程大连有限公司生产),PCR扩增试剂盒 、PCR产
物回收试剂盒 、pMD19-T Simple 载体(宝生物工程
大连有限公司生产),DNA ladder(天根生化科技北
京有限公司生产),其他生化试剂均为进口或国产分
析纯 。
1.3 试验方法
1.3.1总 RNA的提取　从小花碱茅幼根(K +饥饿
处理 24 h)中提取总 RNA ,方法参考总 RNA 提取
试剂盒说明书。
1.3.2引物的设计与合成　通过对高粱(Sorghum
bicolor)、水稻和一粒小麦等几种植物 HK T1;4 基
因的氨基酸序列进行同源性比对 ,找出高度保守的
片段 ,对应于核苷酸片段 ,根据引物设计原则 ,利用
DNAMAN和 Primer Premier 5 .0生物软件设计一
对简并引物 PF 和 PR ,推测目的片段长度为 635
bp 。引物由上海生工合成 。PF:5′-TCG YCTACT-
TCSTCRCCRTCTCCT-3′,PR:5′-CA TGWACCCG-
CAGYTSGAGAACG T-3′, 其中 , Y =C/ T , S =
C/G , R=A/G ,W =A/T 。
1.3.3 RT-PCR扩增　反转录过程按照试剂盒操作
说明进行 。PCR反应体系:10×PCR Buf fer 5 μL ,
25 mmo l/L M gCl2 3 μL , 2 mmol/L dN TP 5 μL 、10
μmol/L PF 1 μL 、PR 1 μL , Taq DNA polymerase(5
U/μL)0.5 μL , cDNA 2 μL ,加无菌水至总体积 50
μL。反应程序:94 ℃热启动 2 min ;94 ℃变性 30 s 、
58 ℃退火 45 s 、72 ℃延伸 50 s ,30个循环;最后 72
℃延伸 7 m in。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物后 ,
按照胶回收试剂盒说明书回收和纯化目的片段 ,保
存于-20 ℃备用。
1.3.4阳性克隆的筛选与鉴定　将回收目的片段与
pMD19-T Simple载体按照物质的量 10 ∶1混合 ,
于 16 ℃连接 2 h。连接产物全部加入到 100 μL 感
受态大肠杆菌细胞中 ,冰浴 30 min;42 ℃热激 90 s;
冰浴 1 min 。加入 800 μL 无氨苄青霉素的液体 LB
培养基 ,摇菌 1 h(37 ℃, 180 r/min)。将菌液加入
含有氨苄 、x-gal 和 IPTG 的 LB 固体培养基上 , 37
℃过夜培养。次日 ,挑选白色单菌落 ,经 PCR检测
后送生工生物工程上海有限公司测序。
1.3.5 序列的生物信息学分析　BLAS T 在 NCBI
网站(ht tp ://blast.ncbi.nlm.nih .gov/Blast .cg i)上
进行;序列的翻译和分析比较通过 DNAMAN 和
Primer Prem ie r 5.0生物软件进行。
2　结果
2.1 总 RNA 的提取与检测　以小花碱茅幼根
为材料提取总 RNA ,甲醛变性胶电泳和 NANO-
DROP1000核酸蛋白检测仪检测表明 ,提取的总
RNA完全满足下一步试验需要。
2.2 RT-PCR 扩增 　以总 RNA 反转录得到的
cDNA 为模板 ,用简并引物 PF 和 PR进行 PCR扩
增 。PCR产物经凝胶电泳检测后发现在比 600 bp
略高处有一条带 ,且上下无杂带 ,与预测的目的片段
大小基本一致(图 1),推测可能是 HKT1 ;4基因片
段 ,有待进一步检测。
图 1　PCR产物凝胶电泳图
　注:M 为 DNA ladder;1 为目的片段。
2.3 阳性克隆的鉴定 　将目的片段连接到
pMD19-T Simple 载体上 , 转化 E .col i DH5a 。从
LB培养基平板上随机挑选 5个白色单菌落 ,分别摇
菌后提取质粒 ,进行 PCR检测 ,得到的扩增片段大
小与所克隆片段一致(图 2),表明这些为阳性克隆 ,
可以进行测序。
图 2　阳性克隆的 PCR检测
　注:M 为 DNA ladder;1、2、3为阳性克隆。
2.4 测序结果与序列分析　阳性克隆测序结果
表明 ,本试验得到一段长 629 bp的 HK T1;4序列
片段 ,与 GenBank 中注册的高等植物 HKT1 ;4基
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因核苷酸序列同源性在 74%以上;编码 209个氨基
酸(图 3),将此氨基酸片段与其他植物 HK T1;4 蛋
白氨基酸进行同源性比对后发现 ,与一粒小麦 Tm-
HKT1;4-A2 、TmHKT1;4-A1 、高粱(S orghum vul-
gare)SbHKT1 ;4和水稻 OsHK T1;4 的同源性分
别为 73 %、70%、67%和 61%,从而确定本试验克隆
的片段为小花碱茅 HKT1;4基因 ,并命名为 PutH-
KT1;4(图4)。采用在线 TMpred Server软件(http://
www .ch .embnet.o rg/ sof tw are/TMPRED fo rm.
htm l)对小花碱茅 PutHKT1;4氨基酸序列进行跨
膜区预测发现可能存在 5 个跨膜区 ,序列位置分别
为1 -17 ,32-51 ,61-82 ,154-171 ,193-209(图3 、
图 3　小花碱茅 PutHKT1;4 基因片段核苷酸及
推测的氨基酸序列
　注:加框表示引物 PF 和 PR, 划线序列为预测的跨膜区位
置。
图 4　PutHKT1;4 与其他植物 HKT1;4
氨基酸序列的系统进化树
图 5)。多重比对后发现 ,小花碱茅 PutHK T1;4氨
基酸序列上存在编码 P-loop A 区域的一段保守序
列 IDLFFTAVSSM S ,箭头所指的 S为 P-loop A区
域的特异性丝氨酸离子选择性位点(图 6)。
图 5　PutHKT1;4氨基酸片段的跨膜区预测
　注:图中实线和虚线表示对 PutHK T1;4 序列 TMpred 给
出的两种建议模型的信号 , 而 i->o 和 o->i分别表示建议
模型相对膜的取向 , 前者为由外到内 ,后者为由内到外。
3　讨论与结论
土壤中过多的 Na+对植物是有害的 ,尤其是对
盐比较敏感的农作物。研究 Na+在植物体内的再
循环途径 , 对于提高植物抗盐性意义重大 。水稻
OsHK T1;5的作用是从木质部中回收 Na+ ,参与
Na
+在植物体中的再循环 ,从而减少 Na+在植株地
上部的积累[ 8] 。James等[ 21] 从硬粒小麦(T .turgi-
dum)耐盐品系 149中分离到两个排 Na+的主效基
因 Nax1和 Nax2 ,拥有任意一个基因的品系植株比
其他品系有更低的从根部向地上部转运 N a+的比
率 ,同时增加吸收 K +的比率 。Nax1位点能够从叶
鞘和根木质部卸载 Na+ ,防止 Na+在地上部的过多
积累 ,而 N ax2位点只能在根部发挥作用。后来研
究表明 ,一粒小麦 TmHK T1;4-A2可能是 N ax1的
候选基因 , TmHK T1;5-A1 可能是 Nax2的候选基
因[ 2 2-23] 。本研究所克隆的 PutHKT1;4基因和一粒
小麦 TmHKT1;4基因一样 ,属于 HK T 家族的第 1
类 。通常第 1类 HKT 在第 1个 P-loop区域都有一
个丝氨酸离子选择性位点 ,第 2类为甘氨酸离子选
择性位点(个别除外 ,如水稻 OsHKT2;1),这些位
点可能与 K + 、Na+选择性吸收相关[ 11] ,本试验克隆
到的小花碱茅 PutHK T1;4也有一段 12个氨基酸
的保守P-loop区域 ,且有丝氨酸位点 。小花碱茅蕴
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图 6　PutHKT1;4 氨基酸序列与其他植物 HKT1;4 氨基酸序列多重比对图
　注:方框所圈的为 PutH KT1;4 P-lo op A 保守序列 ,箭头所指的 S 为丝氨酸离子选择性位点。
藏着丰富的抗盐基因资源 ,PutHKT1 ;4基因片度的
克隆将为进一步研究小花碱茅耐盐的分子机制奠定
了基础。
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Cloning and sequence analysis of HKT1;4 gene fragment from
halophyte Puccinellia tenui f lora
LI Jian , ZHAO Chang-yu , WU Yong-na , BAO Ai-ke , MA Qing ,
GUO Qiang , WANG Suo-min , ZHANG Jin-lin
(Colleg e of Pasto ral Agriculture Science and Technolog y , Lanzhou Univ ersity;
Key Labo rato ry o f Grassland and Ag ro-Ecosy stem s , Ministry of Ag riculture , Gansu Lanzhou 730020 , China)
Abstract:In order to investig ate Na+ exclusion mechanism of HK T1;4(HKT7)in Puccinel lia tenuiflo ra , a
pair of degenerate primer s we re designed based on the conserved sequences of the HKT1;4 genes registered
in GenBank from o ther higher plants and reverse transcript ion w as performed immediately af ter to tal RNA
was ex t racted f rom the ro ot .The part ial cDNA fragment w as amplified by PCR and the PCR product w as
subcloned into pMD19-T Simple vector and sequenced af ter PCR detection.Sequencing resul ts indicated
that the leng th of the amplified cDNA fragment w as 629 bp encoding 209 amino acid.Sequence analy sis
sugge sted that the nucleo tide sequence and the translated am ino acid sequence shared over 74%and 60% of
homolo gy to HK T1;4 gene sequences from o ther higher plants , respectively.It w as confirmed that the
f ragment that w e cloned belong s to the HKT1 ;4 gene family , therefore , we named it as PutHKT1;4.
Key words:Puccinell ia tenui f lora ;HKT1 ;4 gene;cloning;sequence analy sis
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