全 文 ：２００４－２０１１
１０／２０１６
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
第３３卷第１０期
Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．１０
ｈｔｔｐ：??ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｍ
ＤＯＩ：１０．１１８２９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０６２９．２０１５－０７０７
刘伟，张欣欣．碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、克隆及其蛋白纯化．草业科学，２０１６，３３（１０）：２００４－２０１１．
Ｌｉｕ　Ｗ，Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｘ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ，２０１６，３３（１０）：
櫧櫧櫧櫧
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毥
毥毥
毥
２００４－２０１１．
植物
生产层
碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、　　
克隆及其蛋白纯化　　
刘 伟，张欣欣
（东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，黑龙江 哈尔滨１５００４０）
摘要：从 ＮａＨＣＯ３ 逆境胁迫下碱茅（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ）的ｃＤＮＡ文库中克隆得到ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因全长ｃＤＮＡ。
ＰｕｔＳｎＲＫ２基因序列中存在１　０７７ｂｐ的开放阅读框，编码３５８个氨基酸，预测蛋白分子量为４１．１１ｋＤａ，等电点为５．
６３。实时荧光定量ＰＣＲ分析表明，在 ＮａＨＣＯ３、ＮａＣｌ、ＡＢＡ和ＰＥＧ胁迫下，ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在碱茅叶、根中均受到显
著诱导（Ｐ＜０．０５）。同时用ｐＧＥＸ－６ｐ－３载体构建了ＰｕｔＳｎＲＫ２基因的原核表达载体，将其转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），
经诱导表达纯化得到ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２融合蛋白，为后续试验分析ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白的激酶活性、验证蛋白间的相互作用
等研究奠定了基础。
关键词：碱茅；ＳｎＲＫ２；非生物胁迫；基因表达；蛋白表达与纯化
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３；Ｑ９４３．２　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１６）１０－２００４－０８＊
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ　ａｎｄ
ｉｔｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ
Ｌｉｕ　Ｗｅｉ，Ｚｈａｎｇ　Ｘｉｎ－ｘｉｎ
（Ａｌｋａｌｉ　Ｓｏｉｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｅｎｔｒｅ（ＡＳＮＥＳＣ），Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ　１５００４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ
Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ＮａＨＣＯ３ｓｔｒｅｓｓ．ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ
１　０７７ｂｐ，ｅｎｃｏｄｅｓ　３５８ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ（ＡＡＲｓ）ｗｉｔｈ　ａ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　４１．１ｋＤａ　ａｎｄ
ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐＩ　ｏｆ　５．６３．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２
ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ（Ｐ＜０．０５）ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ　ａｎｄ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐ．ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ　ｕｎｄｅｒ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｆ　ＮａＨＣＯ３，
ＮａＣｌ，ＡＢＡ，ａｎｄ　ＰＥＧ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　ｐＧＥＸ－６ｐ－３－ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｗａｓ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１ （ＤＥ３），ａｎｄ　ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２　ａｎｄ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ；ＳｎＲＫ２；ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｚｈａｎｇ　Ｘｉｎ－ｘｉｎ　Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｘｚｈａｎｇ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　蔗糖非酵解型蛋白激酶２［ＳＮＦ１（ｓｕｃｒｏｓｅ　ｎｏｎ－
ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ－１）－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　２，ＳｎＲＫ２］是植
物特有的一类Ｓｅｒ／Ｔｈｒ类蛋白激酶，蛋白激酶ＳｎＲＫ２
家族成员受渗透胁迫激活，在脱落酸（ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ，
ＡＢＡ）信号转导途径中有重要作用［１］。在拟南芥（Ａｒ－
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）中已经确定了１０个ＳｎＲＫ２，它们
中的９个被高渗和盐胁迫激活，并且这９个中的５个
被ＡＢＡ激活，但都不受冷胁迫诱导［２］。过表达Ａｔ－
＊ 收稿日期：２０１５－１２－１２　　接受日期：２０１６－０６－１３
基金项目：长江学者和创新团队发展计划（ＩＲＴ１３０５３）
第一作者：刘伟（１９８９－），男，河北唐山人，在读硕士生，研究方向为植物逆境分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｓｈａｎｌｉｕｗｅｉ＠ｙｅａｈ．ｎｅｔ
通信作者：张欣欣（１９７９－），女，黑龙江哈尔滨人，教授，博士，研究方向为植物逆境分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｘｚｈａｎｇ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
第１０期 刘伟　等：碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、克隆及其蛋白纯化
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＳｎＲＫ２．８、ＡｔＳｎＲＫ２Ｃ 后能增强拟南芥的抗旱性［３］。
拟南芥ＳｎＲＫ２．６、ＳｎＲＫ２Ｅ、ＯＳＴ１和蚕豆（Ｖｉｃｉａ　ｆａ－
ｂａ）ＡＢＡ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ
（ＡＡＰＫ）被ＡＢＡ激活，它们都参与ＡＢＡ调节的气孔
关闭和ＡＢＡ调节的基因表达［４－６］。在水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａ－
ｔｉｖａ）中，１０个成员已经被鉴定并且命名为ＳＡＰＫ１－
１０。它们都可以被高渗胁迫激活，并且ＳＡＰＫ８－１０被
ＡＢＡ激活［７］。过表达ＳＡＰＫ４ 能显著增强水稻的抗
盐性［８］。在玉米中，１０个ＳｎＲＫ２已经被克隆，大多数
玉米ＳｎＲＫ２ 基因能被一种或更多非生物胁迫诱
导［９］。在大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）中，鉴定出４个ＳｎＲＫ２
成员，都可以被高渗胁迫诱导［１０－１１］。在小麦中，只有一
个ＳｎＲＫ２成员ＰＫＡＢＡ１可以被高渗胁迫和ＡＢＡ诱
导。并且在大麦糊粉层中瞬时过表达时抑制赤霉素诱
导型启动子的活性［１２－１５］。以往的研究结果表明，许多
ＳｎＲＫ２成员参与对环境刺激的反应。不同成员具有
不同的表达模式，这表明它们可能在非生物逆境胁迫
应答中扮演不同的角色。
碱茅（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ）是一种禾本科单子
叶盐生植物，主要分布在我国的东北松嫩盐碱草甸
草原上。与其它盐生植物相比，它在极端盐恶劣的
盐碱环境下（ｐＨ　９～１０）可以完成其整个生命周期。
且具有一套独特的适应盐碱逆境的生理机制，同时
也具有潜在的实用价值［１６］。因此，碱茅是一种理想
的研究耐盐机制的盐生植物。本研究对ＰｕｔＳｎＲＫ２
基因的生物信息学以及在非生物胁迫下的表达量进
行分析，有助于揭示ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因在非生物胁迫
下的表达以及在调控植物生长发育中所起到的作
用，为进一步研究和利用基因工程技术培育抗盐碱
作物提供理论依据。另外，原核表达并纯化了的
ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白，可为继续开展其激酶活性、验
证蛋白相互作用等研究提供材料，从而为进一步阐
明ＰｕｔＳｎＲＫ２在响应其它非生物胁迫时的功能机制
奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料和试剂
１．１．１　植物材料　碱茅种子采自东北林业大学盐碱
地生物资源环境研究中心安达野外实验基地。２５℃
室温，相对湿度６０％，光照６　０００ｌｘ，光照时间为１６ｈ／
８ｈ条件下，水培养３周的碱茅幼苗为试材。
１．１．２　菌株和质粒　ｐＭＤ１８－Ｔ快速连接试剂盒购自
ＴａＫａＲａ公司；ｐＧＥＸ－６ｐ－３载体购自 ＧＥ公司。试验
所需菌株大肠杆菌ＪＭ１０９和ＢＬ２１（ＤＥ３）来自本实验
室。
１．１．３　试剂　Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；实时
定量染料购自北京全式金公司；Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏ－
ｓｅＴＭ４Ｂ购自ＧＥ公司；质粒提取试剂盒购自ＴａＫａＲａ
公司；ＰｕｒｅＬｉｎｋ? Ｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ
ｅｎｚｙｍｅｓ、ＥｘｐｒｅｓｓＬｉｎｋＴＭＴ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ、低分子量蛋
白 Ｍａｒｋｅｒ购自 Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司；ＧＳＴ
抗体、碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体
购自碧云天公司。引物合成及测序由华大基因完成。
试验中所用到的化学药品和培养基等试剂均为国产或
进口分析纯。
１．２　试验方法
１．２．１　碱茅总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ第一链的合成
　用Ｔｒｉｚｏｌ试剂法提取碱茅总ＲＮＡ［１７］。用ＴａＫａＲａ
公司的 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＴＭＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ）反转录试剂盒反转录为ｃＤＮＡ。具体操作步骤
如下：在无ＲＮＡ酶的０．５ｍＬ　Ｅｐ管中加入２μＬ　５×
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ），０．５μＬ　Ｐｒｉｍｅ－
Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ　Ｉ，０．５μＬ　Ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　Ｐｒｉｍｅｒ（５０
μｍｏｌ· Ｌ
－１），０．５ μＬ　Ｒａｎｄｏｍ　６ ｍｅｒｓ（１００
μｍｏｌ·Ｌ
－１），５００ｎｇ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ，用 ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的
ｄｄＨ２Ｏ补足至１０μＬ，将混合液至于３７℃ ＰＣＲ仪上
１５ｍｉｎ，而后８５℃５ｓ终止反应。产物保存于－２０℃
冰箱中备用。
１．２．２　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因的生物信息学分析　利用差
异显示法，在ＮａＨＣＯ３ 逆境下，从碱茅ｃＤＮＡ文库中
克隆得到碱茅逆境诱导蛋白激酶ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因全
长ｃＤＮＡ［１８］。该ｃＤＮＡ全长为１　７２６ｂｐ。利用在线
ＯＲＦ　ｆｉｎｄｅｒ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）分析ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因的 ＯＲＦ；利用
ＤＮＡＭＡＮ软件进行序列比对和分析；利用在线Ｅｘ－
ＰＡＳｙ　Ｃｏｍｐｕｔｅ　ｐＩ／Ｍｗ　ｔｏｏｌ软件对ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白
进行等电点及分子量预测；利用 ＭＥＧＡ６．０软件进行
多序列比对，再用邻接算法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）构建了
系统进化树，其中Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值设为１　０００重复；利用
ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ及ＤＮＡＭＡＮ软件进行多重比对分析。
１．２．３　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在非生物胁迫下的表达特性
分析　用实时荧光定量ＰＣＲ来分析ＰｕｔＳｎＲＫ２基因
在不同非生物胁迫下的相对表达水平，具体方法如下：
４个处理分别选取３０粒种子，每个处理３次重复，以
２５℃室温，相对湿度６０％，光照６　０００ｌｘ，光照／黑暗
时间为１６ｈ／８ｈ，水培养３周的碱茅幼苗为试材［１９］。
分别经３００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ、１５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＨ－
ＣＯ３、５０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＡＢＡ、１０％ ＰＥＧ６０００处理０、６、
１２、２４ｈ后，收集叶部组织、根部组织，液氮速冻后迅
速保存于－８０℃超低温冰箱［２０］。碱茅ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ的
５００２
草　业　科　学 第３３卷
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
提取及ｃＤＮＡ的合成同１．２。根据引物设计原则设计
实时荧光定量ＰＣＲ引物，引物由Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５软
件设计，序列上游：５’－ＡＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡ－
ＣＡＧＣ－３’，下 游：５’－ＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧ－
ＧＴＴＴ－３’；内参基因选用碱茅ＰｕｔＴｕｂｌｉｎ基因，序列
上游：５’－ＧＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧ－３’，
下 游：５’－ＡＡＣＧＡＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣ－３’，
反应在 Ｍｘ３０００Ｐ型荧光定量 ＰＣＲ 仪上进行，采用
ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染料法进行相对荧光定量检测。反应
体系：２×ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ　Ｔｉｐ　Ｇｒｅｅｎ　ｑＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ　１０
μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ上游（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）０．４μＬ，下游（１０
μｍｏｌ·Ｌ
－１）０．４μＬ，ｃＤＮＡ　１μＬ，Ｐａｓｓｉｖｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｄｙｅ　０．４μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。反应条件：９４℃预
变性３０ｓ，９４℃变性５ｓ，５５℃退火１５ｓ，７２℃延伸１０
ｓ，４０个循环，最后根据反应的溶解曲线来判断扩增结
果是否特异。每个反应３个平行，每次试验制备不含
ｃＤＮＡ的阴性样品，得到的Ｃｔ值用２－ΔΔＣｔ法来计算基
因的相对表达水平。
１．２．４　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因原核表达载体的构建及目的
蛋白 的 表 达 与 纯 化 　 碱 茅 的 ｃＤＮＡ 文 库 （１５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＨＣＯ３ 处理）由本实验室构建完成。用
文库载体通用引物扩增碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因全长片
段。上游为：５’－ＡＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴ－３’，
下游为：５’－ＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＣ－３’。反
应条件为：９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６℃退
火３０ｓ，７２℃延伸１２０ｓ，３０个循环后，７２℃延伸１０
ｍｉｎ。反应体系：ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ·μＬ
－１）０．２５
μＬ，１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１）４μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ　１μＬ，上游引物 （１０
μｍｏｌ·Ｌ
－１）１μＬ，下游引物 （１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）１μＬ，
ｄｄＨ２Ｏ补足至 ５０μＬ。纯化后的 ＰＣＲ 产物连接
ｐＭＤ１８－Ｔ载体。为了将ＰｕｔＳｎＲＫ２基因构建到原核
表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－３的ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ酶切位点之
间，在上下游引物中分别设计有ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ识别
切割位点。引物由Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５软件设计，序列
上游：５’－ＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＧ－３’，下游：
５’－ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡ－３’；以实验室保
存的连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上的ＰｕｔＳｎＲＫ２基因为模
版对ＰｕｔＳｎＲＫ２进行扩增。反应条件为：９４℃预变性
２ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５４℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，
３０个循环后，７２℃延伸１０ｍｉｎ。反应体系：ＴａＫａＲａ
Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ·μＬ
－１）０．２５μＬ，１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　５
μＬ，ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１）４μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ
１μＬ，上游引物（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）１μＬ，下游引物 （１０
μｍｏｌ·Ｌ
－１）１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ 补足至５０μＬ。将ＰＣＲ产
物电泳并回收目的条带，然后将纯化后的ＰｕｔＳｎＲＫ２
连接ｐＭＤ１８－Ｔ载体，连接产物转化大肠杆菌ＪＭ１０９
并过夜培养。将提质粒酶切鉴定的阳性克隆送华大基
因测序。测序正确的带酶切位点的ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因
和ｐＧＥＸ－６ｐ－３质粒用ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切后电泳
回收目的片段和载体片段，ＥｘｐｒｅｓｓＬｉｎｋＴＭ　Ｔ４ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅ连接过夜，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，氨苄青霉素
筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定，正确的重组
质粒进行下游试验。
将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌 ＢＬ２１
（ＤＥ３），挑取阳性克隆接种于 ＬＢ液体培养基中（含
Ａｍｐ　１００μｇ·Ｌ
－１），３７℃震荡培养过夜。次日按１％
比例转接后，３７℃震荡培养使ＯＤ６００ｎｍ达到０．５后，加
入ＩＰＴＧ至终浓度１ｍｍｏｌ·Ｌ－１，３７℃诱导０、１５、３０、
６０、１２０和２１０ｍｉｎ，并离心收集每个时间的菌体，进行
１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定［２１］。
将含有ｐＧＥＸ－６ｐ－３－ＰｕｔＳｎＲＫ２ 质粒的大肠杆菌
过夜培养物加入到２００ｍＬ液体ＬＢ培养基中，２５℃
振荡培养。当菌液的 ＯＤ６００ｎｍ达到０．５时，取７００μＬ
菌液，离心收集菌体，冻入－８０℃冰箱中。其他菌液
加入ＩＰＴＧ使其终浓度为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，依然２５℃
振荡培养，６ｈ后取７００μＬ菌液，离心收集菌体，冻入
－８０℃冰箱中。其他菌液离心收集菌体后加入裂菌
缓冲液并进行超声波碎菌，随后收集上清进行纯化。
具体纯化操作参照Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ４Ｂ纯化
试剂说明书。Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定，方法参照文献
［２２］及碧云天 ＧＳＴ抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体说明书。
１．３　数据统计分析
试验数据分析采用 Ｍｘ　３０００Ｐ型荧光定量ＰＣＲ
系统软件和Ｅｘｃｅｌ　２００７软件进行数据录入、计算、做
图；采 用 ＳＰＳＳ　１７．０ 统 计 软 件 中 ＡＶＯＮＡ 对
ＰｕｔＳｎＲＫ２表达量数据进行方差分析，ＬＳＤ多重比较
法分析处理样品间差异，显著水平为０．０５。
２　结果与分析
２．１　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因的生物信息学分析
对ＰｕｔＳｎＲＫ２ 进行 ＯＲＦ分析，ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因
序列中的开放阅读框大小为１　０７７ｂｐ，编码３５８个氨
基酸。利用ＥｘＰＡＳｙ　Ｃｏｍｐｕｔｅ　ｐＩ／Ｍｗ　ｔｏｏｌ软件预测
ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白等电点为５．６３，分子量为４１．１１ｋＤａ。
搜索ＳｎＲＫ２家族已克隆基因的氨基酸序列，用ＤＮＡ－
ＭＡＮ软件进行氨基酸序列比对并构建系统进化树。
系统进化树表明，ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白与拟南芥、水稻等作
物聚类在一起，系统进化亲缘关系在７６％左右（图１）。
６００２
第１０期 刘伟　等：碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、克隆及其蛋白纯化
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
碱茅是禾本科的植物，系统进化树分析结果也表明它
与水 稻 亲 缘 关 系 较 近。其 中 ＰｕｔＳｎＲＫ２ 与 水 稻
ＳＡＰＫ７有很高的相似性，同属于ＳｎＲＫ２ｂ亚家族［１８］。
运用ＤＮＡｍａｎ软件将随机挑选的水稻ＳＡＰＫ进行氨
基酸多重性比较（图２），比较结果显示，碱茅与水稻的
ＳｎＲＫ２相比较蛋白的 Ｎ－末端是相对保守的，并且在
蛋白激酶的结合区域和丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶活性
位点十分保守；Ｃ－末端较为多样。
２．２　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在非生物胁迫下的表达特性分析
以碱 茅 中 的 Ｔｕｂｌｉｎ 为 内 参 基 因，通 过 对
ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在几种非生物胁迫下表达的情况的实
时荧光定量 ＰＣＲ的分析发现（图３），碱茅叶、根中
ＰｕｔＳｎＲＫ２在３００ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ、１５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＨＣＯ３、５０μｍｏｌ·Ｌ
－１　ＡＢＡ和１０％ＰＥＧ胁迫下均
图１　ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白与拟南芥、水稻同源蛋白的系统进化树分析
Ｆｉｇ．１　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｐｒｏｔｅｉｎ
７００２
草　业　科　学 第３３卷
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
图２　ＰｕｔＳｎＲＫ２与水稻蛋白的多重比对分析
Ｆｉｇ．２　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２ｗｉｔｈ　Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ｐｒｏｔｅｉｎ
注：蛋白激酶结合区和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点分别在红框和緑框内表示。保守的ＡＴＰ结合位点（Ｋ，赖氨酸残基）和活性位点（Ｄ，天冬氨酸
残基）分别用红色的三角形和绿色的五角星表示。
Ｎｏｔｅ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ　ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ａｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｒｅｄ　ｂｏｘ　ａｎｄ　ａ　ｇｒｅｅｎ
ｂｏｘ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ＡＴＰ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ（Ｋ，ｌｙｓｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ（Ｄ，ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅ）ａｒｅ　ｍａｒｋｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒｅｄ　ｔｒｉａｎｇｌｅ
ａｎｄ　ａ　ｇｒｅｅｎ　ｐｅｎｔａｃｌｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图３　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在非生物胁迫下的表达特性
Ｆｉｇ．３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｕｎｄｅｒ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ
注：＊表示各处理与对照间差异显著（Ｐ＜０．０５）。
Ｎｏｔｅ：＊ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｔ　０．０５ｌｅｖｅｌ．
受到了显著（Ｐ＜０．０５）的诱导。在叶中，ＰｕｔＳｎＲＫ２
在ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＡＢＡ、ＰＥＧ胁迫下显著（Ｐ＜０．０５）
下调。其中在 ＮａＨＣＯ３ 胁迫２４ｈ时，叶中下调了
２０％左右；而在 ＮａＣｌ、ＡＢＡ、ＰＥＧ胁迫２４ｈ时，其表
达量已经下调了７５％以上。在根中，ＰｕｔＳｎＲＫ２ 在
ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＡＢＡ、ＰＥＧ胁迫下表达均显著上调
（Ｐ＜０．０５）。其中在 ＮａＨＣＯ３ 胁迫６ｈ时，根中
ＰｕｔＳｎＲＫ２表达量已到最高，上调了３倍左右；在
ＮａＣｌ、ＡＢＡ、ＰＥＧ胁迫１２ｈ时，表达量达到最高，上调
１．５～２．５倍。
２．３　ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因原核表达载体的构建及其融合
蛋白的表达与纯化
８００２
第１０期 刘伟　等：碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、克隆及其蛋白纯化
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
采用设计的引物通过ＰＣＲ扩增获得带有酶切位
点的ＰｕｔＳｎＲＫ　２基因（图４Ａ）。连接Ｔ载体后，转化
大肠杆菌ＪＭ１０９，对酶切鉴定的阳性克隆测序。分别
将连接到 Ｔ 载体上的 ＰｕｔＳｎＲＫ２ 与提取的质粒
ｐＧＥＸ－６ｐ－３用ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ进行双酶切、胶回收。
再用ＥｘｐｒｅｓｓＬｉｎｋＴＭ　Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ进行连接，转化
大肠杆菌ＪＭ１０９，将过夜培养后筛选到的阳性克隆摇
菌，用质粒小提试剂盒提取质粒并对其进行双酶切验
证（图４Ｂ），得到重组质粒。
　　将重组质粒ｐＧＥＸ－６ｐ－３－ＰｕｔＳｎＲＫ２ 转化 ＢＬ２１
（ＤＥ３）感受态细胞，过夜培养后摇菌，吸取１μＬ的菌
液作为模版进行菌液ＰＣＲ并进行琼脂糖凝胶电泳，挑
选鉴定正确的阳性克隆进行小量诱导表达，ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳结果显示（图５Ａ），诱导出分子量大约为
６０ｋＤａ的蛋白。其中ＧＳＴ标签分子量约为２６ｋＤａ，
目标蛋白预测分子量为４１．１ｋＤａ，与预测的融合蛋白
６７ｋＤａ偏小。对融合蛋白进行总平均疏水指数分析
（图６）。进行大量诱导后结果表明：ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２融
合蛋白是可溶蛋白，并且在上清中表达。大量诱导及
纯化后得到的蛋白质（图５Ｂ），经过 Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
检测 （图５Ｃ）有信号，表明成功纯化得到了原核表达
的纯化蛋白ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２。
图４　ＰｕｔＳｎＲＫ２基因的克隆和双酶切验证重组质粒
Ｆｉｇ．４　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰｕｔＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＰｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ
ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ
注：Ｍ 为 ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ，Ａ（１，２）为扩增产物；Ｂ（１，２）为ｐＧＥＸ－６ｐ－３－
ＰｕｔＳｎＲＫ２。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ａ（１，２），ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｂ（１，２），
ｐＧＥＸ－６ｐ－３－ＰｕｔＳｎＲＫ２）．
图５　ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白的诱导与纯化
Ｆｉｇ．５　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ：Ｍ，低分子量蛋白 Ｍａｒｋｅｒ；泳道１－６，分别为ＩＰＴＧ诱导０、１５、３０、６０、１２０、２１０ｍｉｎ的ＢＬ２１总蛋白）；Ｂ、Ｃ：Ｍ，低分子量蛋白 Ｍａｒｋｅｒ；１，诱导０ｍｉｎ
的ＢＬ２１总蛋白；２，诱导６ｈ的ＢＬ２１总蛋白；３，诱导６ｈ的ＢＬ２１上清；４，纯化的ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白）。
Ａ：Ｍ，ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ　１－６，ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１，ｉｎｄｕｃｅｄ　ｉｎ　０，１５，３０，６０，１２０，２１０ｍｉｎ　ｂｙ　ＩＰＴＧ；Ｂ，Ｃ：Ｍ，
ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｍａｒｋｅｒ；Ｌａｎｅ　１，ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１，ｉｎｄｕｃｅｄ　０ｍｉｎ；Ｌａｎｅ　２，ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１，ｉｎｄｕｃｅｄ　６ｈ；
Ｌａｎｅ　３，ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ＢＬ２１，ｉｎｄｕｃｅｄ　６ｈ；Ｌａｎｅ　４，ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２．
图６　ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２融合蛋白的总平均疏水指数分析
Ｆｉｇ．６　Ｇｒａｎｄ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２Ｐｒｏｔｅｉｎ
３　讨论与结论
导致植物生长发育缓慢的主要非生物胁迫因素有
干旱、盐碱和低温等。而我国盐碱地面积逐渐增加，土
壤盐害严重影响作物的生长发育和产量提高，因此，克
隆盐胁迫应答相关基因，研究耐盐机理，对于培育耐盐
品种（系）、提高盐胁迫下作物产量有重要的意义。碱
９００２
草　业　科　学 第３３卷
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
茅因为有一套独特的生理机制使它在盐碱逆境下能比
其它物种更好的生长发育。因此，它对于研究耐盐机
制的研究具有潜在的使用价值。ＳｎＲＫ２ 基因家族在
植物多种信号传导和抗逆过程中发挥重要作用［２３］。
系统进化分析（图１）和氨基酸多重比对（图２）发现
ＳｎＲＫ２蛋白激酶是一类非常保守的蛋白，结果显示碱
茅与水稻的ＳｎＲＫ２比较蛋白的 Ｎ－末端是相对保守
的，并且在蛋白激酶的结合区域和丝氨酸、苏氨酸蛋白
激酶活性位点十分保守；Ｃ－末端较为多样。此结果表
明，ＳｎＲＫ２蛋白 Ｎ－末端的保守区是响应胁迫的重要
部分［１８］，而Ｃ－末端可能与不同胁迫下产生不同表达模
式有关。
大量研究表明，ＳｎＲＫ２蛋白激酶影响植物的生长
发育，并且在响应各种非生物胁迫中起重要作
用［２，７，９，２３－２６］。本研究发现ＰｕｔＳｎＲＫ２基因在转录水平
上受到 ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＡＢＡ和ＰＥＧ等多种非生物
胁迫的诱导。在叶中ＰｕｔＳｎＲＫ２ 表达均受到显著抑
制，在根中表达均显著上调，说明它可能在响应非生物
胁迫过程中起一定的作用。在ＮａＣｌ和ＮａＨＣＯ３ 胁迫
下根的表达量较高，显示出对盐碱胁迫有较强的响应。
但是，其逆境胁迫下的抗逆相关功能需进一步验证。
此研究为以后构建转基因株系探究碱茅ＳｎＲＫ２基因
在非生物胁迫下的确切功能提供参考。
获得大量高纯度的蛋白质是对蛋白质进行生物化
学分析的基础，在原核表达蛋白系统中比较容易快速
获取大量高纯度的蛋白质，且有多种亲和纯化标签可
以选择，因此原核表达蛋白被广泛地用于表达真核生
物的蛋白质［２７］。本研究将 ＰｕｔＳｎＲＫ２ 基因构建到
ｐＧＥＸ－６ｐ－３原核表达载体上，并转入ＢＬ２１（ＤＥ３）中。
结果表明，诱导的融合蛋白比预测值偏小，利用Ｅｘ－
ＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ　ｔｏｏｌ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／
ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）对融合蛋白分析，它的亲水性平均系数为
－０．４６２，疏水性低，导致泳动速度偏快，电泳结果比预
测值偏小。对于 ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２融合蛋白，用０．５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＩＰＴＧ、２５℃诱导６ｈ，获得的蛋白质经过
还原型谷光氨肽的洗脱，收集到有足够纯度和足够量
的ＧＳＴ－ＰｕｔＳｎＲＫ２融合蛋白。这种方法为通过生物
化学方法分析ＰｕｔＳｎＲＫ２的激酶活性、验证蛋白间的
相互作用等功能，深入研究ＰｕｔＳｎＲＫ２提供材料。
本研究发现，ＰｕｔＳｎＲＫ２ 具备植物ＳｎＲＫ２ 基因
家族的固有特征，同时ＲＴ－ＰＣＲ分析表明其能够响应
盐、碱、ＡＢＡ和干旱等非生物胁迫，说明它可能在响应
非生物胁迫过程中起一定的作用。同时，本研究得到
了纯化的ＰｕｔＳｎＲＫ２蛋白，为分析它的功能提供了材
料。要揭示碱茅ＳｎＲＫ２基因在非生物逆境胁迫中的
确切功能尚需要借助转基因植物等手段开展大量深入
细致的研究，目前有关工作正在进行中。
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ｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒｉｃｅ．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８：４９．
［９］　Ｈｕａｉ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｍ，Ｈｅ　Ｊ，Ｚｈｅｎｇ　Ｊ，Ｄｏｎｇ　Ｚ，Ｌｙｕ　Ｈ，Ｚｈａｏ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｇ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｆｒｏｍ
Ｚｅａ　ｍａｙｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７（１２）：１８６１－１８６８．
［１０］　Ｙｏｏｎ　Ｈ　Ｗ，Ｋｉｍ　Ｍ　Ｃ，Ｓｈｉｎ　Ｐ　Ｇ，Ｋｉｍ　Ｊ　Ｓ，Ｋｉｍ　Ｃ　Ｙ，Ｌｅｅ　Ｓ　Ｙ，ＨｗａｎｇＩ，Ｂａｈｋ　Ｊ　Ｄ，Ｈｏｎｇ　Ｊ　Ｃ，ＨａｎＣ，Ｃｈｏ　Ｍ　Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘ－
０１０２
第１０期 刘伟　等：碱茅ＰｕｔＳｎＲＫ２基因表达、克隆及其蛋白纯化
ｈｔｔｐ：／／ｃｙｋｘ．ｌｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｏｙｂｅａｎ　ｔｈａｔ　ｈａｖｅ　ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　ａｃｉｄｉｃ　ｄｏｍａｉｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃａｒｂｏｘｙｔｅｒ－
ｍｉｎｕｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９７，２５５（４）：３５９－３７１．
［１１］　Ｍｏｎｋｓ　Ｄ　Ｅ，ＡｇｈｏｒａｍＫ，Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　Ｐ　Ｄ，Ｄｅｗａｌｄ　Ｄ　Ｂ，Ｄｅｗｅｙ　Ｒ　Ｅ．Ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ
ｓｏｙｂｅａｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ　ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ＳＰＫ１ａｎｄ　ＳＰＫ２．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，
２００１，１３（５）：１２０５－１２１９．
［１２］　Ｇｏｍｅｚ－ＣａｄｅｎａｓＡ，Ｖｅｒｈｅｙ　Ｓ　Ｄ，Ｈｏｌａｐｐａ　Ｌ　Ｄ，ＳｈｅｎＱ，Ｈｏ　Ｔ　Ｈ，Ｗａｌｋｅｒ－Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｍ　Ｋ．Ａｎ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ，
ＰＫＡＢＡ１，ｍｅｄｉａｔｅｓ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ａｌｅｕｒｏｎｅｌａｙｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，１９９９，９６（４）：１７６７－１７７２．
［１３］　Ｇｏｍｅｚ－Ｃａｄｅｎａｓ　Ａ，Ｚｅｎｔｅｌａ　Ｒ，Ｗａｌｋｅｒ－Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｍ　Ｋ，Ｈｏ　Ｔ　Ｈ．Ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ／ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ａｌｅｕｒｏｎｅｃｅｌｓ：
Ｓｉｔｅ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＰＫＡＢＡ１ｉｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００１，１３（３）：６６７－６７９．
［１４］　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｒ　Ｒ，Ｗａｇｎｅｒ　Ｒ　Ｌ，Ｖｅｒｈｅｙ　Ｓ　Ｄ，Ｗａｌｋｅｒ－Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｍ　Ｋ．Ｔｈｅ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＰＫＡＢＡ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ａ
ｓｅｅｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ＴａＡＢＦ，ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ　ＴａＡＢＦ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ－
ｏｌｏｇｙ，２００２，１３０（２）：８３７－８４６．
［１５］　Ｓｈｅｎ　Ｑ，Ｇｏｍｅｚ－Ｃａｄｅｎａｓ　Ａ，Ｚｈａｎｇ　Ｐ，Ｗａｌｋｅｒ－Ｓｉｍｍｏｎｓ　Ｍ　Ｋ，Ｓｈｅｅｎ　Ｊ，Ｈｏ　Ｔ　Ｈ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｂｓｃｉｓｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｐａｔｈｗａｙｓ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ａｌｅｕｒｏｎｅｌａｙｅｒｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７（３）：４３７－４４８．
［１６］　Ｐｅｎｇ　Ｙ　Ｈ，Ｚｈｕ　Ｙ　Ｆ，Ｍａｏ　Ｙ　Ｑ，Ｗａｎｇ　Ｓ　Ｍ，Ｓｕ　Ｗ　Ａ，Ｔａｎｇ　Ｚ　Ｃ．Ａｌｋａｌｉ　ｇｒａｓｓ　ｒｅｓｉｓｔｓ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｈｉｇｈ［Ｋ＋］ａｎｄ　ａｎ　ｅｎｄｏ－
ｄｅｒｍｉｓ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｔｏ　Ｎａ＋．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ，２００４，５５（３９８）：９３９－９４９．
［１７］　路子峰，张超，李彦忠．林烟草８个防卫反应信号蛋白编码基因的克隆及ＲＮＡｉ植物表达载体的构建．草业科学，２０１４，３１（７）：
１２７５－１２８２．
Ｌｕ　Ｚ　Ｆ，Ｚｈａｎｇ　Ｃ，Ｌｉ　Ｙ　Ｚ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ＲＮＡｉ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３１（７）：１２７５－１２８２．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１８］　李琳．碱茅（Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ）ＳｎＲＫ２ 基因（ＰｕｔＳｎＲＫ２）的克隆及功能解析．哈尔滨：东北林业大学硕士学位论文，
２０１０．
Ｌｉ　Ｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｕｃｃｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｎｕｉｆｌｏｒａ　ＳｎＲＫ２　ｇｅｎｅ（ＰｕｔＳｎＲＫ２）．Ｍａｓｔｅｒ　Ｔｈｅｓｉｓ．Ｈａｒｂｉｎ：Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
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（责任编辑　苟燕妮）
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