全 文 ：第 43 卷 第 2 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 43 No． 2
2015 年 2 月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Feb． 2015
1)中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(ＲIF2010
－ 10) ;林木遗传育种国家重点实验室专项课题(TGB2013012)。
第一作者简介:邓楠，男，1989 年 12 月生，中国林业科学研究院
林业研究所，硕士研究生。E － mail:idengnan@ sina． com。
通信作者:江泽平，中国林业科学研究院林业研究所，研究员。
E － mail:jiangzp@ caf． ac． cn。
收稿日期:2014 年 4 月 21 日。
责任编辑:潘 华。
膜果麻黄种子不同发育时期的转录组测序分析1)
邓楠 史胜青 常二梅 刘建锋 兰倩 江泽平
(中国林业科学研究院林业研究所，北京，100091)
摘 要 以不同萌发期间的膜果麻黄(E． przewalskii)种子为研究对象，应用新一代高通量测序技术平台 Illu-
mina HiSeqTM2000 对其进行转录组测序和数据重新组装，结果获得了 12 999 122 条初始序列，总长为 1 169 920 980
bp，初始序列组装获得序列片段的平均长度与 N50 值分别为 351 和 548 bp;与 COG功能注释、GO分类及 KEGG代
谢通路分析后，获得了 49 449 个 GO功能注释、17 751 个 COG功能注释以及 16 748 个 KEGG 注释;并从 KEGG 通
路中找到有关芪类、二芳基庚烷和姜醇合成途径的编码基因片段 230 个。
关键词 膜果麻黄;转录组;芪类;高通量测序
分类号 Q522 + ． 6
Transcriptomic Analysis of Germinated Seeds of Ephedra przewalskii / /Deng Nan，Shi Shengqing，Chang Ermei，Liu
Jianfeng，Lan Qian，Jiang Zeping(Institute of Forestry Ｒesearch，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，P． Ｒ．
China)/ / Journal of Northeast Forestry University，2015，43(2):28 － 32．
We sequenced the global transcriptome of different stages of germinated seeds of Ephedra przewalskii Stapf with ＲNA-
seq method using Illumina HiSeqTM 2000 platform． The results showed that 12 999 122 reads were acquired，and the total
length was 1 169 920 980 bp，the mean length and N50 length were 351 and 548 bp，respectively． Among of them，49 449
annotations was from COG，17 751 from GO and 16 748 from KEGG after functional annotation against these databases． From
KEGG pathway，230 unigenes were associated with the pathway of stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis．
Keywords Ephedra przewalskii;Transcriptome;Stilbenoid;High throughput sequencing
麻黄属(Ephedra)植物属于裸子植物门买麻藤
目麻黄科，多为灌木、半罐木或草本植物［1］，麻黄属
全世界约有 40 种，主要分布于亚洲、美洲、欧洲东南
部及非洲北部等干旱荒漠地区。我国有 12 种，4 变
种［2］，属于超旱生、强旱生、旱生系列植物，是西北
荒漠区的主要建群种，在防风固沙、稳定植被方面起
着非常重要的作用［3］。该属植物不仅与其同类的 2
种买麻藤类植物(买麻藤(Gnetum)和百岁兰(Wel-
witschia))在系统进化位置上特殊［4］，还以富含麻黄
碱而多为药用，尤其是草麻黄(E． sinica)和中麻黄
(E． intermedin) ，最早公元前 2700 年就已用于治疗
多种疾病［5］，其中主要用于支气管炎和中枢神经系
统的兴奋剂［6］。
然而，膜果麻黄(E． przewalskii)由于几乎不含
有麻黄碱，传统上常作为植被恢复的优良抗逆材料。
而在植物的整个生命周期中，种子的阶段最能够适
应不良环境，是植物对于逆境适应程度最好的反
映［7］。随着分子生物技术的发展，对于麻黄属植物
的利用与研究迫切需要它的遗传信息。因此，在该
属植物基因信息相对匮乏情况下开展其转录组研究
就显得尤为重要。随着第二代高通量测序技术
(NGS:Next Generation Sequencing technology)发展，
基因研究的速度得到大幅提升［8 － 9］。这不仅保证了
高质量测序数据，而且测序成本不到以前的
1%［10］。由于转录组能显示在特定时期基因的表达
状况，是基因挖掘以及研究生理响应相关各过程的
有利工具［11］，并且非常适合于基因组图谱尚未完成
以及遗传数据信息匮乏的物种［12 － 14］。因此，本研究
以不同发芽时期的膜果麻黄种子为研究对象，利用高
通量 ＲNA － seq技术对其转录组进行测序分析，全面
探讨不同发育时期中麻黄种子转录组基本信息，将有
利于发掘麻黄种子萌发过程中抗逆相关基因及其种
子中重要生物活性成分代谢关键基因，这对其优良性
状的遗传改良及其植被恢复具有重要意义。
1 材料与方法
膜果麻黄的种子采集于甘肃省民勤县沙漠区
(101°4941″ ～ 104°1210″E;38°345″ ～ 39°2737″
N)，大陆性沙漠气候特征明显，平均海拔为 1 400
m。对采集的种子选择大小均匀的个体置于培养皿
中湿润的滤纸上进行发芽处理，处理时间为 0、1． 5、
3、6、9、18 h，每个处理 100 颗种子。
1． 1 ＲNA提取及 cDNA合成
不同萌发时期种子的总 ＲNA 提取采用 Trizol
Ｒeagent方法(Invitrogen)，并用 DNaseΙ 进行 DNA消
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20141224.006
化处理，随后检测总 ＲNA完整性和质量(1． 2%琼脂
凝胶电泳) ;然后将各个发芽阶段的总 ＲNA 进行等
量混合后，进行 mＲNA 分离纯化(Dynabeads mＲNA
Purification Kit，Invitrogen)。用带有 Oligo(dT)的磁
珠富集真核生物 mＲNA。加入 fragmentation buffer
将 mＲNA打断成短片段，以 mＲNA 为模板，用六碱
基随机引物(random hexamers)合成第一条 cDNA
链，然后加入缓冲液、dNTPs、ＲNase H 和 DNA poly-
merase I合成第二条 cDNA链，在经过 QiaQuick PCＲ
试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱之后做末端修复、
加 poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电
泳进行片段大小选择，最后进行 PCＲ 扩增，建好的
测序文库用 Illumina HiSeqTM2000 进行测序。
1． 2 数据的拼接和组装
我们使用短初始获得的序列(reads)组装软件
Trinity［15］做转录组从头组装 Trinity 首先将具有一
定长度 overlap的初始序列连成更长的片段，这些通
过 reads overlap关系得到的不含空位的组装片段我
们称之称为 Contig。然后，我们将初始序列比对回
这些组装片段，通过 paired － end reads 能确定来自
同一转录本的不同初步组装序列以及这些序列之间
的距离，Trinity将这些序列连在一起，得到 Scaffold。
最后得到的不含空位，两端不能再延长的序列，我们
称之为 Unigene。然后对不同样品组装得到的不含空
位的序列通过序列聚类软件做进一步序列拼接和去
冗余处理，得到尽可能长的非冗余不含空位的序列。
最后，将不含空位的序列与蛋白数据库 nr、Swiss －
Prot、KEGG和 COG做 blastx比对(＜0． 000 01)，取比
对结果最好的蛋白确定不含空位的序列的序列方
向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按 nr、
Swiss － Prot、KEGG和 COG 的优先级确定不含空位
的序列的序列方向，跟以上 4 个库皆比不上的编码
基因则利用软件 ESTScan［16］确定序列的方向。
2 结果与分析
2． 1 膜果麻黄测序统计
膜果麻黄转录组测序统计结果共得到 12 999 122
初始序列，序列总长达到 1 169 920 980 bp，初步组装
得到序列数量为 78 409 条，编码基因数量为 49 449
条。组装序列的 Q20 值为 95． 76%，序列碱基 GC量
为 45． 71%。
2． 2 膜果麻黄测序数据初步分析
初始序列组装获得的序列长度通常是显示组装
质量的指标之一，如表 1 可知，膜果麻黄初步组装序
列的平均长度为 351 bp，N50 长度(设所有初步组装
序列的长度总和为 x，将所有初步组装序列按序列
按长度从小到大排序，并从第一条序列开始累加计
算总长，当长度达到 x /2 时对应的那条初步组装序
列的长度即为 N50)为 548 bp，通过组装得到的初步
组装序列长度主要分布在 200 ～ 500 bp，占所有总量
的 78． 46%;初步组装序列长度在 500 ～ 1 000 bp 的
序列数量为 12 332，占所有总量的 15 ． 73%;长度
为 1 000 ～ 1 500 bp 的初步组装序列数量占总量
的 4． 45%;长度为 1 500 ～ 2 000 bp的初步组装序列
数量为 835 个，占总数量的 1． 06%，长度大于 2 000
bp的初步组装序列数量占总数的 0． 29%。而不含
空位的序列N50值为663 bp，平均长度为517 bp。不含
空位的序列长度分布在 200 ～500 bp 的序列所占总量
比例为 62． 61%;长度分布在 500 ～1 000 bp 序列有 13
313条，所占比例为 26． 92%;长度在 1 000 ～1 500 bp的
序列占总量之和的 7． 89%;不含空位的序列长度在 1
500 ～2 000 bp序列有997条;而不含空位的序列长度分
布大于 2 000 bp序列所占比例为最少的 0． 59%。
对组装好的膜果麻黄转录组进行的不含空位的
序列的位置分布分析可得图 1，由图可知不含空位
的序列 3’端的初始序列数量比较少，而同时不含空
位的序列与其它部位匹配得到了较多的初始序列，
并且其分布都较为均匀。
表 1 膜果麻黄组装质量统计
序列长
度 /bp
初始序列
数量 /条
占总序列
数量比 /%
编码基因
数量 /条
占总基因
数量比 /%
200 ～ 500 61 519 78． 46 30 961 62． 61
＞ 500 ～ 1 000 12 332 15． 73 13 313 26． 92
＞ 1 000 ～ 1 500 3 492 4． 45 3 886 7． 89
＞ 1 500 ～ 2 000 835 1． 06 997 2． 02
＞ 2 000 231 0． 29 292 0． 59
横坐标表示初始序列在基因上的位置与基因长度的比值。
图 1 初始序列在中麻黄不含空位的序列的测序随机性结果
2． 3 膜果麻黄的 GO分类分析
Gene Ontology(GO)是一个国际标准化的基因
功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表
来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。我们
根据 nr注释信息，使用 Blast2GO 软件［17］得到不含
空位的序列的 GO注释信息。得到每个不含空位的
92第 2 期 邓楠，等:膜果麻黄种子不同发育时期的转录组测序分析
序列的 GO 注释后，我们用软件 WEGO［18］对所有不
含空位的序列做 GO 功能分类统计，从宏观上认识
该物种的基因功能分布特征。我们对获得的不含空
位的序列注释到 3 大板块:生物过程(biological
process)、细胞组分(cellular component)和分子功能
(molecular function)。其中生物过程占 45． 74%，细
胞组分和分子功能分别占 57 ． 77%和 25 ． 84%。
其中下级分类中，细胞(9674，19 ． 51%)、细胞组
分(8 829，17 ． 85%)、细胞器(7 189，14． 54)、催化
活性(6 376，12． 89%)、代谢过程(5 252，10． 62%)、
结合作用(5 232，10． 58%)、细胞过程(5 191，10．
5%)所占的比例较大。
A．生物过程包括:A1．生化过程，A2．代谢过程，A3．细胞过程，A4．刺激反应，A5．定位，A6．胞内定位的建立，A7．发育过程，A8．生物调节，
A9．组织或生物起源细胞组件，A10．生物过程调控，A11．涉及多细胞有机体的过程，A12．细胞复制;A13．繁殖过程，A14．信号传递，A15．信号处
理，A16．多生物过程，A17．生物过程负调控，A18．生长，A19．生物过程正调控，A20．死亡，A21． 免疫系统过程，A22． 病毒繁殖，A23．生物附着，
A24．染色，A25．节律性过程，A26 移动。
B．细胞组成包括:B1．细胞，B2．细胞组分，B3．细胞器，B4．细胞器组分，B5．高分子配合物，B6．膜附着腔，B7．胞外区，B8．胞外区组分。
C(分子功能):C1．催化活性，结合，C2．结合，C3．载体活性，C4．分子转导活性，C5．酶调节活性，C6．转录调节因子，C7．抗氧化活性，C8．蛋
白结合转录因子的活动。
图 2 膜果麻黄转录组不含空位的序列 GO分类结果
2． 4 膜果麻黄的 COG分类分析
将膜果麻黄转录组所得的编码基因与 COG
(Cluster of Orthologous Groups of proteins)数据库进
行比对，然后对其做功能分类和统计，共获得了
17 751 COG 功能注释，分为 26 个功能分类(图
3)。从功能分类结果来看，Ｒ 类常规功能预测
(General function predietion only)的编码基因数量
为最多(2 861 个)，占总注释数的 16． 12%;然后，
依次是 K 类转录(Transcription) (1 489，8． 39%)、O
类翻译后修饰(Posttranslational modification，protein
turnover，chaperones) (1 452，8． 18%)、L 类(Ｒepli-
cation，recombination and repair) (1 413，7． 96%)、J
类(Translation，ribosomal structure and biogenesis) (1
313，7． 4%)和 G 类(Carbohydrate transport and me-
tabolism) (1 093，6． 16%)所占比例比较大;而 Y 类
(Nuclear structure)和 W 类(Extracellular structures)
注释最少，分别仅有 5 和 3 条编码基因。
2． 5 膜果麻黄的 KEGG注释
KEGG作为全球影响力最大的生物代谢数据库
之一［19］，涉及系统信息、基因组信息和化学信息
等［20］。通过 KEGG注释发现，膜果麻黄种子萌发期
间共有 16 748 个编码基因参与了 125 个代谢通路，
排名前 15 位的代谢通路见表 2。其中代谢途径
(Metabolic pathways)参与基因最多，达 3 768 个，占
所有编码基因的 22． 5%;然后是次生代谢产物生物
合成途径(Biosynthesis of secondary metabolites)有
1 888 个编码基因参与，占 11． 27%;再次是植物激
素信号传导(Plant hormone signal transduction)的编
码基因占 4． 54%(761 个)等。
表 2 KEEG注释中数量前 15 个通路
通路
编码基因
数量 /条
占总编码基
因百分比 /%
编号
代谢途径 3 768 22． 50 ko01100
次生代谢物生物合成 1 888 11． 27 ko01110
植物激素信号传导 761 4． 54 ko04075
植物病原菌互作 704 4． 20 ko04626
剪接体 698 4． 17 ko03040
ＲNA运输 596 3． 56 ko03013
内质网上的蛋白质加 517 3． 09 ko04141
嘌呤代谢 446 2． 66 ko00230
苯丙烷代谢 416 2． 48 ko00940
泛素介导的蛋白降解 400 2． 39 ko04120
淀粉和蔗糖代谢 385 2． 30 ko00500
真核生物中的核糖体合成 382 2． 28 ko03008
内吞作用 396 2． 36 ko04144
核糖体 368 2． 20 ko03010
ＲNA降解 357 2． 13 ko03018
03 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43 卷
A．加工和修改;B．染色体结构及动力系统;C． 能量生产和转换;D．
细胞周期控制、细胞分裂、染色体分区;E． 氨基酸运输和代谢;F． 核
苷酸运输和代谢;G．碳水化合物运输和代谢;H．辅酶运输和代谢;I．
脂类运输和代谢;J．翻译、核糖体结构和生物转化;K．转录;L． 复制、
重组和修复;M． 细胞壁 /膜 /包膜生物合成;N． 细胞运动;O． 蛋白质
转译后修饰，蛋白转换，分子伴侣;P．无机离子运输和代谢;Q． 次生
代谢产物生物合成、运输和分解代谢;Ｒ． 一般功能预测;S． 未知功
能;T．信号传导机制;U．细胞内运输、分泌和膜泡运输;V．防御机制;
W．细胞外结构;Y．核结构;Z．细胞骨架。
图 3 编码基因的 COG分类结果
2． 6 膜果麻黄芪类化合物等合成代谢途径发掘
膜果麻黄传统上认为没有药用价值，仅作为荒
漠恢复灌木。KEGG代谢途径分析显示膜果麻黄萌
发种子的转录组中存在芪类、二芳基庚烷和姜醇
(Stilbenoid，diarylheptanoid and gingerol biosynthesis)
的合成途径。转录组中涉及该途径的基因共有 230
条编码基因，占所有片段总数的 1． 37%。由表 3可看
出，膜果麻黄中涉及上述合成途径的基因及其编码的
酶有奎宁酸香豆酰转移酶(shikimate O － hydroxycin-
namoyltransferase，HCT)、肉桂酸 4 一羟基化酶(trans
－ cinnamate 4 － monooxygenase，C4H)、香豆酸一 3 一
羟基化酶(coumaroylquinate(coumaroylshikimate)3’－
monooxygenase，C3’H)和咖啡酰辅酶 A － O －甲基转
移酶(caffeoyl － CoA O －methyltransferase，CCOAMT)。
表 3 膜果麻黄中涉及芪类、二芳基庚烷和姜醇合成途径的
基因信息
酶编
号
同源
编号
编码蛋白 基 因
唯一比对到基因的
初始序列数量 /条
23． 1． 133 K13065 奎宁酸香豆酰转移酶 HCT 19549
1．14．13．11 K00487 肉桂酸 4一羟基化酶 CYP73A、C4H 577
1．14．13． － K09754 香豆酸一 3一羟基化酶 CYP98A3、C3’H 2021
2．1． 1． 104 K00588 咖啡酰辅酶A －O －甲基转移酶 CCOAMT 384
1．14． － ． － K00517 — — 11947
3 结论与讨论
荒漠植物种子萌发是一个复杂的过程，荒漠植
物都在生长期的进化历程都演化出了与严酷生境相
适应的萌发对策［21］，膜果麻黄作为西北地区重要的
生态灌木之一，通过研究其种子萌发过程，对深入研
究其系统进化、环境的适应及次生代谢等具有重要
意义。本研究为了更加系统和完整地获取膜果麻黄
种子萌发过程中的转录组数据信息，选用了不同萌
发时间的膜果麻黄种子以获取覆盖度广且较为准确
的信息。测序和组装结果获得了 12 999 122 个初始
序列，总长为 1 169 920 980 bp，初步组装序列的平均
长度为 351 bp，N50 长度为 548 bp;编码基因的 N50
值为 663 bp，平均长度为 517 bp。与前人研究相比
较，如根腐线虫转录组［22］中共有 326 971 条初始序
列，初步组装序列的平均长度为 458 bp;日本三角涡
虫转录组［23］中拼接得到 37 218 条编码基因数据，平
均长度 468 bp。这说明本研究测序所得到的数据量
大，组装效果较好。
芪类次生代谢物具有抗病、抗氧化、抗肿瘤、抗
炎症等多种生物活性［24］，已在豆科(Leguminosae)、
松科(Pinaceae)、葡萄科(Vitaceae)和买麻藤科
(Gnetaceae)等不同植物中发现;二芳基庚烷具有抗
肿瘤活性，而姜醇在调味品、保健食品、药品等行业
应用广泛。本研究发现了有关芪类、二芳基庚烷和
姜醇合成的相关 230 条编码基因，其中所发现的基
因大多都已在别的物种中有过克隆等其他研究。如
HCT基因是木质素生物合成途径中的一种酶，在苯
丙烷 C3 羟基化作用的上、下游起着双重调节作
用［25 － 27］;王雪霞［28］通过研究认为该基因对于植物
的分子进化及植物分类上可能具有一定的意义;而
研究表明 C3H 催化苯丙烷苯环 C。发生羟基化反
应可能发生在香豆酸或香豆酸莽草酸 /奎宁酸的水
平上，虽然其最终地位还未最终确定，但该遗传特性
的研究可能对 C3H 在植物的进化意义及植物体的
综合利用提供理论依据［29］;而 C4H 基因属于
CYP73 亚家族，参与植物中的许多天然代谢产物如
苯丙烷类、生物碱等的生物合成［30］。由于 C4H 基
因在植物的次生代谢中的重要作用，因此受到关广
泛关注;目前已报道从杨树(Populus sp．)、亚洲棉
(Goss． pium arboretum Linn．)等植物中克隆了该基
因，通过对该基因的研究可以对根分泌的化感物质
进行调控。
由于麻黄为非模式植物，可供参考的遗传信息
相对较少，因此对其特异性的新基因的发掘还有待
进一步的深入研究。以本研究所获得的转录组为基
13第 2 期 邓楠，等:膜果麻黄种子不同发育时期的转录组测序分析
础，今后可进一步开发麻黄属的分子标记，从而对西
北地区麻黄植物的遗传的结构和多样性开展研究，
评估和保护其遗传资源;还能够克隆麻黄中的重要
生物活性成分的合成关键基因，更好利用其药用价
值;同时也为麻黄这种荒漠植物种子萌发过程中抗
逆功能基因的发掘及其优良性状遗传改良等提供了
大量的遗传数据资源。
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