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黑粉病菌对薏苡生长及其细胞壁降解酶活性变化的影响



全 文 :书 [收稿日期] 2014-12-18;2015-06-22修回
 [基金项目] 贵州省星火计划项目“薏苡标准化栽培技术示范推广”[黔科合农字(2013)5035];贵州省科技计划项目“贵州省薏苡工程技术
研究中心”[黔科合农字(2012)11]
 [作者简介] 莫熙礼(1982-),男,讲师,硕士,从事植物病虫害防治教学和研究。E-mail:moxili1982@163.com
[文章编号]1001-3601(2015)07-0367-0080-03
黑粉病菌对薏苡生长及其细胞壁降解酶活性变化的影响
莫熙礼,吴彤林,李松克,李本华,江厚成,武华文
(黔西南民族职业技术学院,贵州 兴义562400)
  [摘 要]为了解薏苡黑粉病菌的致病性机制,对种子接种黑粉病菌后的发芽率和幼芽生长抑制作用、
黑粉病菌在薏苡不同生长期的侵入危害及接种黑粉病菌后薏苡种子分泌产生的角质酶、果胶甲基半乳糖醛
酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性变化进行测定。结果表
明:黑粉病菌对种子的发芽无抑制作用,对幼芽的生长有一定的抑制作用;接种黑粉病菌孢子后,种子发病率
为75.7%,而叶片和穗部的发病率都低于10%;病原菌处理种子后,角质酶的活性在6h和12h出现峰值,
略高于对照,其余时间角质酶活性与对照差异不明显,且角质酶的含量和活性均较低;细胞壁降解酶的活性
测定发现,种子接触黑粉病菌后,果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性与对照的PMG活性差异不显著,且活
性的变化率相同;多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24h内迅速升高,
达到峰值,之后迅速下降,与健康植株(CK)的活性差异不显著,且变化规律相同。
[关键词]薏苡;黑粉病;发病率;种子发芽率;幼芽生长抑制;细胞壁降解酶活性
[中图分类号]S436.6 [文献标识码]A
Efects of Ustfagocoic-sbref on Growth and Cel Wal
Degrading-enzyme Activity of Coix lacrymajobi
MO Xili,WU Tonglin,LI Songke,LI Benhua,JIANG Houcheng,WU Huawen
(Qianxinan Vocational and Technical College for Nationality,Xingyi,Guizhou562400,China)
  Abstract:The activity of cutinase and cel wal degrading enzymes(polymethyl galacturonase PMG,
polygalacturonase PG,β-1,4-endoglucanase Cx andβ-galactosidase)of Coix lacrymajobi seeds inoculated
with Ustffagocoic-sbref was detected to understand the pathogenicity mechanism and study effects of
Ustffagocoic-sbrefon seed germination rate and bud growth.The results showed that Ustffagocoic-sbref
has no inhibition effect on seed germination and a certain inhibition effect on bud growth.The disease rate
of Coix lacrymajobi seeds inoculated with Ustffagocoic-sbrefis 75.7%but disease rate of Ustffagocoic-
sbrefleaves and spikes is lower than 10%.The cutinase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated
Ustffagocoic-sbrefreaches the peak value after 6hand 12hrespectively,slight higher than CK.There is
no obvious difference in cutinase activity but the cutinase content and activity both are lower during other
time.PMG activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated with Ustffagocoic-sbrefis no difference with CK
and the variation rate of PMG activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated with Ustffagocoic-sbrefand
CK is the same.The PG,Cx andβ-galactosidase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated with
Ustffagocoic-sbrefreaches the peak rapidly within 24h,then drops rapidly and finaly is no difference
with healthy plants of CK.
Key words:Coix lacrymajobi;Ustffagocoic-sbref;disease rate;seed germination rate;growth inhi-
bition;young buds;activity of cel wal degrading-enzyme
  薏苡黑粉病是一种真菌性病害,由薏苡黑粉菌
属黑粉病菌(Ustffagocoic-sbref)引起,是我国薏苡
生产上危害最重的病害之一,可使产量下降30%~
50%,严重时减产80%。近年来,随着我国薏苡种
植规模的扩大,薏苡黑粉病大面积频繁发生,而且呈
逐年上升趋势,已成为薏苡生产的重要制约因素。
目前,国内外有关薏苡黑粉病的发生规律、生物学特
性、致病机制等方面的研究尚未见报道,仅在防治方
面有部分报道[1-3]。角质层和细胞壁是植物病原菌
成功入侵植物需克服的两道屏障,植物病原物则是
通过合成和分泌各种细胞壁降解酶,降解植物体表
的角质,降低植物自身的防御能力,利于病原菌的侵
入[4-5]。笔者从薏苡黑粉病菌的侵入时期、侵入部位
以及病菌产生的角质酶、果胶酶、纤维素酶的活性分
析等方面,研究黑粉病菌的侵入关键时期、关键部位
以及病原菌分泌产生各类致病相关酶在致病过程中
所起的作用,为研究薏苡黑粉病菌的致病性机制以
及薏苡黑粉病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
薏苡品种为晴薏白03-6,由黔西南民族职业技
 贵州农业科学 2015,43(7):80~82
 Guizhou Agricultural Sciences
术学院吴彤林教授提供。
薏苡黑粉病菌采集于黔西南州农作物科学研究
所薏苡示范基地。在薏苡果实上采集分离得到病
瘤,风干后存放于纸盒内,于4℃冰箱保存备用。使
用前将病瘤碾碎并过40目筛,得到菌粉,用蒸馏水
将菌粉配成厚垣孢子浓度为1×104的悬浮液备人
工接种。
1.2 种子发芽率和幼芽生长试验
薏苡种子经5%石灰水浸种24h后,取出用清
水清洗干净并晾干。将种子放入双层滤纸的大培养
皿中培养,用1×104孢子悬浮液喷雾种子,喷雾量
为滤纸湿透,以蒸馏水为对照。将培养皿置于25℃
黑暗恒温箱中培养48h(露白)后统计种子发芽数,
计算萌发率。露白后,将培养皿放入25℃的光照培
养箱内培养48h,并测量幼芽的长度,每次随机测
量10颗种子幼芽的长度,每个处理5次重复。
发芽率=(发芽种子数/测定总种子数)×100%
1.3 黑粉病菌对薏苡不同生育期的侵入试验
薏苡接菌时间设3个处理(时期),分别为种子
露白期、薏苡4叶期和薏苡抽穗期。处理1(种子+
接菌),薏苡种子经5%石灰水浸种24h,取出用清
水清洗干净并晾干,放入有双层滤纸的大培养皿中,
置于25℃黑暗恒温箱中培养48h,露白后接种浓度
为1×104的孢子悬浮液,接种的量以全部种子表面
形成水膜为宜。处理2(叶片+接菌),薏苡4叶期
接种浓度为1×104的孢子悬浮液,喷施的量以全部
叶片上刚形成水滴为宜。处理3(抽穗+接菌),在
薏苡抽穗期接种浓度为1×104的孢子悬浮液,喷施
的量以穗部刚形成水滴为宜。各处理均以清水作对
照(CK),每处理3次重复。收获期统计各处理黑粉
病的发病株数,并计算发病率。
发病率=(发病的株数/各处理的总株数)×
100%
1.4 种子接菌处理后细胞壁降解酶活性的变化试验
1.4.1 角质酶 称取1g处理后的种子,加入
4mL的角质酶提取液,冰浴研磨,4℃,1 000r/min
离心10min,取上清液即为角质酶的粗提取液。角
质酶提取液配制及角质酶活性的测定参考吴洁云[6]
的方法,分别测定处理后0h、6h、12h、24h、48h
和72h角质酶活性的变化。以1mg酶蛋白1min
内吸光值为酶单位(U/mg)。
1.4.2 果胶酶 酶粗液的提取方法同1.4.1,果胶
酶提取液的配制、多聚半乳糖酸酶(PG)以及果胶甲
基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的测定参考李宝聚[7]
的方法。分别测定处理后0h、6h、12h、24h、48h
和72h多聚半乳糖酸酶(PG)以及果胶甲基半乳糖
醛酸酶(PMG)活性的变化。50℃酶解30min,以
1h/mg蛋白催化底物产生1μmol还原糖所需的酶
量(U/mg)为1个酶活力单位。
1.4.3 纤维素酶 酶粗液的提取方法同1.4.1。
纤维素酶提取液的配制、β-1,4-内切葡聚糖酶(EG)
活性和β-葡聚苷酶的活性的测定参考董小梅
[8]的方
法。分别测定处理后0h、6h、12h、24h、48h和
72hβ-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)活性和β-葡聚苷酶活
性的变化。50℃酶解30min,以1h/mg蛋白催化
底物产生1μmol还原糖所需的酶量(U/mg)为一个
酶活力单位。
以上试验均以牛血清蛋白作标准曲线。
2 结果与分析
2.1 黑粉病菌对薏苡的发芽率和幼芽生长的影响
由表1看出,黑粉病菌孢子悬浮液处理后,种子
的发芽率为87.21%,与清水对照相比差异不显著。
而病菌孢子悬浮液处理后,幼芽的生长长度为
17.35cm,明显低于清水对照。说明,黑粉病菌对
薏苡种子的发芽率无影响,而对幼芽生长有一定的
抑制作用。
表1 黑粉病菌孢子悬浮液处理薏苡的发芽率和幼芽长度
Table 1 Germination rate and bud length of Coix lacrymajobi
with Ustffagocoic-sbrefspore suspension
项目
Items
发芽率/%
Germination rate
幼芽长度/cm
Bud length
黑粉病菌Ustffagocoic-sbref  87.21  17.35
清水(CK)Clear water  89.56  19.54
2.2 黑粉病菌在薏苡不同生育期的侵入情况
从表2看出,黑粉病在薏苡生长的不同时期其
危害程度不同。其中,种子+接种黑粉病菌孢子处
理的薏苡黑粉病在抽穗期的发病率达75.7%,而叶
片+接菌和抽穗+接菌处理的发病率均低于10%。
表明,薏苡黑粉病菌主要为种子侵入,不能或很少从
叶片和穗部侵入危害。
表2 薏苡不同生育期接种黑粉病菌后的发病率
Table 2 Disease rate of Coix lacrymajobi inoculated with Ustffagocoic-sbrefat different growth stage
处理
Treatments
发芽期
Germination stage
4叶期
Four-leaf stage
抽穗期
Heading stage
种子+接菌Seeds+inoculation  0  4.3  75.70
叶片+接菌Leaves+inoculation - - 4.21
抽穗+接菌 Heading+inoculation - - 9.50
CK  0  0 0
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 莫熙礼 等 黑粉病菌对薏苡生长及其细胞壁降解酶活性变化的影响
 MO Xili et al Effects of Ustffagocoic-sbrefon Growth and Cel Wal Degrading-enzyme Activity of Coix lacrymajobi





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0
0
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2
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0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
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时间/h
Time
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时间/h
Time
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时间/h
Time
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时间/h
Time
0 6 12 25 48 72
种子接菌 CK
图示 接种黑粉菌后种子角质酶、多聚半乳糖酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸、β-1,4-内切葡聚糖酶和β-葡聚苷酶的酶活
   Fig. Cutinase,polygalacturonase(PG),polymethyl galacturonate(PMG),β-1,4-endoglucanase(Cx)
andβ-galactosidase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated with Ustffagocoic-sbref
2.3 接菌后薏苡种子细胞壁降解酶活性的变化
由图示看出,种子接菌后:1)角质酶。种子角
质酶的活性在6h和12h出现峰值略高于对照,其
余时间差异不明显。在整个检测周期,角质酶的含
量和活性都较低。说明,角质酶在薏苡黑粉病菌的
侵入过程中可能不起作用。2)细胞壁果胶酶。多
聚半乳糖酸酶(PG)活性能迅速升高,在24h达到
峰值,以后逐渐下降,且活性显著高于对照。说明,
PG酶在黑粉病菌侵入薏苡过程中起重要作用。果
胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性在6h出现,之后
逐渐的下降,但变化幅度小,与对照间差异不显著,
且活性的变化率相同。由此推断,PMG酶在黑粉病
菌侵入薏苡幼芽过程中起的作用可能较小。3)纤
维素酶。种子接菌后,β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)活
性在12h时迅速升高,显著高于对照,之后逐渐下
降,且变化规律与对照相同;对照的β-1,4-内切葡聚
糖酶活性在整个检测阶段无显著的变化。由此判
断,β-1,4-内切葡聚糖酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽
后12h起重要的作用。种子接菌后,β-葡聚苷酶的
活性迅速升高,在24h达峰值,此后下降与对照的
β-葡聚苷酶活性相差不大。说明,β-葡聚苷酶在黑
粉病菌侵入种子幼芽24h内起重要作用。
3 结论与讨论
1)黑粉病主要危害薏苡的幼芽,侵染时期限于
二叶期之前,芽生长长度超过20cm后,其危害的几
率迅速下降[9]。本试验结果也表明,孢子悬浮液对
种子的发芽无抑制作用,对幼芽的生长具有一定的
抑制作用。种子接触黑粉病菌孢子后,收获时期薏
苡果实的黑粉病发病率为75.7%,而叶片和穗部接
触病菌孢子后,引起薏苡黑粉病发病率都低于
10%。因此,判断薏苡黑粉病菌主要从种子侵入危
害,不能或很少能从叶片和穗部入侵。
2)角质层是阻止病原真菌侵入寄主植物的第
一道屏障,很多植物病原菌通过合成和分泌角质酶
迅速降解寄主植物的角质,降低其防御能力,以达到
侵害目的[2],且病原物的致病性与角质酶的表达量
呈正相关[10]。本研究发现,病原菌处理种子后,角
质酶的活性在6h和12h出现峰值略高于对照,其
余时间角质酶活性与对照差异不明显,且角质酶的
含量和活性都较低。低含量和低活性的角质酶可以
冲破幼芽薄薄的一层角质层,侵入到薏苡的幼芽组
织中。而出土后的薏苡叶片和穗部表面的角质层较
厚,且常常附有一层蜡质层,因此,低浓度和低活性
的角质酶不能冲破这一道屏障。这可能是黑粉病菌
不能或很少能侵入薏苡的叶片和穗部的原因。
3)植物病原真菌要成功地侵入寄主植物,必须
刺穿细胞壁,即病原真菌侵入的第二道屏障。很多
植物病原真菌通过分泌细胞壁降解酶降解细胞壁
(果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶
(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶),从
而达到危害寄主植物的目的[3]。本研究对细胞壁降
解酶活性的测定发现,种子接触黑粉病菌后,果胶甲
基半乳糖醛酸酶(PMG)活性与对照的PMG活性差
异不显著,且活性变化率相同,这可能是PMG在黑
粉病菌侵入幼芽过程中不起作用;而多聚半乳糖酸
酶(PG)、β-1,4-内切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的
活性在24h内迅速升高达到峰值,之后迅速的下降
与健康(CK)的植株的活性差异不显著,且变化规律
(下转第87页)
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                                        贵 州 农 业 科 学
                                   Guizhou Agricultural Sciences
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(责任编辑:杨 林
櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁櫁

(上接第82页)
相同。说明黑粉病菌24h内大量分泌各种细胞壁
降解酶破坏组织细胞壁侵入寄主细胞,且侵入薏苡
幼芽后,并没有短时间内迅速破坏寄主组织或者从
组织中获取大量的养分,而是与幼嫩的组织共存,随
着生长点向上移动,这可能是种子感染黑粉病菌后,
叶片很少发现病症,而穗部的症状很严重的原因。
其作用方式和作用机理有待更深一步的研究。
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(责任编辑:聂克艳)
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 蒋德明 等 巨桉人工林下土壤团聚体对水分入渗的影响
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