全 文 ：中国农学通报 2016,32(24):130-135
Chinese Agricultural Science Bulletin
白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析
王运琦 1，方志红 1，任彬琳 1，李莲芬 1，董宽虎 2
（1山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032；2山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）
摘 要：为了研究CDPK基因的结构和功能，利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因，
并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因 cDNA长1048 bp，包含387 bp的开放阅
读框，编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性，且稳定、亲水，二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为
主。亚细胞定位于细胞质中，无跨膜结构域，无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和
3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明，克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同
源性，相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。
关键词：白羊草；BiCDPK；基因克隆
中图分类号：Q7 文献标志码：A 论文编号：casb16040171
The Clone and Sequence Analysis of BiCDPK Conserved Sequence from Bothriochloa ischaemum
Wang Yunqi1, Fang Zhihong1, Ren Binlin1, Li Lianfen1, Dong Kuanhu2
(1Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032;
2College of Animal Science and Technology, Shanxi Agricultural University, Taigu Shanxi 030801)
Abstract: In order to study the structure and function of CDPK gene, BiCDPK was cloned from
Bothriochloa ischaemum by using RT-PCR method, and analyzed by bioinformatics. The results showed
that the length of cDNA for BiCDPK was 1048 bp, which contained a 387 bp complete open reading
frame encoding 128 amino acids. The corresponding protein was mildly acidic, stable and hydrophilic,
with random coil and α- helix as main components in secondary structure. Subcellular localization
indicated that the protein was located in cytoplasmic without transmembrane region and signal peptide.
The sequence of protein included one serine phosphorylation sites and three threonine phosphorylation
sites. Further phylogenic analysis displayed that BiCDPK in Zea mays, Triticum aestivum and Oryza
sativa shared 97%, 86% and 86% identity. It laid a foundation to further study the BiCDPK function in
Bothriochloa ischaemum.
Key words: Bothriochloa ischaemum; BiCDPK; gene clone
0 引言
钙依赖蛋白激酶 (calcium- dependent protein
kinases, CDPKs)是钙信号传导通路中关键的传感
器，是植物和一些在植物生长发育及应对各种不同
环境刺激过程中均具有重要作用[1]。CDPK参与了
多个不同的生理过程，包括水稻未成熟种子中贮藏
淀粉及蛋白质的积累[2]，水稻对冷害、盐害以及干旱
的耐受力[3]，烟草的防御反应[4-5]，苜蓿根发育及根瘤
数的调控[6-7]，拟南芥对脱落酸的应答[8]，矮牵牛花中
的花粉管生长 [9- 12]，植物细胞肌动蛋白张力的调
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目“白羊草抗逆转录因子ERF的克隆与功能鉴定”(20101403110002)。
第一作者简介：王运琦，男，1963年出生，山西临猗人，副研究员，本科。通信地址：030000山西省农业科学院畜牧兽医研究所绿原中心，E-mail：wy-
qwangyunqi@126.com。
通讯作者：董宽虎，男，1956年出生，山西偏关人，教授，博士，研究方向为牧草抗逆性研究。通信地址：030801山西农业大学动物科技学院，Tel：0354-
6287552，E-mail：dongkuanhu@126.com。
收稿日期：2016-04-27，修回日期：2016-06-23。
王运琦等：白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析
节[10,12]和气孔开放特征[13]等等。
CDPK由一个庞大的多基因家族编码，例如拟南
芥中有 34个基因编码 CDPK[14- 15]，水稻中有 29个基
因[16]，绒毛状烟草中有 25个基因[17]。它具有高度保守
的功能区域，这也是CDPKs在结构上的一个明显的特
征[18-19]。由于这些序列具有明显的保守性，不仅使对抗
渗透胁迫基因的分类以及其作用机理的研究更加透
彻，也为这些基因的克隆提供了一条更加便捷有效的
途径。
本研究根据已经发表的其他植物的CDPK基因的
氨基酸序列寻找同源区，并利用生物信息学技术进行
进化分析，设计引物，在野生白羊草中克隆其保守区。
通过对克隆得到的保守区进行分析发现，其具有
CDPK基因特有的EF手性结构区和激酶活性功能区，
并且与玉米具有很高的相似性，达到97%，从而确定该
保守区是白羊草CDPK基因的一部分，也为以后对白
羊草CDPK基因的研究奠定分子生物学基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 以野生白羊草种子为试验材料，由山
西农业大学草业科学实验室提供。
1.1.2 试验试剂 Total RNA提取试剂购自 Invitrogen公
司，反转录试剂盒 cDNA Synthesis Kit购自 Fermentas
公司，大肠杆菌菌株E.coli DH5α购自北京天根生化科
技有限公司，凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司，
DNA Maker、pMD 18- Tvector 购自 Takara 公司 ，
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 购 自
Clontech公司，其他常用试剂采用进口分装或国产分
析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 白羊草总RNA的提取 取培养了45天的野生白
羊草幼苗叶片于液氮中速冻，按照Trizol总RNA抽提
试剂盒说明书（Invitrogen公司）进行RNA的提取，并
经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后待用。
1.2.2 cDNA 的 合 成 cDNA 的 合 成 根 据 cDNA
Synthesis Kit说明书（Fermentas公司）进行，并进行浓
度和纯度检测。以检测后的总RNA为模板使用反转
录试剂盒进行反转录，42℃水浴1 h之后在70℃条件下
加热10 min终止反应，-20℃保存。
1.2.3 引物的设计及合成 利用NCBI上已经登录的其
他植物的CDPK基因的CDS序列，并利用软件进行分
析排除其中相似性低的序列来设计特异性引物，并委
托英俊公司合成。以合成的单链 cDNA为模版，用特
异性引物P1(TGGCATTGAGGGTGATTGCTGA)和P2
(CAATCCACGAAAGCTGATGAGGC) 进 行 PCR 扩
增，获得中间目的片段。再根据克隆得到的BiCDPK
基 因 片 段 设 计 3′- RACE 引 物 P3
(GCAATGAACAAGCTCAAGAAGATGGCAT)，按 照
试剂盒说明书进行PCR扩增。PCR扩增产物经1%凝
胶电泳回收后进行连接转化，挑取阳性克隆测序。
1.2.4 BiCDPK基因保守区片段及3′-端的克隆 以反转
录 产 物 为 模 版 ，用 设 计 好 的 引 物 P1
(TGGCATTGAGGGTGATTGCTGA)和 P2(CAATCCA
CGAAAGCTGATGAGGC)进行 PCR扩增，PCR反应
体系为 25 μL，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP Mixture
(2.5 mmol/L) 2.5 μL，TaKaRa Ex Taq (5 U/μL) 0.25 μL，
10 μm的引物各 1 μL。反应程序为：94℃变性 5 min；
94℃变性 30 s；56℃退火 30 s；72℃延伸 1 min；30个循
环；最后 72℃终延伸 10 min；4℃终止反应。PCR扩增
得到的产物经1%凝胶电泳回收后进行连接转化，挑取
阳性克隆测序。
利用已经反转录好的 3′- RACE cDNA，使用
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒
（Clontech公司）进行3′-端片段的克隆，并送公司测序。
1.2.5 白羊草BiCDPK基因保守区序列的生物信息学
分析 将测序得到的结果进行BLAST分析，确定其为
白羊草CDPK基因的保守区序列。利用DNAMAN6.0
对该保守区序列进行同源性比对分析并预测该序列的
氨基酸序列。利用生物信息学软件分析该保守区是否
具有蛋白激酶和 CDPK特有的保守结构，并将其与
GenBank中已有的氨基酸序列进行比对分析，利用
MEGA 5.10构建系统进化树；应用 ExPasy在线工具
ProParam分析白羊草BiCDPK蛋白的各种氨基酸含
量，理论分子量和等电点等的理化参数；应用
TMHMM软件进行跨膜结构预测；利用 SignalP和
PSORT软件分别进行蛋白质序列的信号肽预测和亚
细胞定位情况研究。
2 结果与分析
2.1 白羊草BiCDPK基因的克隆
根据同源克隆的原理，利用同源克隆技术从白羊
草中克隆得到了长为1048 bp的BiCDPK基因序列（图
1），测序后进行Blastx分析发现该序列与玉米、水稻、
小麦、大麦和短柄草的CDPK基因都具有较高的同源
性，推测该基因为白羊草的CDPK基因。
2.2 BiCDPK蛋白质的理化性质分析
利用ExPASy对BiCDPK蛋白进行分析发现，该蛋
白由128个氨基酸残基组成，相对分子量为14.15 kD，
理论等电点为4.29，分子式为C609H952N166O206S8，含有碱
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性氨基酸(K, R)47个；酸性氨基酸(D, E)48个；疏水氨
基酸(A, I, L, F, W, V)42个；极性氨基酸(N, C, Q, S, T,
Y)28个。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸是Asp
（13个，10.2%），Ala（12个，9.4%），Glu（12个，9.4%）和
Leu（12个，9.4%）；总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为
25；总的带正电荷的残基(Arg+Lys)为 10；亲水性平均
数为-0.392，脂肪指数为76.33。通过NCBI进行比对，
发现白羊草BiCDPK蛋白具有明显的CDPKs结构上
的特征，并且具有CDPK特有的EF手性结构区（图2）。
2.3 BiCDPK蛋白的二级结构预测及功能分析
通过软件预测白羊草BiCDPK基因氨基酸序列的
二级结构，对其进行分析显示：肽链中α-螺旋64.84%，
β-转角 13.28%，无规则卷曲 17.97%，β-折叠 3.91%（图
3）。
在植物界数据库中进行检索，运用PSORT(http://
psort.nibb.ac.jp/form2.htmL)软件对白羊草BiCDPK蛋
白进行亚细胞定位，结果显示：Cytoplasmic(56.5%)>
Nuclear= Mitochondrial(17.4% ) >Plasma membrane=
Peroxisomal(4.3%)，由此可以预测白羊草BiCDPK蛋
图1 白羊草CDPK基因PCR产物凝胶电泳图
图2 BiCDPK蛋白的功能结构域
图3 BiCDPK蛋白的二级结构
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白可能主要定位于细胞质中。
运用 ProtScale程序估测了 BiCDPK肽链的疏水
性，发现该蛋白中含有疏水区域（图 4）。运用SignalP
4.0工具对BiCDPK蛋白进行信号肽分析发现无信号
肽位点存在。运用采用TMHMM软件进行跨膜结构
分析发现白羊草BiCDPK氨基酸序列中无跨膜结构。
对BiCDPK蛋白进行磷酸化位点预测，结果发现：
在第 40位氨基酸处有 1个丝氨酸磷酸化位点，在第
57、107、111位氨基酸处有3个苏氨酸磷酸化位点。
对BiCDPK蛋白构建系统进化树，结果表明其与
禾本科科植物的亲缘关系比较近，且与玉米 (Zea
mays)并为一处，其亲缘关系最近（图5）。
利用生物信息学软件进行同源性分析发现，白羊
草BiCDPK与其他植物的CDPKs具有很高的相似性，
图4 BiCDPK蛋白疏水区域分析
图5 白羊草BiCDPK蛋白与其他植物CDPKs类蛋白的系统进化树
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其中，与玉米(Zea mays)；大麦(Hordeum vulgare)；小麦
(Triticum aestivum)；水稻(Oryza sativa)和二穗短柄草
(Brachypodium distachyon)的 CDPK氨基酸序列高度
同源（图6）。
图6 BiCDPK蛋白的氨基酸序列与其他植物CDPK蛋白氨基酸序列的多重比对
3 讨论与结论
植物为适应外在的环境刺激形成了多种信号转导
途径，钙离子作为细胞内的第二信使在信号转导过程
中起着非常重要的作用，而CDPK（钙依赖蛋白激酶）
是植物和一些原生生物所特有的一类可以不经钙调素
作用而直接被钙信号激活的蛋白激酶[20]。白羊草是禾
本科重要的牧草种质资源，迄今为止，对其CDPK基因
的研究还未有报道，本研究从白羊草中克隆了CDPK
基因的保守区域，填补了这一空白。
本研究以白羊草为试验材料，利用 RT-PCR 和
RACE技术获得了白羊草BiCDPK基因的中间及3′-端
序列，但是由于种种原因5′-序列一直没有能顺利扩增
出来，这需要在后续的试验中查找原因并尽快解决该
问题。
对白羊草BiCDPK基因的保守区序列进行生物信
息学分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有明显的
CDPKs结构上的特征，并且具有CDPK特有的EF手
性结构区，为稳定的弱酸性亲水性蛋白，无跨膜结构
域，无信号肽，有多个磷酸化位点，在细胞内定位于细
胞质中，与玉米、小麦和水稻的亲缘关系最近；同时还
预测了该蛋白的二级结构，明确了其结构域。本研究
结果为进一步研究白羊草BiCDPK基因的功能及其表
达和调控机理提供了一定的数据。
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