全 文 ：29
China Pharmaceuticals
2016年 10月 20日 第 25卷第 20期
Vol． 25，No． 20，October 20，2016
＊新疆医科大学科研创新基金，项目编号:XJC201359。
(电话)0731 － 85600466(电子信箱)dboyzq1@ 163． com;
李健和，男，汉族，硕士研究生，副主任药师，硕士研究生
导师，研究方向为新药开发，本文通讯作者，(电话)
0731 － 85292093(电子信箱)lijianhexy@ 126． com。
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(收稿日期:2016 － 06 － 13;修回日期:2016 － 06 － 30 )
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
欧芹根总黄酮对非酒精性脂肪性肝病大鼠的
治疗作用及机制研究＊
谢婧雯 1，陈 妍 1，贾蔓菁 1，朱曼丽 2，雷林杰 1
(1． 新疆医科大学第二附属医院，新疆 乌鲁木齐 830063; 2． 新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011)
摘要:目的探讨欧芹根总黄酮对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠模型的影响机制。方法 采用高脂饮食诱导 NAFLD 大鼠 40 例建
模，随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组和欧芹根总黄酮组，各 10 只，分别给予生理盐水、生理盐水、水飞蓟素、欧芹根提取物，除正常
组外，其他组均每日喂食高脂饲料。检测各组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)、三酰甘
油(TG)水平，采用实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Ｒeal － time PCＲ)法检测肝组织中环氧合酶 － 2(COX － 2)的 mＲNA表达水
平。结果 建模成功，模型组大鼠血清 ALT，AST，TC，TG水平与正常组大鼠相比均明显升高(P ＜ 0． 05);水飞蓟素和欧芹根总黄酮干预
后能显著降低 NAFLD大鼠上述 4 项指标水平，并抑制 COX － 2 的 mＲNA表达，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05);欧芹根总黄酮作用略
强于水飞蓟素，但差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。结论 欧芹根总黄酮对 NAFLD大鼠有一定的治疗作用，其作用机制与抑制肝组织中
COX － 2 的表达有关。
关键词:欧芹根总黄酮;非酒精性脂肪性肝病;环氧合酶－ 2
中图分类号:Ｒ285． 5;Ｒ282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2016 )20 － 0029 － 04
Curative Effect and Mechanism of Total Flavonoids in Ｒoots of Petroselinum Crispum on
Nonalcoholic Fatty Liver Ｒat Model
Xie Jingwen1，Chen Yan1，Jia Manjing1，Zhu Manli2，Lei Linjie1
(1． The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Wulumuqi，Xinjiang，China 830063; 2． Xinjiang Medical University，
Wulumuqi，Xinjiang，China 830011)
Abstract:Objective To explore the effect mechanism of total flavonoids in roots of petroselinum crispum on nonalcoholic fatty liver rat
model． Methods 40 cases of nonalcoholic fatty liver rat model were induced by high － fat diet and then randomly divided into the nor-
mal group，model group，silymarin group and total flavonoids in roots of petroselinum crispum group，10 rats in each group． All group
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Drug Ｒesearch
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were given the corresponding treatment． Except for the normal group，the other groups were fed with high － fat diet． The plasma level of
ALT，AST，TG，TC were detected and the expression of COX － 2 mＲNA in liver was examined by Quantitative Ｒeal － time PCＲ． Ｒesults
The model was made successfully，and the plasma level of ALT，AST，TG，TC in model groups were higher than that in normal
group． After intervention，the NAFLD rats with silymarin and total flavonoids in roots of petroselinum crispum decresed the above － men-
tioned four indexes obviously，and the expression of COX － 2 mＲNA was inhibited(P ＜ 0． 05)． The effects of total flavonoids in roots of
petroselinum crispum were stronger than silymarin，but the differences were not statistically significant(P ＞ 0． 05)． Conclusion The to-
tal flavonoids in roots of petroselinum crispum has a specific curative effect on NAFLD rats． Its mechanism is related to the inhibition
of COX － 2 mＲNA expression．
Key words:total flavonoids in roots of petroselinum crispum;nonalcoholic fatty liver disease;COX － 2
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精及其他
明确的肝损伤因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪
病变为主要特征的临床病理综合征 [ 1 － 2 ]，包括单纯性脂
肪肝、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝
硬化 4 个从轻到重的病理阶段 [ 3 ]。该病发病机制较复
杂，且至今尚不完全清楚。其治疗以西药为主，以起到保
护肝细胞、调节血脂及血糖等作用，但安全性有待进一
步验证 [ 4 ]。与此同时，天然药物以其作用温和、毒副作用
相对较小的优势逐渐受到关注。新疆维药芹菜根为伞形
科植物欧芹 Petroselinum crispum(Mill)Hill 的干燥根 [ 5 ]
(与我们平时食用芹菜的根部不同)，当地用其治疗肝脏
疾病。目前，除笔者前期所作研究外，关于该药物活性成
分和药理机制的研究报道较少。因此，对该药进行系统
地研究十分必要。
1 材料与方法
1．1 动物、仪器与试药
1． 1． 1 动物
SD 大鼠 40 只，购自上海实验动物中心，动物合格
证号为 SYXK ＜ 沪 ＞ 2013 － 0034。体质量(180 ± 20)g，
自由饮食，饲养温度条件为(22 ± 2)℃。
1． 1． 2 仪器
LDZX － 40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上
海博迅实业有限公司); 东胜EDC － 810 型基因扩增仪
(北京东胜创新生物科技有限公司);ABM 基因梯度扩
增仪(Applied Biosystems 公司);HITACHI CF 15Ｒ 型高
速冷冻离心机(Sigma 公司);VILBEＲ LOUＲMAT vo3
7742 型凝胶成像系统(Vilber Lourmat 公司);DK － S12
型和 DK － S16 型电热恒温水浴锅(常州润华电器公
司);UV － 1800 型紫外可见分光光度计(上海元析仪器
有限公司);DYY － 4C型电泳仪(美国 Biorad公司);Q /
FY － LYY002 型电泳槽(上海天能科技有限公司);
SHELLAB S16 － 2 型摇床(上海智城分析仪器制造有限
公司)等。
1． 1． 3 试药
水飞蓟素 (天津天士力圣特制药有限公司，批号为
201302090021); 欧芹根购自新疆乌鲁木齐市二道桥市
场洛克曼维吾尔医药行，经新疆维吾尔自治区药物研究
所张彦福教授鉴定为伞形科植物欧芹 Petroselinum
crispum(Mill)Hill 的干燥根。欧芹根总黄酮采用 6 倍量
70%乙醇提取欧芹根粗粉，提取 2 次，每次 1 h，合并 2
次的滤液，旋转蒸发后，将提取物用蒸馏水溶解后通过
聚酰胺柱，收集流出液，浓缩干燥后即得。总胆固醇
(TC)、三酰甘油(TG)检测试剂盒(南京建成生物工程公
司);ＲNA 提取试剂盒 (乌鲁木齐欧易生物科技有限公
司 ); 逆转录酶为实时荧光定量聚合酶链反应(qＲT －
PCＲ)的鼠白血病逆转录酶(M － MLV)第一链合成酶
(Invitrogen 公司，货号为 C28025 － 032); 实时荧光染料
为 SYBＲ Select Master Mix(ABI公司，货号为 4472920)。
1．2 大鼠NAFLD模型建立
取花生油 50 g，加热，加入胆固醇 15 g 融化，搅匀
后加入吐温 80 3． 5 mL，制成油相; 使用水50 mL、全脂
奶粉 10 g、食盐 1 g、蔗糖 20 g 和丙二醇 3． 5 mL加热后
加入脱氧胆酸钠 1 g，制成水相;随后将油相和水相充分
混合为高脂乳剂，根据大鼠体重每周喂食 2 次，平时以
高脂饲料维持，连续喂食 12 周。将 40 只大鼠随机分为
正常组、模型组、水飞蓟素组和欧芹根总黄酮组，各
10 只。正常组和模型组腹腔注射相同体积比例的生理
盐水，水飞蓟素组腹腔注射水飞蓟素(每 100 g 体质量
10 mg)、欧芹根总黄酮组腹腔注射欧芹根提取物(每
100 g体质量 10 mg)，每 5天给药 1 次。除正常组外，其
他组均每日喂食高脂饲料。4组大鼠喂食 12周后用检
测试剂盒测定大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天
门冬酸氨基转移酶(AST)、TC及 TG水平。同时，麻醉大
鼠后取其肝组织提取 ＲNA，用逆转录试剂盒逆转录成
cDNA进行 qＲT － PCＲ。
1．3 荧光定量PCＲ试验方法
采 用 DanoDrop1000 鉴 定 总 ＲNA 的 纯 度 ，以
ＲNase － water 对照液，DanoDrop1000 测定总 ＲNA 在
260，280 nm 波长处的吸光度，得到总 ＲNA 的浓度及
OD260 / OD280 值(1． 8 ＜ OD260 / OD280 ＜ 2． 0)。取总 ＲNA
和 6 × loading buffer 电泳经琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像
仪照像，检测总 ＲNA 的纯度与完整性。完整的 ＲNA 应
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表 1 实时荧光定量 PCＲ引物序列
名称
β － Actin_F
β － Actin_Ｒ
COX2 － F
COX2 －Ｒ
引物序列(5 to3)
CCCATCTATGAGGGTTACGC
TTTAATGTCACGCACGATTTC
ATTACTGCTGAAGCCCACCC
TGTGATCTGGACGTCAACACG
产物大
小(bp)
150
212
NO． genebank
NM_031144． 3
NM_017232． 3
表 2 各组 NAFLD大鼠血清中 ALT和 AST水平比较
(X ± s，U / L，n = 10)
注:与正常组相比，#P＜0． 05;与模型组相比，＊P＜0． 05。表 3同。
组别
正常组
模型组
水飞蓟素组
欧芹根总黄酮组
ALT
56． 7 ± 5． 8
235． 6 ± 15． 7#
132． 8 ± 11． 8#＊
128． 9 ± 15． 5#＊
AST
159． 5 ± 21． 5
360． 8 ± 24． 4#
184． 6 ± 16． 4#＊
167． 3 ± 16． 9#＊
表 3 各组 NAFLD大鼠血清中 TC和 TG水平比较
(X ± s，mmol / L，n = 10)
组别
正常组
模型组
水飞蓟素组
欧芹根总黄酮组
TC
6． 57 ± 1． 58
15． 55 ± 2． 57#
12． 28 ± 1． 68#＊
10． 29 ± 3． 51#＊
TG
9． 25 ± 1． 25
16． 85 ± 2． 44#
13． 44 ± 1． 54#＊
10． 33 ± 1． 99#＊
图 1 基因片段电泳图
4． 0
3． 5
3． 0
2． 5
2． 0
1． 5
1． 0
0． 5
0
60 65 70 75 80 85 90 95
A
4． 0
3． 5
3． 0
2． 5
2． 0
1． 5
1． 0
0． 5
0
60 65 70 75 80 85 90 95
B
A． β － Actin B． COX － 2
图 2 基因溶解曲线图
T /℃
T /℃
是 2条亮带即 2个主要的核糖体:18sＲNA(相对分子质
量约为 2． 1 kb)和 28sＲNA(相对分子质量约为 4． 5 kb)
可作为相对分子质量参照。质检合格的 ＲNA样本，使用
qＲT － PCＲ 的 M － MLV 第一链合成系统得到 cDNA，使
用 ABI 公司的 ABI7500 荧光定量 PCＲ 系统二步法进
行。目的基因 COX2 和内参基因 β － Actin 的引物序列
见表 1[6 － 7 ]。
1．4 统计学处理
应用 SPSS 13． 0 统计软件进行分析。计量资料以
X ± s表示，行 t检验;计数资料以百分率表示，行χ2检
验。P ＜ 0． 05为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 对NAFLD大鼠血清ALT和AST水平的影响
NAFLD 大鼠血清中 ALT 和 AST 水平均显著高于
正常组(P＜0． 05);水飞蓟素和欧芹根总黄酮均可明显降
低 NAFLD大鼠血清中 ALT和 AST水平(P＜0． 05)，且后
者的效果略优于前者，但差异无统计学意义(P＞0． 05)。详
见表 2。
2．2 对NAFLD大鼠血清TC和TG水平的影响
NAFLD 大鼠血清中 TC 和 TG 水平均显著高于正
常组(P ＜ 0． 05);水飞蓟素和欧芹根总黄酮可明显降低
NAFLD 大鼠血清中 TC 和 TG 水平(P ＜ 0． 05)，且后者
效果略优于前者，但差异无统计学意义(P ＞ 0． 05)。详
见表 3。
2．3 对NAFLD大鼠COX －2基因水平表达的影响
所有肝组织的 ＲNA 逆转录为 cDNA 后使用普通
PCＲ手段进行琼脂糖电泳分析，发现均能扩增出目的基
因 COX2 和内参基因 β － Actin，可用于后续试验。试验
结果见图 1。
目的基因 COX － 2 和内参基因 β － Actin的溶解曲
线均符合试验需要，扩增斜率均接近 － 3． 34，可用于后
续试验。见图 2。
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注:与B组比较，＊ P ＜ 0． 05。
A． 正常组 B． 模型组 C． 水飞蓟素组 D． 欧芹根总黄酮组
图 3 不同组别 COX － 2相对表达量
相对表达量
3． 0
2． 5
2． 0
1． 5
1． 0
0． 5
0
A B C D
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＊
＊
本栏目由
协 办
重庆药友制药有限责任公司
将 4组大鼠的 cDNA行 qＲT － PCＲ试验，结果欧芹
根总黄酮及水飞蓟素均可有效抑制 COX2的表达，且前
者抑制效果略好。见图 3。
3 讨论
近年来，NAFLD发病率有明显增加趋势，已成为目
前最常见的肝脏疾病 [ 8 ]。营养过剩所致的体质量增长过
快、过重、肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征相关脂
肪性肝病，以及隐源性脂肪性肝病均属于原发性非酒精
性脂肪性肝病范畴，主要表现为 TC，TG，AST，ALT水平
升高等。NAFLD较严重患者可出现肝纤维化，主要表现
为 AST /ALT 升高等 [ 9 ]。因此，本研究中采用长期高脂
肪、高胆固醇饲料喂养诱发大鼠 NAFLD形成，此模型发
病病因及病症等均更加接近临床 NAFLD病症，同时也
是目前国内常用 NAFLD 模型 [ 10 ]。通过检测 TC，TG，
AST，ALT水平以研究欧芹根总黄酮对 NAFLD的调脂、
抗纤维化等作用。
此外，国内外文献也报道了 COX － 2 的表达对
NAFLD 的影响。赵锦燕等 [ 11 ]的研究通过检测血清中
ALT 和 AST 水平变化，逆转录聚合酶链反应(ＲT －
PCＲ)法和免疫组化法检测 COX － 2基因和蛋白表达发
现，抗氧化能力的提高有利于治疗 NAFLD。王雯等 [ 12 ]的
试验结果表明，大鼠 NAFLD的治疗作用机制可能与抑制
肝组织中 COX － 2的表达及活性有关。此外，唐彬等 [ 13 ]研
究发现，抑制 COX － 2 的 mＲNA 转录和蛋白表达对高
脂 －脂肪肝大鼠疗效明显。因此，本研究中采用 qＲT －
PCＲ法测定 COX － 2 mＲNA在肝组织中的表达，以此研
究欧芹根总黄酮对 NAFLD的抗氧化机制作用。
新疆维药芹菜与我们平时食用的芹菜不同，主要为
水芹和旱芹，广泛分布于全国各地 [ 14 ]。由于特殊的地理
环境，欧芹根较
水芹根粗，较旱
芹根细，主要分
布于新疆和田、
阿克苏一带。维
医认为，芹菜根
有活血化瘀、健脑安神、祛风除湿等功效，但对其活性成
分及药理机制未见详细报道 [ 15 ]。因此，有必要对欧芹根
总黄酮进行深入研究和探讨。
本研究结果表明，欧芹根总黄酮干预 NAFLD 模型
大鼠，可显著降低其 TC，TG，AST，ALT 水平，明显改善
其肝功能。同时，其肝组织中 COX － 2 mＲNA表达降低，
表明欧芹根总黄酮对 NAFLD的作用机制可能通过抑制
COX － 2的表达实现。
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