全 文 ：文章编号:1000-5404(2005)17-1773-03　　 论著
草麻黄中补体抑制成分抑制大鼠异种心脏移植超急性排斥反应的实验研究
李　军 1 ,杨　康 1 ,白　云 2 ,吴　蔚 1 ,熊　刚 1　　(第三军医大学:1西南医院胸心外科 , 2基础医学部分子遗传学教研室 ,重
庆 400038)
　　提　要:目的　初步探讨草麻黄中补体抑制成分(com plem ent inh ibiting component, CIC)对异种心脏移植超急性排斥
反应的作用。方法　按是否给予 C IC灌胃处理 ,将动物模型分为对照组和实验组 , 观察对照组和实验组术后供心存活时
间 , 在术后早期及供心失活时取两组心脏组织行光镜 、电镜病理检查 ,并在术后固定时间分别抽鼠血行血清学检查 , 用微
量法测定 CH50、APH50 ,用透射比浊法测定 C3。结果　实验组移植心脏存活时间为(51. 00±3.46)m in,与对照组(30.30±
3. 46)m in比较差异极显著(P <0.01)。结论　豚鼠至大鼠异种心脏移植后 , 补体的经典途径和替代途径均被激活。 CIC
能明显抑制补体活性 ,延缓超急性排斥反应的发生 , 从而使移植心脏的存活时间延长。
　　关键词:异种心脏移植;超急性排斥反应;补体;补体抑制剂;草麻黄
　　中图法分类号:R282. 71;R617;R654. 2　　　 文献标识码:A
Ephedra sin ica in preventing hyperacute rejection in guinea pig-to-rat card iac xeno-
transp lantation
LI Jun
1 , YANG Kang1 , BA I Yun2 , WU W ei1 , XIONG G ang1 ( 1 Depa rtm ent o f C ardio thoracic Su rgery, Southwest H ospital,
2Depa rtm en t o fM o lecularG enetics, Co llege o fM edicine, Th ird M ilitaryM edica lUniversity, Chongqing 400038, China)
　　Abstract:Object ive　To study Ephedra sin ica in preven ting hyperacute re jection in guinea pig-to-rat car-
diac xenotransplantation. Methods　The recipient ratsw ere divided into two g roups:contro l group and experi-
ment g roup, according to whe ther adm inistrated comp lement inh ib iting component(C IC) from Ephedra sinica.
In 15m in afte r operation, 4 rats from contro l group and 4 from expe riment group w ere sac rificed to detect the
pa tho log ic changes in cardiac tissues. The complemen t parame te rs including CH50 , APH50 , and C3 we re de ter-
m ined during the period o f 0, 10, 15, 30, 45m in in se ria l serum. Results　The surv ival timew as significant-
ly pro longed and patho logical changes we re less in experiment group than that in con tro l group. Conc lusion　
The study reveals that both c lassica l pathw ay and alterna tive pathw ay o f comp lement activa tion can be induced
by xenotransplan tation and Ephedra sinica can pro long the xenog ra ft time by inh ib iting complemen t activ ities
and postposing hyperacu te re jection.
　　Key words:cardiac xenotransplan tation;hyperacu te rejection;complement;comp lement inhibiting a-
gent;Ephedra sin ica
　　异种器官移植的主要障碍是超急性排斥反应 ,其
中补体起关键作用 ,阻断补体活性及抑制补体激活是
克服超级性排斥反应的关键 。 Ling等[ 1]从草麻黄中
纯化出一单体成分 (complement inh ib iting component,
C IC),初步鉴定为高分子碳水化合物 ,该成分在体外
具有良好的补体抑制活性 。本实验在已建立的豚鼠至
大鼠异种异位心脏移植的动物模型上应用草麻黄中的
补体抑制成分 C IC ,观察 C IC对异种心脏移植超急性
　　基金项目:国家医药技术创新博士基金资助项目(969010665)
　　　　　　Supported by theN a tiona lResearch F ounda tion for Innovation P ro jec ts
o f Doc tors (969010665)
　　作者简介:李　军(1973 -),男 ,云南省蒙自县人 ,硕士 ,主治医师 ,主要从事
心脏移植的基础和临床方面的研究。电话:(023)68765330
　　通讯作者:杨　康 , E-ma il:ykang39@yahoo. com. cn
　　收稿日期:2004-10-02;修回日期:2005-04-18
排斥反应的作用 。
1　材料与方法
1. 1　实验动物
　　健康 15个月三色豚鼠 30只 , 雄性 , 体质量约 300 ～ 400 g;
健康 15个月W istar大鼠 30只 , 雄性 , 体质量约 250 ～ 350 g,均
购自第三军医大学实验动物中心。
1. 2　主要药品
　　硅胶 GF254(青岛海洋华工厂 );绵羊红细胞(第三军医大
学实验动物中心 );溶血素 (第三军医大学全军免疫学研究
所);兔红细胞(第三军医大学实验动物中心);C3检测试剂盒
(S igm a公司);兔抗鼠 C3(S igm a公司 );生物素标记羊抗兔 Ig
(S igm a公司)。
1. 3　实验方法
1. 3. 1　豚鼠至大鼠腹腔内异位心脏移植模型的建立　　采用
1773
第 27卷第 17期
2005年 9月 　　
第　三　军　医　大　学　学　报
ACTA　ACADEM IAE　MED IC INAE　M IL ITARIS　TERTIAE　　
Vo .l 27, No. 17
Sep. 2005
DOI牶牨牥牣牨牰牥牨牰牤j牣牨牥牥牥牠牭牬牥牬牣牪牥牥牭牣牨牱牣牥牪牥
改良 Ono氏术 [ 2]建立豚鼠至大鼠腹腔内异位心脏移植模型 ,观
察供心存活时间。
1. 3. 2　草麻黄中补体抑制成分 C IC的提纯及活性鉴定　　参
照文献 [ 3]进行。
1. 3. 3　大鼠口服 C IC后补体抑制活性检测
1. 3. 3. 1　动物分组和处理　　按是否给予 C IC灌胃处理 , 将
动物模型随机分为对照组(15只 )和实验组 (15只)。对照组:
受体鼠术前 3天口腔灌注生理盐水 1 m l /只 , 1次 /d, 连续 3 d。
实验组 , 受体鼠术前 3天口腔灌注 C IC 12 m g /kg体质量 , 1次 /
d,连续 3 d。
1. 3. 3. 2　检测指标及方法　　观察对照组和实验组术后供心
存活时间;实验组心脏移植后 15 m in各取 4只移植心脏作病理
检查 , 其余所有动物移植心脏停止跳动时 , 取出移植心作病理
检查;分别于移植后 0、10、 15、30、 45 m in分别抽鼠血行血清学
检查 , 微量法测定 CH50 、APH50 , 透射比浊法测定 C3;分别于移
植后 0、 10、 15、 30、 45m in及供心失活时取两组心脏组织用
SABC法作 C3免疫组化检查。
1. 4　统计处理
　　采用 SPSS 11. 0统计包行统计学分析。实验结果用 –x±s
表示 , 采用 t检验。
2　结果
2. 1　C IC对移植心脏存活时间及受体的影响
　　全部心脏移植手术均获成功 ,各组移植心脏恢复血流灌注
后迅速充盈 , 颜色红润 ,弹性好 ,心脏搏动良好。实验组移植心
脏存活时间为 (51. 00 ±3. 46) m in, 与对照组 (30.30±2.52)
m in比较 ,差异极显著(P <0. 01)。
2. 2　病理检查
2. 2. 1　光镜检查　　对照组:移植后 15 m in, 移植心脏心肌
间质出血水肿严重 , 量多且范围广;有淋巴细胞和单核细胞浸
润;部分心肌细胞有凝固性坏死表现 , 可见冠状小血管及部分
中型静脉内有血栓形成 , 管周水肿明显 , 管腔内淤血 , 见图
1A。实验组:移植后 15 m in, 移植心脏心肌间质出血水肿 , 出
血量及范围较对照组轻 , 心肌坏死亦少于对照组 , 可见心肌
细胞水肿空泡变性 , 亦有炎性细胞浸润;有血管内淤血和血栓
形成 ,见图 1B。
A:Contro l;B:Experim en t
图 1　移植后 15m in心肌细胞　(HE×400)
F ig 1　Edema and inflamm a tory infiltra tion in myocard ium cells
in 15 m in a fter heart transplanta tion　(HE×400)
2. 2. 2　电镜检查　　对照组:心肌细胞肿胀明显 , 有多处肌纤
维断裂 、溶解 , 肌纤维间有大量脂滴沉着;线粒体数量明显减
少 , 外形极度不规则 , 部分呈梭形或哑铃形 , 嵴消失呈空泡状 ,
未见有糖原颗粒 , 部分心肌细胞核溶解破裂 , 有毛细血管淤血 ,
管壁空泡样变性 , 管周可见淋巴细胞 、单核细胞。实验组:心肌
细胞肿胀明显 , 部分肌纤维断裂 , 间质水肿出血;线粒体数量变
化不明显 , 但外形肿胀明显 ,有空泡变性及部分嵴消失 , 胞核核
孔增大 , 少量核变形。
2. 3　血清学检查
2. 3. 1　移植后补体经典途径活性 (CH50)和替代途径活性
(APH50)的动态变化　　CH50和 APH50分别反映了血清中补体
经典途径和替代途径的总活性。 心脏移植后 , 对照组在移植
后 30m in内 CH50和 APH50呈显著下降趋势 ,直至供心失活终止
观察(P <0. 01)。实验组由于移植前 CH50和 APH50已下降至较
低水平 , 故在移植后 15 m in内下降不显著 (P >0. 05),在移植
后 30m in时呈显著下降趋势(P <0.05), 45 m in时下降极显著 ,
P <0.01, 见表 1, 2。
表 1　心脏移植后血清 CH 50的动态变化( x±s, n=15, U /m l)
Tab 1　Serum CH 50 changes o f rat transplanted heart at d ifferent
time( x±s, n =15, U /m l)
A fte r transplantion
G roup
0 m in 10 m in 15 m in 30 m in 45 m in
Contro l 89. 7±6. 1 58. 4±4. 2▲ 55. 7±5. 8▲ 47. 3±4. 8▲ -
Experiment 40. 1±4. 5 40. 0±3. 2 39. 2±7. 1 38. 2±5. 0☆ 30. 5±6. 2▲
☆:P <0. 05, ▲:P <0. 01, vs 0m in
表 2　心脏移植后血清 APH50的动态变化( x±s, n =15, U /m l)
Tab 2　Serum APH50 changes o f ra t transplanted heart at differ-
ent tim e( x±s, n=15, U /m l)
A fte r transplantion
G roup
0 m in 10 m in 15 m in 30 m in 45 m in
Contro l 127. 0±8. 3 101. 5±6. 7▲ 84. 2±10. 8▲ 73. 2±4. 6▲ -
Experiment 63. 3±5. 3 63. 3±5. 3 62. 1±4. 6 61. 1±5. 7☆ 51. 0±7. 3▲
☆:P <0. 05, ▲:P <0. 01, vs 0m in
2. 3. 2　受体血清 C3变化　　心脏移植后 , 对照组在移植后 30
m in内 C3呈显著下降趋势 , 直至供心失活终止观察(P <0.01)。
而实验组在移植后 15 m in内 C3下降不显著 , P >0. 05,在移植
后 30 m in时 C3显著下降(P <0. 05), 45 m in时下降极显著(P
<0. 01), 见表 3。
表 3　心脏移植后血清 C3的动态变化( x±s, n =15, U /m l)
Tab 3　 Serum C3 changes of ra t transplanted heart a t d ifferent
tim e( x±s, n =15, U /m l)
A fte r transplantion
G roup
0 m in 10 m in 15 m in 30 m in 45 m in
Contro l 127. 0±8. 3 101. 5±6. 7▲ 84. 2±10. 8▲ 73. 2±4. 6▲ -
Experiment 63. 3±5. 3 63. 3±5. 3 62. 1±4. 6 61. 1±5. 7☆ 51. 0±7. 3▲
☆:P <0. 05, ▲:P <0. 01, vs 0m in
1774 　　　　　　　　　　　　第　三　军　医 　大　学　学 　报　　　　　　　　　　　　　第 27卷
第 17期　 李　军 ,等. 草麻黄中补体抑制成分抑制大鼠异种心脏移植超急性排斥反应的实验研究　
2. 4　免疫组织化学检查
　　在移植后 15 m in,对照组大鼠心脏切片免疫组织化学检查
表明 , 补体 C3广泛附着于心脏血管内皮细胞膜 , 见图 2A。而在
实验组仅有微量 C3附着 ,见图 2B。
A:Contro l;B:Experim en t
图 2　移植后 15m in,免疫组化检查 C3沿血管内皮细胞膜的沉积
　(SABC×400)
F ig 2　C3 aggraded along the endo thelialm embrane in 15m in af-
ter heart transplanta tion　(SABC×400)
3　讨论
　　豚鼠至大鼠器官移植属于非协调性异种器官移
植 ,当血管通路建立后超急性排斥反应是首当其冲的
最主要的排斥反应 ,常常使移植器官在十几分钟内丧
失功能 。其中补体起关键作用 ,因此用何种方法抑制
补体激活为抗超急性排斥反应首要考虑的问题 ,亦是
多年研究热点之一[ 4, 5] 。
　　目前国内外有关补体抑制剂的研制主要涉及补体
调节蛋白 、补体成分的抗体 、人工合成化合物及植物提
取成分等[ 6] 。其中 ,由于从中药或动植物中分离补体
抑制剂的成本低廉 、方法简便而备受制药业的关注。
草麻黄在我国分布广泛 ,廉价易得 ,是中药方剂的常用
药材。 Ling等[ 1]从草麻黄中纯化出一单体成分 C IC ,
初步鉴定为高分子碳水化合物 (>100×103),不溶于
碱 ,溶于酸 ,并证实该成分在体外具有良好的补体抑制
活性 ,其对补体激活的经典途径 、替代途径及终末途径
均有抑制作用。 Ling等 [ 1]在体外实验中提出 C IC通
过与补体蛋白 C2的活性部位结合从而抑制补体激活
的经典途径 ,且此结合为不可逆的;其次通过抑制补体
蛋白 C9的活化而抑制终末途径激活补体;C IC对替代
途径激活补体的抑制机制尚不明确 ,有可能是通过抑
制 B因子的活性而发挥作用。
　　本研究以从草麻黄水抽提物中获得的单体成分
C IC应用于豚鼠至大鼠异种心脏移植模型 ,动物实验
研究表明 , C IC纯化产物在体内对经典途径和替代途
径均有良好的抑制作用 ,延缓了超急性排斥反应的发
生 。 C IC纯化产物在体内实验结果提示两种可能:一
是 C IC通过对后段成分单一靶点的作用实现其对补体
双途径的抑制;二是在经典途径和替代途径中均存在
作用靶点。良好的补体抑制功能为探讨其在异种心脏
移植动物模型中治疗作用提供了进一步研究的基础 。
　　动物实验研究表明 ,移植前受体血清补体 CH 50 、
APH 50已下降至较低水平 ,从而抑制了补体激活 ,延缓
了超急性排斥反应的发生 ,使移植心脏存活时间 ,从平
均 30m in延长到平均 50m in。实验对照组 、实验组移
植心脏存活时间差异有统计学意义 ,但实验组移植心
脏未有超过 1 h存活者。根据 C IC对大鼠体内补体活
性抑制实验进一步证明 C IC纯化产物在体内对经典途
径和替代途径均有良好的抑制作用 ,具体量效关系确
立依据有待进一步进行药物的性质及药代动力学研究
后明确 。在超急性排斥反应中 ,抑制补体激活虽然是
最主要和最有效的治疗目标 ,但单纯抑制补体活性并
不足以使移植器官存活时间显著延长 ,还需通过综合
手段如脾切除 、血浆置换 、器官灌注等来去除天然抗
体 ,以及使用抗 B细胞的免疫抑制剂对补体以外的抗
体进行处理 。其次 ,补体激活是一个多环节的级联反
应过程 ,其中任何一个环节受阻均可抑制其活化 ,减少
活性片段产生 ,减轻炎性损伤。因此 ,从理论上讲补体
系统为我们提供途径的过程 ,而且在不同活化阶段产
生的裂解片段具有不同的生物活性 ,单一途径或单一
靶点的抑制不能消除其他活性片段的作用。所以 ,最
终治疗补体介导的疾病可能有赖于针对多途径 、多靶
点的 、综合治疗方案。
参考文献:
[ 1] LingM , P idd lesden S, M organ B. A com ponen t of them edicinal herb
ephed ra b lock s activation in class ical and a lternative pathways of com-
p lement[ J] . C lin E xp Immunol, 1995, 102 (3):582 - 588.
[ 2] Oberho lzer J, Yu D, Triponez F, et a l. D ecom p lem en tation w i th cob ra
venom factor p rolongs su rvival of xenografted is lets in a rat to mouse
m ode l [ J] . Immunology, 1999, 97(1):173 - 180.
[ 3] 杨　康 , 刘维永 , 白　云 , 等. 草麻黄中补体抑制成分的纯化和活
性 [ J] . 第四军医大学学报, 2000, 21(12):1558 - 1560.
[ 4] N iem ann H , Verhoeyen E, Wonigeit K, et a l. C ytom egalovirus early
p rom oter induced exp ression of hCD59 in porcine organs provides p ro-
tection against hyperacu te rejection [ J] . Transp lantation, 2001, 72
(12):1898 -1906.
[ 5] Chen G , W ang X M , Sun Q Y, et a l. P revent ion of hyperacu te rejec-
tion of p ig-to-m onkey card iac xenografts by Ch inese cob ra venom factor
[ J] . T ransplan tP roc, 2001, 33(7-8):3857 - 3858.
[ 6] M eyer zu V ilsendorfA , L ink C, Jorn sA , et a l. Precondi tion ing w ith
th e prostacyclin analog epop rosteno l and cob ra venom factor p reven ts
reperfu sion in jury and hyperacute rejection in discordan t liver xeno-
tran sp lantation[ J] . Xeno transplan tation, 2001, 8(1):41 - 47.
(编辑　周　芳)
1775