全 文 ：山西农业科学2014，42（10）：1051-1053，1147 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
李春艳 1，方志红 1，董宽虎 2
（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）
摘 要：根据几种禾本科植物肌动蛋白基因的保守序列设计一对简并引物，以白羊草（Bothriochloa ischaemum）幼
叶总RNA为模板，采用RT-PCR方法克隆获得一个肌动蛋白基因cDNA片段，命名为BiACT，该基因片段长度为
720bp，编码240个氨基酸残基。氨基酸比对分析结果表明，BiACT基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白的氨基
酸序列具有较高的同源性。
关键词：白羊草；肌动蛋白基因；克隆；序列分析
中图分类号：S543＋.9 文献标识码：A 文章编号：1002-2481（2014）10-1051-04
Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene Fragment from Bothriochloa ischaemum
LIChun-yan1，FANGZhi-hong1，DONGKuan-hu2
（1.InstituteofAnimalHusbandry&Veterinary，ShanxiAcademyofAgriculturalSciences，Taiyuan030032，China；
2.CollegeofAnimalScience&Technology，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China）
Abstract：Degenerate primers were designed based on the high homologous region among the sequences of several gramineous
plants ACT genes. Total RNA was extracted from the tender leaves ofBothriochloa ischaemum. An ACT g e f agment was cloned by
using RT-PCR, which was calledBiACT. The fragment cDNA ofBiACT was 720 bp and encoded a 240-amino acid residue. The de-
ducedaminoacidsequenceofB ACTprot insharedhighidentitywithotherAcTINsviamultiplealignment.
Key words：Bothriochloa ischaemum;actin;cloning;sequenceanalysis
收稿日期：2014-07-24
基金项目：山西省农业科学院畜牧兽医研究所基金项目（YGG0853）
作者简介：李春艳（1978-），女，山西岚县人，助理研究员，硕士，主要从事牧草生物技术研究工作。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2014.10.02
肌动蛋白（actin，ACT）是真核生物细胞中一种
重要的蛋白质。我国科学家阎隆飞在1963年就证
明植物中存在肌动蛋白[1]。植物肌动蛋白是构成细
胞骨架的主要成分，执行着重要的生理功能[2-3]。目
前，多种高等植物的肌动蛋白基因序列已被克隆[4-6]。
肌动蛋白家族极其保守，在基因表达调控研究时被
广泛用作分子内标[7-8]。
白羊草是禾本科孔颖草属多年生草本植物，分
蘖力强，特别耐土层瘠薄的山地，石质陡坡也有生
长，具有固土保水、生活力强，高产耐牧、耐践踏、适
口性好等优点[9]。由于白羊草生活力极强，能迅速占
据地面，成为显域性植被的建群种。但目前尚未见
白羊草 ACT基因的相关报道。
本研究以白羊草为供试材料，采用RT-PCR方
法克隆了白羊草ACT基因片段，以其为内参基因，
研究了白羊草中的内源基因的表达及调控特性，旨
在为研究白羊草中其他内源基因的表达分析奠定
基础。
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1 植物材料 以白羊草的种子为试验材料（该
种子由山西农业大学草业科学实验室保存），播前
采用氯气消毒，待种子发芽后移至蛭石与珍珠岩混
合的盆中培养45d左右，长成较好的完整幼苗，以
备试验之用。
1.1.2 菌株、试剂 大肠杆菌感受态DH5α购自北
京天根生化科技有限公司；DNA Maker，pMDR18-
Tvector购自Takara公司；DNAGel Extract Kit 购自
Axygen公司；引物由Invitrogen公司合成；其他常用
试剂采用国产分析纯。
1.2方法
1.2.1 幼苗叶片总RNA的提取 取已经培养好的
白羊草幼嫩叶片，采用Trizol法提取总RNA，提取
后采用DNaseI去除痕量DNA，其方法依照说明书
进行。
1051· ·
山西农业科学2014年第42卷第10期
1.2.2 引物的设计与合成 在GenBank中寻找与
目标基因亲缘关系较近的肌动蛋白基因编码的氨
基酸序列，根据同源性高和简并性低的原则，设计
一对简并引物 ACT-P1 和 ACT-P2，扩增白羊草
ACT基因片段。
ACT-P1：CGTCACACTGGTGTCYTGGTTGG；
ACT-P2：GGTCGTWTCGTGGATTCCTGGAGC。
1.2.3 RT-PCR 扩增 利用 RT-PCR 技术从白羊
草中克隆 ACT基因片段，PCR 引物体系为：cDNA
模板2.5μL；dNTPMix1.25μL；ACT-P1和ACT-P2
分别为 1μL；Taq 酶 0.5μL；10×Taq Buffer 5μL；
最后加ddH2O 至总体积为 50μL。PCR 扩增参数
为：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，56℃退火
30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后 72℃下
延伸10min，然后使用DNAGelExtractKit切胶回
收，回收产物经过连接、转化和蓝白斑筛选，阳性克
隆经 PCR 鉴定为阳性的质粒送 Invitrogen 公司进
行测序。
1.2.4 序列的生物信息学分析 将测序得到的序
列去除载体和引物接头后，用DNAstar软件对BiACT
基因cDNA进行序列比较和翻译分析，BiACT基因
同源氨基酸序列分析在ncbi网站上完成。
2 结果与分析
2.1总 RNA的提取
以白羊草幼叶为材料提取总RNA，在紫外分光
光度计上测定其OD260/OD280的值为1.88；经凝胶电
泳检测，总RNA的3条条带比较清晰（图1），表明
所提取的白羊草总RNA完整性和纯度比较高，可
用于RT-PCR扩增。
2.2白羊草 ACT基因的克隆
利用白羊草叶片提取总RNA，以其反转录合成
的第1链cDNA为模板，以ACT-P1和ACT-P2为
引物进行PCR扩增，得到一段700bp左右的片段
（图2），回收该片段，进行测序比对，结果表明，该片
段可能是白羊草ACT基因的部分保守序列，其长
度为720bp，编码240个氨基酸（图3），将该基因命
名为 BiACT。
1052· ·
（下转第 1147 页）
李春艳等：白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析
2.3白羊草ACT基因序列同源性比较
将白羊草ACT基因利用DNAman软件翻译成
蛋白，在NCBI上采用Blast对ACT基因的氨基酸
同源性进行比对，结果（图4）表明，白羊草与高粱
（Sorqhum bicolor）、玉米（Zea mays）、扁穗牛鞭草
（Hemarthria compressa）、大麦（Hordeum vulqare）、水
稻（Oryza sativa）等禾本科植物同源性在89%以上，
与百合（Lilium regale）、玉兰（Magnolia denudata）等
其他植物ACT基因的同源性也达85%以上。
3 讨论
一般的植物肌动蛋白由376～377个氨基酸残
基组成，具有高度的保守性和表达稳定性[10]。本研
究用DNAman软件将白羊草BiACT基因的氨基酸
序列与高粱等其他7种植物同源基因的氨基酸序
列进行比对发现，该序列与ACT家族其他成员的
同源性很高，其中，同源性最高的是高粱和扁穗牛
鞭草，达到97%；最低的为玉兰，也达到85%。说明
1053· ·
（上接第 1053 页）
本试验克隆的肌动蛋白基因具有高度的保守性，关
于其表达稳定性现正在研究中。
作为一种高产耐牧、耐践踏且具有耐盐碱和干
旱等优良特性的牧草，白羊草中可能蕴藏着比较丰
富的抗逆基因。目前，山西农业大学草业研究室已
在白羊草中成功获得2个耐盐抗旱的功能基因。要
进一步研究这些基因，往往需要内标参照，而 β-肌
动蛋白是植物基因表达研究中使用最广泛的内参
基因[11-12]。但在基因库中未能搜索到有关白羊草的
肌动蛋白基因序列。本研究首次分离并获得了编码
240个氨基酸的白羊草BiACT核苷酸序列，为研究
白羊草其他内源基因的表达和调控奠定了基础。
参考文献：
［1］舒适，刘爱校，刘国琴，等.肌球蛋白研究进展[J].生命的化学，
1999，19（2）：65-68.
［2］陈颖，王刚，赵俊霞.高等植物体内的肌动蛋白[J].生物学通报，
2003，38（1）：13-15.
［3］StaigerCJ，ChilwaMS.Actin localization ofand function in higher
plants[J].Protoplasma，1987，141：1-12.
［4］杨丽霞，李玲.花生肌动蛋白基因的克隆及序列分析[J].花生学
报，2006，35（4）：6-9.
［5］田秀红，高建明，肖强，等.水花生Actin基因片段的克隆及序列
分析[J].生物技术，2006，16（3）：13-14.
［6］田云芳，刘艺平，李涵，等.慧兰Actin基因的克隆及序列分析
[J].河南农业科学，2013，42（6）：107-111.
［7］ThellinO，ZorziW，LakayeB，etal. Housekeepinggenesasinternal
standards：use and limits [J]. Journal of Biotechnology，1999，75：
291-295.
［8］XiaLX，ChenCH，GuoYQ.Characterizationoftheβ-actingene
ofthericefieldeelanditsphylogenyinfish [J].ActaGeneticaSini-
ca，2005，32（7）：689-695.
［9］董宽虎.山西白羊草草地生产性能种群生态位及草地培育的研
究[D].北京：中国农业大学，2004.
［10］王学敏，王美珍，王赞，等.柠条锦鸡儿肌动蛋白基因的克隆和
表达稳定性分析[J].植物生理学通讯，2009，45（8）：765-770.
［11］牙库甫江·阿西木，关波，张富春.植物基因表达转录分析中内
参基因的选择与应用[J].生物技术通报，2011（7）：7-11.
［12］DominguezR，HolmesKC.Actinstructureandfunction [J].Annu
RevBiophys，2011，40：169-186.
483-486，491.
［9］唐湘如.作物产量和品质的碳氮及脂肪代谢的研究进展 [J].湖
南农业大学学报，1997，23（1）：93-103.
［10］许振柱，周广胜.植物氮代谢及其环境调节研究进展[J].应用
生态学报，2004，15（3）：511-516.
［11］唐湘如，官春云.几种酶活性与油菜油分和蛋白质及产量的关
系[J].湖南农业大学学报，2000，26（1）：37-40.
［12］王玉杰，林秀云.玉米籽粒含油量的遗传分析 [J].玉米科学，
1997，5（3）：20-23.
［13］刘仁东，石德权，徐家舜.玉米籽粒含油量的配合力、方差成分
和遗传力及其应用的研究 [J]. 中国农业科学，1992，25（6）：
52-57.
［14］AlexanderDE，CreechRG.Breedingspecialindustrialandnutri-
tional types [C]//GF，ed. Corn and Cron Improvement，Madison：
AmerSocAgronInc，wisconsin，USA，1977：363-390.
［15］韩静，鲁守平，郭庆法，等.高油玉米遗传育种研究现状及展望
[J].山东农业科学，2008（5）：20-23.
［16］陈绍江，宋同明.EMS花粉诱变获得高油玉米突变体[J].中国
农业大学学报，2002，7（3）：12.
［17］吴子恺.新型超高油玉米种质的选育 [J].作物学报，2004，30
（8）：751-756.
［18］黄绍文，孙桂芳.不同氮水平对高油玉米吉油一号籽粒产量及
其营养品质的影响[J].中国农业科学，2004，37（2）：250-255.
［19］刘开昌，胡昌浩，董树亭，等.高油玉米需磷特性及磷素对籽粒
营养品质的影响[J].作物学报，2001，27（2）：267-272.
［20］何萍，金继运，李文娟，等.施磷对高油玉米和普通玉米吸磷特
性及品质的影响[J].中国农业科学，2005，38（3）：538-543.
［21］蒋钟怀，王经武，王瑞舫，等.营养元素对高油1号玉米生长发
育及籽粒品质影响[J].中国农业科学，1990，23（3）：37-43.
［22］何萍，金继运，李文娟,等.施钾对高油玉米和普通玉米吸钾特
性及籽粒产量和品质的影响 [J]. 植物营养与肥料学报，
2005，11（5）：620-626.
［23］史振声，张喜华.钾肥对甜玉米籽粒品质和茎秆含糖量的影响
[J].玉米科学，1994，2（1）：76-80.
［24］杨青华，张景连，王志强，等.不同施肥水平对高油玉米产量和
品质的影响[J].河南农业大学学报，2008，42（2）：155-157.
［25］黄勇，杨青华，李潮海，等.不同质地土壤对高油玉米产量和品
质的影响[J].玉米科学，2006，14（2）：127-129.
［26］李潮海，李有田.不同质地土壤高产夏玉米氮肥追施技术研究
[J].玉米科学，1993，1（4）：53-56.
［27］李潮海，李胜利.不同质地土壤对玉米根系生长动态的影响[J].
中国农业科学，20 4，37（9）：1334-1340.
［28］杨恩琼，袁玲，何腾兵，等.干旱胁迫对高油玉米根系生长发育
和籽粒产量与品质的影响[J].土壤通报，2009，40（1）：85-88.
［29］谷岩，黄智鸿，梁煊赫，等.吉林省不同生态区高油玉米品质及
产量变化研究初报[J].玉米科学，2006，14（4）：74-76，85.
［30］姜海鹰，张宝石，邢吉敏，等.高油玉米杂交种品质及其花粉直
感效应的稳定性分析[J].作物学报，2007，33（12）：2047-2052.
［31］柳延涛，李鲁华，陈树宾，等.种植密度对绿洲农区高油玉米籽
粒品质的影响[J].玉米科学，2010，18（3）：134-139.
［32］吴正锋，王空军.高油玉米源、库生理特性研究Ⅰ.高油玉米产
量受叶源的限制[J].作物学报，2005，31（3）：283-288.
［33］Alexander D E，Lambert R J. Relationship of kernel oil content to
yieldinmaize[J].CropSci，1968，8：273-274.
林必博等：高油玉米品质研究进展
1147· ·