全 文 ：收稿　2002-03-04　　　　修定　2002-07-04
资助　中国 、以色列农业研究基金(项目编号:SIARF2001-04)。
欧芹叶片衰老过程中的核糖核酸酶类型与活性变化
姜微波(中国农业大学食品科学系 ,北京 100094)
Amnon Lers , Nehemia Aharoni(以色列农业部农业研究中心 , 以色列 Bet Dagan 50250)
Changes of RNase Activities During Senescence of Parsley Leaves
JIANG Wei-Bo(Department of Food Science , China Agricultural University , Beijing 100094)
Amnon Lers , Nehemia Aharoni(Department of Postharvest Science of Fresh Produce , Agricultural Research Organization , The
Volcani Center , P .O.Box 6 , Bet Dagan 50250 , Israel)
提要　以凝胶电泳检测核糖核酸酶(RNase)活性的结果表明 , 欧芹叶片中至少有 6 种分子量各不相同的 RNase 显示出活
性。其中一种 a RNase活性在衰老过程中逐渐下降 , 赤霉素可延缓其下降 , b、c RNase 活性在衰老过程中显著增加 , 乙烯加
速 ,而赤霉素则抑制这两种 RNase活性上升。另一种 d RNase活性虽然在赤霉素处理与否的叶片中均显著增加 , 但受乙烯
抑制。e、f RNase活性在各种处理的叶片中均略呈上升趋势。b 、c RNase 活性变化与叶片衰老进程的关联最显著。
关键词　糖核酸酶　叶片衰老　欧芹　凝胶电泳
　　核酸等大分子急剧降解是植物器官衰老的主
要特征之一[ 1 , 2] 。某些核酸水解酶类可能是在衰
老过程中诱导合成或被激活的。早期有关植物组
织中核酸水解酶活性变化的研究仅局限于测定样
品中总体的核酸水解活性或核酸降解速率[ 3] 。所
获得的实验结果是多种核酸酶的综合反应 ,而对不
同核酸水解酶的特性则缺乏了解。本文采用凝胶
电泳核糖核酸酶(RNase)活性检测方法 ,对欧芹叶
片衰老过程中的 RNase 类型与活性变化进行了初
步研究 ,并分析了赤霉素和乙烯对不同 RNase 活
性变化的影响 ,以期为进一步探索 RNase 在叶片
衰老进程中的作用建立基础。
材料与方法
　　材料为欧芹(Petroselinum crispum)的离体叶
片 ,采收于以色列 Bet Dagan地区的一个蔬菜种植
园。取回后放在 24℃、相对湿度 90%～ 95%和避
光的条件下 6 d。乙烯和赤霉素处理同前文[ 4 ,5] 。
取 1 g 叶片加入 2 ml缓冲液(50 mmol·L-1 Tris-
HCl , pH 7.5)在研钵中研磨 , 匀浆后以13 000×
g , 于 4℃条件下离心 20 min , 收集上清液备用 。
蛋白质含量测定参照 Bradford[ 6] 方法 ,以 BSA 作
标准曲线 。
在常规的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE)技术基础上[ 7] ,作如下改变 。样品
前处理时 ,先将含有 20μg 蛋白的样品提取液与 10
μl样品缓冲液[ 0.1 mmol·L-1 Tris-HCl , pH 6.8;
2%(W/ V)SDS 、10%(V/ V)甘油 、0.01%溴酚
蓝(W/ V)]放在 80℃水浴中加热 10 min ,再进行
电泳分离 。浓缩胶的聚丙烯酰胺浓度为 4%,分离
胶中聚丙烯酰胺密度为 12%、厚度为 1.5 mm 。制
备分离胶时加入酵母 RNA(torula yeast RNA , Sig-
ma R-6625)作为 RNase反应底物。胶中底物 RNA
的含量为 0.3 ～ 0.4 mg·ml-1 。电泳完成后 ,将分
离胶放在复性缓冲液(25%异丙醇 、10 mmol·L-1
Tris-HCl , pH 7.5)中浸洗 2 ～ 3 次 ,每次5 ～ 10
min ,再将分离胶置于缓冲液(100 mmol·L-1 T ris-
HCl , pH 7.5)中 ,在 37℃下进行酶反应3 h。用 0.
2%甲基胺蓝(toluidine blue)溶液染色60 min ,再用
自来水脱色 ,每 30 ～ 60 min 换一次水 。经染色和
脱色处理的凝胶背景颜色为蓝色 , RNase 反应部位
颜色变浅 。凝胶中呈现 RNase 反应的区域大小和
该部位的透光率均与 RNase 活性成正比。用凝胶
电泳分析软件(Scion Image , 4.02)对凝胶中酶反应
带的透光度和面积测算各样品中总体 RNase 活性
和各泳带中不同 RNase的相对活性 。
结果与讨论
1　叶片衰老过程中核糖核酸酶活性变化
　　如图 1所示 ,欧芹叶片衰老过程中可以测到
a、b 、c、d 、e、f 等 6种核糖核酸酶(RNase)的活性变
化。在刚采收的新鲜叶片中 , a 、e、f3种 RNase 活
性较强。随着采后时间的延长 ,b 、c、d RNase 活性
也增强。
2　赤霉素和乙烯的影响
　　前文[ 4 ,5]曾报道 ,欧芹叶片存放 6 d后 ,叶片呈
现典型的衰老变化 ,如叶绿素和蛋白含量迅速下
567植物生理学通讯　第 38 卷 第 6 期 , 2002 年 12 月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2002.06.010
图 1　乙烯和赤霉素对欧芹叶片衰老过程中核糖核酸酶(RNase)活性的影响
降 ,赤霉素抑制而乙烯则加速衰老进程。表 1揭
示 ,未作处理的叶片中 ,采后第 2 d几乎观测不出 a
种 RNase 活性 。赤霉素处理的第 2 d和第 4 d均
可测到 a种 RNase 活性 ,而乙烯处理的则测不到。
采后第 4 d在未处理的叶片中 b 种 RNase活
性急剧增加 ,而在赤霉素处理叶片中第 6 d时 b种
RNase活性才急剧增加 ,乙烯处理的叶片中第 2 d
时 b种 RNase活性即明显上升。第 6 d时 ,乙烯处
理叶片中的 b 种 RNase 活性为未作处理叶片的 2
倍 、赤霉素处理叶片的 3倍多(采用 Scion Image 按
表 1分析方法估算)。
c种 RNase的活性在第 2 d未作处理的 、赤霉
素处理的和乙烯处理的叶片中均能观测到 。以乙
烯处理的为最强 。第 6 d时 ,乙烯处理叶片中 c种
RNase活性分别为未处理叶片的 2倍 、赤霉素处理
的 3倍。
采后第 4 d ,在赤霉素处理与否的叶片中均检
测出 d种 RNase 活性 ,在第 6 d时其活性进一步提
高。但在乙烯处理的叶片中则未检测出此酶的活
性。这说明乙烯可能抑制了 d种 RNase 的基因表
达或酶的合成 ,显示乙烯诱导的衰老过程与自然衰
老过程并不完全相同 。
欧芹中的 e 、f 两种 RNase 的活性在衰老过程
中也呈现上升趋势 ,但在不同处理之间差异不显
著。表 1显示 ,欧芹叶片存放 6 d 后 ,未作处理的
叶片中总 RNase 活性上升 2 倍多 ,乙烯处理的增
加 3 倍多 ,而赤霉素处理则下降 , 为未作处理的
76%和乙烯处理的 58%。
　　综上所述 ,可以看到两点:(1)欧芹叶片至少有
6种分子量不相同的 RNase 显示出活性 。在衰老
过程中 , a 种 RNase 活性逐渐下降;b 、c、d 3 种
RNase活性逐渐增加 , d 种 RNase 活性受乙烯抑
制 ;e 、f 2种 RNase活性略呈上升趋势 。在几种
表 1　乙烯和赤霉素处理的欧芹叶片中总核糖核酸酶活性比较
处理 采后时间/ d
0 2 4 6
对照 330 500 960 1170
乙烯 330 480 560 890
赤霉素 330 710 85 1540
　　用凝胶电泳分析软件 Scion Image(4.02)分析 ,测算的结果以
采后 0 d的样品中 a种 RNase 的活性为 100计算。
RNase中 , b 、c 2种 RNase 活性变化与衰老进程的
关联最显著。(2)用凝胶电泳分析 RNase 活性时 ,
凝胶厚度会影响分析的灵敏度 。染色后的凝胶背
景颜色与凝胶片厚度成正比 。由于靠近凝胶表面
的 RNase在浸洗过程中易扩散到洗液中 ,所以在
凝胶密度和底物 RNA含量相同的情况下 ,凝胶片
较薄时 ,检测 RNase 活性的灵敏度会降低 。凝胶
片较厚时 ,我们的经验是应延长凝胶“复性处理时”
的时间 ,以确保凝胶中的 SDS得以洗脱干净。
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568 植物生理学通讯　第 38 卷 第 6 期 , 2002 年 12 月