全 文 ：热带作物学报 2014， 35（8）： 1546-1550
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2014-01-24 修回日期 2014-03-27
基金项目 海南省科技成果示范推广专项项目（No. CGSF2011003）； 海南省重点科技计划项目（No. ZDXM 20120004）。
作者简介 胡翔宇（1988年—）， 男， 硕士研究生； 研究方向： 分子生物学。 *通讯作者（Corresponding author）： 宋希强（SONG Xiqiang）， E-mail：
songstrong@hainu.edu.cn。
2种保存方法对五唇兰基因组 DNA
提取质量的影响
胡翔宇 1，2， 丁 琼 2， 宋希强 1，2*， 王 健 2， 钟云芳 1，3
1 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室， 海南海口 570228
2 海南大学园艺园林学院， 海南海口 570228
3 海南珠峰园林科技有限公司， 海南海口 570010
摘 要 采用改良 CTAB 法研究经硅胶干燥法和保鲜法保存的五唇兰叶片 DNA 降解规律， 并比较两种保存方法
叶片 DNA 的保存时间， 为叶片的野外远距离采集提供指导。 结果显示， 采取硅胶干燥法进行保存的五唇兰叶片
DNA 和 SOD 以及 POD 的含量下降迅速， 第 1 天 DNA 的产率已经下降到 65.4 ng/g， ISSR 引物可以检测出 7 条清
晰的条带， 第 2 天 DNA 则降解完全， SOD 和 POD 含量 2 d 内快速较少， 第 2 天分别降到 68％和 27％； 采取叶
片保鲜法保存的五唇兰叶片 DNA 一周内保存完好， 产率较高， 为 71 ng/g 左右， ISSR 引物可以检测出 7 条清晰
的条带， 7 d 之后 DNA 开始降解， ISSR 引物扩增出的条带变得模糊， 随着叶片衰老进程的加剧以及叶片开始出
现腐烂等性状， DNA 降解逐渐加速， 第 13 天降解完全， SOD 和 POD 含量的变化呈现出与 DNA 产率一致的趋
势， 先上升后下降， 在第 9 天达到峰值。 叶片 DNA 的降解规律和衰老规律呈现出一致性 ， 离体五唇兰叶片
DNA 降解主要原因来自于叶片衰老的加剧以及期间产生的有毒物质的积累， 野外远距离采集五唇兰叶片可采用
保鲜法保存以防止 DNA 的快速降解。
关键词 蝴蝶兰； 远距离采样； 叶片衰老； DNA 降解
中图分类号 S682.3 文献标识码 A
Effects of Two Sample Preserving Methods on Genomic
DNA Extraction Quality of Phalaenopsis
pulcherrima (Orchidaceae)
HU Xiangyu1,2, DING Qiong2, SONG Xiqiang1,2*
WANG Jian2, ZHONG Yunfang1,3
1 Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources (Hainan University),
Ministry of Education, Haikou, Hainan 570228, China
2 College of Horticulture and Landscape Architecture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
3 Hainan Evergreen Landscape Technology Limited Company, Haikou, Hainan 570010, China
Abstract A modified CTAB method was used to research the DNA degradation rule of P. pulcherrima leaves
saved with silica gel and the low temperature fresh-keeping method respectively. The results showed that DNA
degradation of leaves saved with silica gel was rapid, the DNA production rate after one day dropped to 65.4 ng/g,
seven clear bands were detected using ISSR primers, and DNA degraded completely after two days; However,
DNA of P. pulcherrima leaves saved with low temperature fresh-keeping method could be preserved for one week,
and the yield was higher, about 71 ng/g, ISSR primers could detect seven clear bands, after 7 days DNA began to
degrade and PCR bands became blurry The rule of DNA degradation and senescence showed consistency. The
main reasons for degradation of leaf DNA were intensification of senescence and the accumulation of toxic
substances produced during the period. Leaves of P. pulcherrima sampled in the wild can take the method of low
temperature to keep fresh.
Key words Phalaenopsis; Long-distance sampling; Leaf senescence; DNA degradation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.017
第 8 期 胡翔宇等： 2种保存方法对五唇兰基因组DNA提取质量的影响
DNA 的提取与纯化是进行分子标记试验最关
键的一步， 获得高质量的 DNA 样品是进行 PCR 扩
增的前提[1]。 叶片采集之后， 离体叶片由于受到内
外因素的限制， 不可避免地产生衰老。 Nodden 概
括了以往叶片衰老研究结果后提出叶片衰老的中心
途径可分为 3个时期。 诱导期： 内外因素导致了叶
片衰老的形成， 如激素、 糖类、 水分、 温度等； 重
组期： 大分子如蛋白质和脂类开始降解； 终止期：
叶片衰老的最后时期 ， 细胞自溶反应 ， 核酸如
DNA开始降解[2]。
因此， 若采集材料后不能马上进行实验， 那么
就要选取合适的保存方法以延缓叶片的衰老， 防止
DNA的降解。 Doyle 和 Dickson[3]曾用解剖学上常用
的化学试剂来保存植物材料， 但获得 DNA 均被严
重降解， Chase 和 Hills[4]用硅胶快速干燥法保存金
虎尾科(Malpighiacae)等植物叶片， 获得 DNA 与新
鲜叶片相似。 远距离采样一般无法对新鲜材料立刻
提取 DNA， 干燥的植物样本可以用硅胶浸润， 并
用塑料袋密封， 如果样本干燥不彻底， 那么 DNA
很可能在短时间内降解； 采用液氮或干冰低温保存
材料， 则携带运输不便， 不安全， 费用也高， 一些
特殊的材料， 比如新生的嫩芽可以在 4 ℃存放几
天， 比较大的组织如树枝可以用湿布包裹， 外面套
一层塑料， 防止脱水[5]。
五唇兰(Phalaenopsis pulcherrima)， 兰科蝴蝶兰
属， 东亚特有种， 我国仅海南昌江、 乐东等地有分布。
生于密林或灌丛中， 常见于覆有土层的岩石上 [6]。
五唇兰叶片肉质或厚肉质， 采集之后如不采取特殊
的保存措施 ， 叶片容易快速的衰老和腐烂 ， 对
DNA 的提取造成较大的影响 。 本研究使用改良
CTAB 法比较了离体叶片分别在硅胶干燥和叶片保
鲜保存后 DNA 的提取质量及其降解规律， 拟探究
以下问题： （1）两种方法保存的五唇兰叶片衰老的规
律；（2）两种方法保存的五唇兰叶片 DNA降解规律；
（3）叶片衰老和叶片 DNA降解之间的关系；（4）五唇
兰 DNA野外远距离的采样策略。
1 材料与方法
1.1 材料的采集与处理
五唇兰叶片采自海南大学园艺园林学院教学实
践基地， 采集生长良好、 无病菌的叶片。 设置两种
处理： （1）采集的五唇兰叶片剪成小块（约长6 mm×
宽6 mm）立即放入盛有硅胶的封口袋中干燥， 硅胶
变色后立即更换新硅胶； （2）采集的叶片放入盛有
干冰的泡沫盒中， 带回实验室放入 0℃冰箱内。
1.2 方法
1.2.1 五唇兰叶片 DNA的提取以及质量的检测
分别于第 0、 1、 2、 3、 5、 7、 9、 11、 13 天，
采用 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法 [7]提取五唇
兰叶片基因组 DNA， 并用琼脂糖凝胶电泳和分光
光度计测定基因组 DNA 的质量和浓度。 DNA 浓度
(ng)=A260×50×稀释倍数×原液体积/1 000； DNA 产率
(ng/g)=DNA浓度(ng)/叶片质量（g）。
1.2.2 ISSR-PCR 电泳检测五唇兰叶片的 DNA 质
量 使用哥伦比亚大学公布的 100 套引物中的引
物 827 电泳检测五唇兰叶片 DNA 提取质量， 反应
体系为在 20 μL 的反应体系中， Taq DNA 聚合酶
1.0 U， Mg2+ 1.5 mmol/L， dNTP 1.80 mmol/L， 引物
0.5 μmol/L， DNA为 30 ng。
1.2.3 五唇兰叶片 SOD、 POD 含量的测定 SOD
(Superoxide Dismutase, 即超氧化物歧化酶 )含量的
测定参考 Spychalla 和 Desborough [8]的方法， POD
(Peroxidase, 即过氧化物酶 )的含量测定参考 Polle
等[9]的方法。 五唇兰叶片鲜样分别在第 1、 2、 3、 5、
7、 9、 11、 13天测定 SOD和 POD 的活性， 五唇兰
干样叶片在第 1、 2天测定 SOD和 POD的活性。
1.2.4 五唇兰叶片含水量的测定 采用干燥法测
定五唇兰叶片含水量， 首先测定叶片鲜重 M1， 将
叶片放置于烘箱中， 105 ℃干燥 4 h 至恒重， 测定
叶片干重 M2， 叶片含水量为（M1-M2）/M1。
2 结果与分析
2.1 2种保存方法五唇兰叶片 DNA的降解规律
2.1.1 2种保存方法五唇兰叶片 DNA质量的变化
低温鲜样保存的五唇兰叶片， 保存 7 d， 质量
良好， 提取的 DNA 电泳条带清晰、 明亮。 第 7 天
后 DNA开始逐渐降解， 至第 13天降解完全， 此时
无电泳条带（图 1-a～e）； 而采用硅胶干燥保存的五
唇兰叶片， 第 2天 DNA降解完全（图 1-f～g）。
2.2 2种保存方法五唇兰叶片 DNA产率的变化
低温鲜样保存法的五唇兰叶片在前 7 d DNA
的提取产率基本上无变化， 维持在 71％左右， 从
第 7 天开始叶片 DNA 产率急剧下降 ， 第 13 天
DNA 产率为 0， DNA 分解完全； 而硅胶干燥保存
的五唇兰叶片则在第 1 天 DNA 产率就已经下降到
65.4 ng/g， 第 2 天 DNA 产率为 0， 此时 DNA 分解
完全（表 1）。
2.3 2 种方法保存五唇兰叶片 DNA PCR 扩增结
果的变化
采取低温鲜样保存法的五唇兰叶片前 7天 PCR
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第 35 卷热 带 作 物 学 报
a为鲜样保存法第7天DNA扩增图， b为鲜样保存法第9天
DNA扩增图， c为硅胶干燥保存法第1天DNA扩增图。
a, b were DNA amplification map of 7th day and 9th day for
fresh-keeping method, c was DNA amplification map of 1st day for
silica gel drying method.
图2 PCR扩增检测2种保存方法的叶片DNA提取质量
Fig. 2 DNA extraction quality of leaves saved with two
different methods detected by PCR amplification
表1 2种保存方法DNA产率的变化
Table 1 DNA yield of leaves with two preservation methods
说明： A、 B等大写字母代表鲜样DNA产率的差异显著性， a、
b等小写字母代表干样DNA产率的差异显著性。
Notes: Capital letters represent the difference of DNA yield of fresh
samples, Lowercase letters represent the difference of DNA yield of dry
samples.
时间/d 鲜样DNA浓度/ng
鲜样DNA
产率/(ng/g）
干样DNA
浓度/ng
干样DNA
产率/(ng/g)
1 19.0 72.3 A 15 65.4 a
2 18.0 71.2 A 0 0 b
3 18.2 71.5 A
5 18.6 71.3 A
7 17.9 70.8 A
9 13.2 60.1 B
11 9.5 43.9 C
13 0 0 D
扩增效果较好， 扩增出了 7 条清晰的条带， 而第 9
天扩增的条带较为模糊， 条带数量也减少到 5 条
（图 2-a、 b）， 因此采取低温鲜样保存法的五唇兰
叶片适宜在一周内提取 DNA 并进行 PCR 扩增； 而
采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片在第 1天可以扩
增出 7条清晰的条带， 但第 2天则无法扩增出条带
（图 2-c）。
2.4 2种保存方法五唇兰叶片的衰老规律
2.4.1 2 种保存方法五唇兰叶片 SOD 和 POD 含量
的变化 采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片 SOD
和 POD 的含量都呈现出先上升后下降的趋势， 峰
值出现在第 9 天， 之后由于叶片开始出现腐烂现
象， SOD 和 POD 的含量开始下降（图 3）； 而采取
干燥保存法的五唇兰叶片 SOD 和 POD 的含量则在
2 d 内急剧下降， 第 2 天 SOD 和 POD 的含量已经
下降到很低（图 4）。
2.5 2种保存方法五唇兰叶片含水量的变化
采用低温鲜样保存法的五唇兰叶片含水量在
13 d 之内呈现稳定的趋势， 维持在 90％～95％之
a、 b、 c、 d、 e为鲜样保存法第1、 2、 9、 11、 13天的DNA提取电泳图， f、 g为硅胶干燥保存法第1、 2天的DNA提取电泳图。
a,b,c,d,e were DNA electrophoresis map of 1st, 2nd, 9th, 11th, 13th day for fresh-keeping method, f,g were DNA electrophoresis map of
1st, 2nd day for silica gel drying method.
图1 DNA凝胶电泳比较2种保存方法DNA提取质量
Fig. 1 DNA quality with two preservation methods using gel electrophoresis
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
a b c d e f g
时间/d
1 2 3 5 7 9 11 13
160
140
120
100
80
60
40
20
0
SO
D
活
性
/[U
/（
m
in·
g）
]
PO
D
活
性
/（
U/
g）
SOD
POD
A
a
A
a
A
CB
a
b
c d
e
f
F
D
E
A、 B等大写字母代表SOD含量的差异显著性， a、 b等小写
字母代表POD含量的差异显著性。 下同。
Capital letters represent the difference of SOD content, Lowercase
letters represent the difference of POD content. the same as below.
图3 五唇兰叶片鲜样保存法SOD和POD活性变化
Fig. 3 SOD and POD activity of leaves preserved
with fresh-keeping method
a b c
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第 8 期 胡翔宇等： 2种保存方法对五唇兰基因组DNA提取质量的影响
间， 13 d 之内的含水量无明显差异（p>0.05）； 而采
取干燥保存法的叶片含水量两天内虽然有所下降，
但是含水量仍在 80％以上（图 5）。
3 讨论与结论
3.1 采取鲜样保存法的五唇兰叶片衰老和 DNA 降
解之间的关系
超氧物歧化酶(SOD)、 过氧化物酶(POD)等可清
除活性氧自由基， 从而防止自由基的毒害， 称其为
保护酶系统[10]。 正常情况下 SOD、 POD活性相对稳
定， 而在衰老过程中 SOD、 POD 活性逐渐升高 ，
A
a
B
b
SO
D
活
性
/[U
/（
m
in·
g）
]
PO
D
活
性
/（
U/
g）
SOD
POD
120
100
80
60
40
20
0
1 2
时间/d
图4 五唇兰叶片干燥保存法SOD和POD活性变化
Fig. 4 SOD and POD activity of leaves preserved by silica gel
图5 五唇兰叶片2种保存方法含水量的变化
Fig. 5 Changes in water content of leaves preserved with two methods
时间/d
AAAAAA
a
b
1 2 3 5 7 9 11 13
含
水
量
/％
鲜样保存
干燥保存
105
100
95
90
85
80
75
70
AA
清除植物体内过量的活性氧， 保护膜结构， 从而能
在一定程度上延缓植物器官的衰老过程[11]。
叶片衰老的诱导和重组阶段， 一些大分子如蛋
白质、 脂类产生降解， 但 DNA 不被分解 [12]， 在叶
片衰老的终止阶段， 细胞开始产生自溶性反应， 可
以检测到例如染色质浓缩以及 DNA 片段化等细胞
凋亡的显著特征 [13-14]。 本研究第 8～13 天， 采取低
温鲜样保存的五唇兰叶片属于叶片衰老的终止阶
段， 在此阶段叶片开始腐烂， DNA 产率快速减少
（p<0.05）， SOD 和 POD 含量开始有略微的增高（第
8～9 天）， 之后急剧下降， 研究结果与朱诚等 [12]以
及 Wollaston 等 [15]的研究结果一致， 因此低温鲜样
保存法使五唇兰叶片保存一周而 DNA不被降解。
3.2 采取硅胶干燥保存法的五唇兰叶片衰老和 DNA
降解之间的关系
环境湿度的降低能够明显的促进 DNA的降解[16]，
环境湿度最终通过影响叶片含水量而间接影响叶片
DNA的降解。
现阶段， 为了使叶片 DNA 不被降解， 硅胶快
速干燥保存已经成为一种非常有用的叶片方法， 前
人已经使用硅胶干燥叶片来保存叶片并获得了良好
的研究结果 [17-19]。 然而， 五唇兰叶片肉质， 硅胶无
法对叶片进行快速干燥， 采取硅胶干燥保存方法的
五唇兰叶片第 2 天仍具有很高的含水量（81.2％），
五唇兰叶片含水量的降低对叶片本身形成了干旱胁
迫， 加快了叶片衰老的进程， 叶片衰老在两天之内
快速完成， 期间 SOD 和 POD 活性快速降低， DNA
急剧降解。
3.3 五唇兰叶片野外采集之后的保存
野外采集叶片时由于采取真空法以及液氮保存
法较为困难， 因此对于较薄且水分容易散失的叶
片， 一般采取硅胶快速干燥法进行保存， 既经济又
方便。 然而五唇兰叶片含水量较高， 且叶片表面角
质层较厚， 因此采取硅胶干燥法无法快速的去除叶
片的水分， 从而形成干旱胁迫， 加剧了衰老的进
程， 促进 DNA 的快速降解。 因此对于五唇兰这种
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肉质叶片以及叶片角质层较厚从而无法使水分快速
散失的植物， 采取保鲜的方法对植物的叶片进行保
鲜保存是一种非常简便又经济的方法， 比如将叶片
放入盛有干冰的冰盒以及如有条件可以放入 0℃或
者 4℃冰箱等可保存 7 d。
致 谢 海南大学园艺园林学院蒙真铖和武华周同学
参与了部分工作， 特致谢忱！
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责任编辑： 沈德发
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