全 文 ：　第 39卷　第 12期
2006年 12月
天　津　大　学　学　报
Journal of T ianj in Un iver sity
Vo.l 39　No. 12
Dec. 2006
　
川蔓藻水浸提液的克藻效应与机理*
王卫红 , 季　民 , 张　楠 , 王苗苗
(天津大学环境科学与工程学院 , 天津 300072)
摘　要:采用普通小球藻在不同浓度的川蔓藻水浸提液中纯培养的方法 , 研究了川蔓藻对普通小球藻的克藻效应
与机理.结果显示 , 川蔓藻的水浸提液对普通小球藻的抑制作用显著并具有浓度效应 . 96 h的抑制率与浸提液浓度
的对数线性相关.半抑制浓度( IC50)为 6. 332 g(dw) /L. 川蔓藻的水浸提液使藻细胞内丙二醛的含量急剧增高 , 并
显著改变了藻细胞外可溶性蛋白和多糖的比值. 透射电镜观察显示 ,川蔓藻的水浸提液主要损伤藻细胞的膜系统.
川蔓藻水浸提液对普通小球藻的抑制机理为:损坏藻细胞的膜系统和改变胞外聚合物的含量 , 从而增加小球藻表
面的疏水性 ,最终藻细胞絮凝沉降死亡.
关键词:川蔓藻;水浸提液;普通小球藻;克藻效应
中图分类号:X524;S451　　　文献标志码:A　　　文章编号:0493-2137(2006)12-1417-05
A llelopathy andM echanism of Extracts from Ruppia
M aritima on Chlorella Vulgaris
WANG Wei-hong, JIM in, ZHANG N an, WANG M iao-miao
(Schoo l o f Env ironment Science and Eng inee ring, T ian jin University, T ian jin 300072, China)
Abstract:The allelopathy and mechanism ofRuppia m aritima w ere studied by pure-cultivating Chlorella vul-
garis w ith different crude extracts from Ruppia maritima . The resu lt shows that the extracts have significant in-
hibition toChlorella vulgaris asw ell as concentration-effect relationship. Inhibition rate at 96 h is linear to the
concentration logarithm of the ex tracts, IC50 of the extracts inhibition to the grow th o fChlorella vulgariswas cal-
culated as 6. 332 g(dw) /L. The ex tracts m ade the content ofMDA in the algae cell increase sharply , and
changed the ratio of ex tracellular protein and polysaccharide. T ransm ission electron m icroscope(TEM ) show s
that them em brane sys tem of the algae cellw as destroyed by the ex tracts. Inhibition mechanism of the crude ex-
tracts from Ruppia maritima on Chlorella vulgaris is to dam age the membrane system of the algae ce ll and
change extracellu lar polym eric substances ofChlorella vulgaris, thus the increase in the ratio o fpro tein and total
carbohydrate leads to the increase in hydrophobicity of the algae ce ll, finally algae cell flocculates and subsides
to the death.
Keywords:Ruppia maritima;extracts;Chlorella vulgaris;allelopathy
　　自 1969年 F itzgerald[ 1]发现水生植物的代谢产物
可能控制藻类的生长以来 ,已经发现有大量的水生植
物对藻类的生长繁殖具有抑制作用. 其中沉水植物川
蔓藻(Ruppia maritima)由于其广泛的盐度容忍性以及
在富营养化的水体中迅速生长的能力备受关注 ,成为
滨海湿地生态恢复的首选先锋植物 [ 2] . 大量的研究表
明川蔓藻能够显著地改变河口海岸带栖息地的水质质
量和沉积物的生物地球化学循环 [ 3] . 但是关于川蔓藻
对富营养化水体中优势藻类的抑制效应以及对藻类的
抑制机理研究较少. M arina De llaG reca等人 [ 4] 曾报道
使用石油醚从烘干的川蔓藻植株体中分离提取出 7种
ent-labdane diterpenes物质 ,其中有 2种物质具有显著
* 收稿日期:2006-02-27;修回日期:2006-07-03.
　　　基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2003AA601030).
　　　作者简介:王卫红(1968—　　),女 ,博士研究生 , red_w angw ei@163. com.
的克藻效应.但在实际的生态工程中 ,沉水植物与藻类
之间的化感作用则以水体为媒介发生相互作用. 因此
笔者使用川蔓藻的水浸提液 ,在实验室条件下研究了
它对普通小球藻 (Ch lorella vulgaris)的克藻效应和克
藻机理 ,目的在于进一步了解沉水植物川蔓藻的生态
功能 ,探索一种修复富营养化水体的方法.
1　材料与方法
1. 1　材料
　　沉水植物川蔓藻 (Ruppia maritima)采自天津滨海
新区一条再生水河道中 ,在一只 120 L高度 60 cm的
塑料水箱底部铺 10 cm厚河道底泥 ,用取自河道的再
生水室外培养 ,自然光照.实验时采适量分别悬浮培
养 [ 5]在装有蒸馏水的 2 L烧杯中 ,置于实验室光照培
养箱中 ,温度 (25±2) ℃,光照度 (4 000±100) lx,驯
化 2 d后用于实验. 川蔓藻在放入前先用自来水和蒸
馏水反复冲洗 ,再用质量分数为 0. 10 /0的 HgC l2溶液消
毒 ,然后用无菌水冲洗干净 ,滤纸吸干 ,称重.
　　实验藻种为普通小球藻 (Ch lorella vu lgaris),购自
中国科学院武汉水生所藻种库. 使用改良的水生 4号
培养液培养 , 在 HPG-280B型光照培养箱中 ,温度为
(24±2)℃, 250mL锥型瓶 ,培养量为 100mL.普通小
球藻培养光照度为 (4 000±100) lx,光暗比 12 /12 h,
培养期间每天摇瓶 3次 ,当其进入生长对数期后用于
实验.
1. 2　川蔓藻水浸提液的克藻实验
　　浸出液的制备:用自来水和蒸馏水将川蔓藻植株
反复冲洗干净 ,烘箱中 80 ℃烘 48 h后 ,粉碎研磨过
100目筛 ,取 50 g加入 500mL锥形瓶中 ,再加 250 mL
超纯水 ,置于恒温 (25 ℃)震荡器中提取 48 h,先用普
通滤纸过滤 ,再用 0. 45 μm滤膜减压抽滤 ,然后装入
500mL容量瓶中用超纯水定容 ,得到浓度为 1∶10的
川蔓藻水浸提液 , 备用. 同时用 GC-MS检测其化学
成分.
　　试验方法:在无菌条件下将浸提液 (0、5、10、 l5、
20、25mL)加入 250 mL锥形瓶内 ,再加入灭菌营养液
和处于对数生长期的小球藻 , 使培养藻的总体积为
100mL,且每瓶营养液浓度相同. 每个浓度设 3个平行
对照. 初始藻密度为 3. 49 ×106个 /mL. 培养条件为:
光暗比 14 /10 h,光照度 4 000 lx,温度 25 ℃ . 每天摇
瓶 3次 ,培养 7 d. 隔 24 h用血球计数板在显微镜
(16×40倍 )下计藻数.实验结束时 ,测定藻细胞丙二
醛含量和藻细胞胞外可溶性聚合物.
1. 3　藻类的生物指标测试
　　藻细胞丙二醛含量的测定和计算方法参照文献
[ 6]的硫代巴比妥酸 (TBA)比色法. 藻细胞胞外可溶
性聚合物的提取与测定参照文献 [ 7— 8]并改进如下:
将各种处理培养的藻液收集至 50 mL 离心管中 ,
4 500 r /m in离心 5m in,取上清液;再用 M illi-Q水悬浮
藻细胞 ,离心 5m in,取上清液 ,重复 3次;然后在沉淀
中加入 900 /0的乙醇 10mL,提取 5m in,离心 5m in,取上
清液;后再用 M illi-Q 水冲洗 3 次 , 离心 5 m in
(4 500 r /m in),取上清液. 合并所有离心上清液即为小
球藻在添加不同浓度浸提液的培养液中的胞外聚合物
(ex trace llu lar po lyme ric substances, EPS)的水溶性组
分.将可溶性 EPS提取液置于蒸发皿中浓缩 ,定容体
积 25mL,然后在蒸馏水中透析 24 h,用于测定. 可溶
性糖和蛋白质的测定参阅文献 [ 6] . 糖类测定采用蒽
酮比色法 ,蛋白质的测定采用 Folin-酚试剂法. 粗脂含
量测定参照文献 [ 7]的方法.
1. 4　藻细胞超微结构的观察
　　在第 2天 、第 4天和实验结束时分别收集处理组
和对照组的藻细胞 ,用 40 /0(体积分数)戊二醛及 10 /0(体
积分数 )锇酸双重固定 ,各级丙酮脱水 , Epon815包埋 ,
LKB-V超薄切片机切片 ,切片经醋酸双氧铀和柠檬酸
铅染色 ,于 Philips EM 400ST透射电镜下观察并拍照.
1. 5　数据处理
　　藻类的抑制率为
　　　I=(N 0 -N t )N/ 0 ×1000 /0
式中:N t是 t时刻处理组的藻密度 (个 /mL);N 0是 t
时刻对照组的藻密度 (个 /mL).
　　实验数据采用 SPSS 11. 5软件包进行独立样本检
验统计分析 ,以 P <0. 05显著性差异 , P <0. 01为极显
著性差异.
2　结果与分析
2. 1　川蔓藻水浸提液对普通小球藻生长的影响
　　藻类的生长符合 log istic模型 ,其曲线为 S型. 当
藻类受到外源物质影响时 ,其生长曲线会发生改变.从
图 1可以看出川蔓藻的水浸提液对普通小球藻的抑制
作用显著并具有浓度效应. 在培养 48 h之前 ,低浓度
的 3组 (加人浸提液 5、10和 15 mL)表现出促进作用 ,
48 h之后则表现出抑制作用 , 96 h的抑制率达到
47. 450 /0、56. 460 /0和 66. 190 /0.高浓度的 2组 (加入浸提
液 20和 25mL)在整个培养期间均表现为抑制作用 ,
培养 96 h的抑制率为 79. 110 /0和 82. 050 /0.川蔓藻对普
通小球藻的抑制率随浓度升高而增强. 96 h川蔓藻水
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浸提液对普通小球藻的抑制率与浸提液浓度的对数线
性相关 ,如图 2所示. 回归方程为
　　　I=51. 877logC +8. 419 1　(R 2 =0. 948 7)(1)
　　根据浓度-效应关系方程 ,计算出对应的 96 h的
IC50值 ,换算成以川蔓藻干质量与水的体积比表示的
浓度为 6. 332 g(dw) /L.
图 1　不同浓度的川蔓藻水浸提液对普通
小球藻生长的抑制曲线
Fig. 1　Growth curve ofChlore lla vu lgaris in d ifferen t
concen tration extracts from Ruppia maritima
图 2　96 h川蔓藻水浸提液与普通小球藻的浓度-效应关系
F ig. 2　C oncen tration-e ffect relationsh ip betw een extracts
from Ruppia maritima and ch lore lla
vu lgaris at 96 h
2. 2　川蔓藻水浸提液对藻细胞外聚合物的影响
　　藻细胞的表面物质与它的疏水性和亲水性密切相
关.这些表面物质是细胞壁外的胶被和疏松结合在胶
被外的细胞外化合物 ,其组成成分主要是蛋白质 、多糖
和脂类.环境条件变化能够改变胶被和胶被外化合物
的种类和数量[ 9] . 在用不同浓度的川蔓藻水浸提液作
用下 ,普通小球藻胞外聚合物即可溶性蛋白质 、多糖和
脂质含量的变化 ,见图 3.
　　所有浸提液浓度下生长的藻细胞外可溶性蛋白质
和多糖的含量都明显高于对照组 ,而且随浸提液浓度
的增加而增加.胞外粗脂的含量变化则表现出低浓度
组和高浓度组影响明显 ,其他浓度组只比对照组略有
增加且含量相近.回归分析发现 ,川蔓藻水浸提液对藻
细胞外可溶性蛋白和多糖的影响强度随浓度增加由快
速变为缓慢 ,曲线呈抛物线型 ,对粗脂的影响则没有明
显的规律.投加的川蔓藻水浸提液的体积 X (mL)与藻
细胞外可溶性蛋白浓度 Y (μg /mL)的回归方程为
　　　Y =- 0. 118 3X 2 +5. 623 6X +8. 358 7
　　　　　　　　　　　　　(R 2 =0. 985 3) (2)
　　投加的川蔓藻水浸提液的体积 X (mL)与藻细胞
外可溶性多糖浓度 Y (μg /mL)的回归方程为
　　　Y =- 0. 025 2X 2 +1. 161 4X +18. 07
　　　　　　　　　　　　(R2 =0. 939 1) (3)
(a)浸提液对胞外蛋白质和多糖的影响
(b)浸提液对胞外粗脂的影响
图 3　不同浓度的川蔓藻水浸提液对普通
小球藻细胞外聚合物的影响
F ig. 3　Effec ts of d ifferen t concen tration extracts from
Ruppia maritima on extrace llu lar po lym er ic
substances ofChlore lla vu lgaris
　　从图 3可以明显地看出 ,川蔓藻浸提液改变了藻
细胞外可溶性蛋白和多糖的比例 ,正常生长的对照组
中多糖含量高于蛋白质含量 , 蛋白质与多糖比值为
0. 366,而处理组中蛋白质含量则显著高于多糖含量 ,
蛋白质与多糖的比值上升到 1. 427 ～ 2. 426. 通常蛋白
质与多糖的比值与藻细胞的疏水性正相关 [ 10] . 因此在
川蔓藻浸提液的作用下藻细胞的疏水性增强 ,促进藻
细胞之间的絮凝沉降.
2. 3　川蔓藻水浸提液对藻细胞丙二醛含量的影响
　　丙二醛 (MDA)是膜脂过氧化的产物 ,其形成和积
累量可作为细胞膜结构损伤 、藻体受胁迫程度的一种
1419 　2006年 12月　　　　　　　　　　　王卫红等:川蔓藻水浸提液的克藻效应与机理
标志[ 6] . 由图 4可见 ,所有浸提液浓度的藻细胞丙二醛
含量都显著高于对照组 ,尤其是加 5mL浸提液的一组
MDA含量最高 ,约为对照组的 38倍;而加浸提液 10、
15、20和 25mL的 4组 MDA含量则反而降低且含量
相近. 这是由于低浓度的浸提液在培养初期促进藻细
胞大量繁殖 ,浸提液对小球藻细胞的破坏随时间逐渐
从细胞壁向细胞膜渗透 ,培养末期大量的藻细胞还未
图 4　不同浓度的川蔓藻水浸提液对普通
小球藻细胞丙二醛含量的影响
Fig. 4　E ffects of the extracts from Ruppia maritima on
MDA ofChlore lla vu lgaris
解体 ,所以 MDA含量最高. 浸提液浓度从 5 mL增加
到 10 mL时 , MDA含量迅速降低 ,以后随浓度增加
MDA含量几乎不再变化 ,说明藻细胞膜结构受到严重
损伤 ,大量藻细胞开始解体的体积值在 5 ～ 10 mL之
间 ,这与根据浓度-效应关系方程计算出的对应 96 h
的 IC50值相吻合.
2. 4　川蔓藻水浸提液对藻细胞超微结构的影响
　　透射电镜对普通小球藻细胞超微结构观察见图
5. 正常生长的对照组藻细胞可见完整的细胞壁和细胞
膜 ,以及叶绿体内排列紧密整齐的类囊体片层和明显
的淀粉盘托着的蛋白核(图 5(a)和(d)).浸提液对普
通小球藻的结构损伤随浓度和培养时间逐渐增加. 低
浓度主要损伤藻细胞的膜系统和光合系统 (见图 5(b)
和 (e)),叶绿体内平行排列的片状类囊体受浸提液毒
害后变成条索状排列 ,甚至呈不规则的波纹状;培养
3 d后藻细胞膜局部破裂并释放蛋白核.高浓度浸提液
则在短时间内就能使许多藻细胞解体 ,并使细胞内物
质释放 (见图 5(c)和( f)).这与加 5mL浸提液的低浓
度组丙二醛含量显著高于其他浓度组 ,而高浓度组中
可溶性蛋白和多糖含量较高的结果相吻合.
图 5　川蔓藻浸提液对普通小球藻超微结构的影响
F ig. 5　E ffects of the extracts from Ruppia maritima on the u ltrace llu lar structure ofChlore lla vu lgaris
2. 5　川蔓藻的水浸提液对普通小球藻的抑制机理
　　低浓度的川蔓藻水浸提液使小球藻细胞中的丙二
醛含量显著增加 ,同时胞外粗脂含量升高 ,说明对膜的
损坏可能是化感作用所有效应的起点 ,通过电镜观察 ,
叶绿体内的膜系统受到损害 ,继而使膜破裂 ,胞内蛋白
核和淀粉核释放 ,这些物质又使未解体的小球藻表面
疏水性降低 ,最终藻细胞絮凝沉降死亡.
　　目前水生植物对藻类的化感作用机理研究较少.
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研究方法主要是从各种水生植物体中先分离鉴定具有
化感作用的有机化合物 ,然后就这种物质对藻类的影
响研究其抑制机理. 例如从穗花狐尾藻中分离鉴定出
的亲脂性萃取物 Te llim agrand inⅡ主要抑制蓝藻的胞
外酶和光合系统 PSⅡ [ 11] . 就一种植物来说 ,它并不只
含有一种抑藻物质 ,鞣花酸也是从从穗花狐尾藻中分
离鉴定出的克藻物质 [ 12] . M arina等人[ 4]使用石油醚从
烘干的川蔓藻植株体中分离提取出 7种 ent-labdane
diterpenes物质 ,其中有 2种物质具有显著的克藻效
应.本文研究的川蔓藻水浸提液的克藻效应也非常显
著.用 GC-MS对川蔓藻的水浸提液进行初步检测分
析 ,其中酚酸和羟基酸类物质含量较高 ,还检测到水溶
性较低的酮类和酯类物质. 大多数化感物质具有广谱
性作用机制 ,能够影响生物的许多生理生化过程.例如
酚酸物质和萜类物质都能改变膜的透性 ,抑制植物对
养分的吸收 [ 13] .目前研究认为 ,水生植物对藻类主要
的抑制机制是影响藻细胞的细胞膜 、光合作用 、呼吸过
程以及代谢酶的活性.
　　由于植物的化感作用是多种化学物质协同作用的
生物化学复合过程 ,因而要十分清楚地证明作用机理
是比较困难的.一般认为单独某种化合物的抑制作用
较低 ,而混合物则有加合作用[ 14] . 因此使用水生植物
的水浸提液研究化感作用机理更符合实际.
3　结　论
　　(1)川蔓藻的水浸提液对普通小球藻的抑制作用
显著并具有浓度效应. 96 h的抑制率与浸提液浓度的
对数线性相关. 根据浓度-效应关系方程 ,计算出对应
的 96 h的 IC50值 ,换算成以川蔓藻干质量与水的体积
比表示为 6. 332 g(dw) /L.
　　(2)川蔓藻的水浸提液对普通小球藻的抑制首先
是对细胞膜的过氧化作用改变它的通透性 ,破坏光合
系统 ,继而使膜破裂 ,胞内蛋白核和淀粉核释放 ,这些
物质又使未解体的小球藻表面疏水性降低 ,最终藻细
胞絮凝沉降死亡.
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