全 文 ：　
第４０卷　第１１期 　
２０１０年１１月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
ＰＥＲＩＯＤＩＣＡＬ　ＯＦ　ＯＣＥＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＣＨＩＮＡ
４０（１１）：０８５～０８９
Ｎｏｖ．，２０１０
大叶藻全长ｃＤＮＡ文库的构建
＊
刘利民，孔凡娜＊＊，茅云翔，杨　惠
（中国海洋大学海洋生命学院，海洋生物遗传学与基因资源利用教育部重点实验室，山东 青岛２６６００３）
摘　要：　以３种不同盐度处理的大叶藻为材料，采用ＲＮＡ转录本５’末端转换机制（ＳＭＡＲＴ）构建了大叶藻叶片全长
ｃＤＮＡ文库，原始文库滴度为８．６７５×１０６ｐｆｕ／ｍＬ，重组率为９７．１９％，插入片段平均长度大于８００ｂｐ，扩增后的文库滴度达
到１．０３×１０９ｐｆｕ／ｍＬ。将部分原始λ噬菌体ｃＤＮＡ文库转化成质粒ｃＤＮＡ文库，ＰＣＲ检测结果显示文库插入片段集中在
７５０～２　０００ｂｐ之间。随机选取２０个单克隆进行测序，其中１３条序列包含完整的开放阅读框。结果表明所构建文库容量
大，全长比例高，为深入开展大叶藻功能基因研究奠定了基础。
关键词：　大叶藻；全长ｃＤＮＡ文库；耐盐基因
中图法分类号：　Ｑ９４８．８　　　　　文献标志码：　Ａ　　　　　文章编号：　１６７２－５１７４（２０１０）１１－０８５－０５
　　大叶藻（Ｚ．ｍａｒｉｎａ）是海生单子叶植物，分类上属
于沼生目（Ｈｅｌｏｂｉａｅ）、眼子菜科（Ｐｏｔａｍｏｇｅｔｏｎａｃｅａｅ）、
大叶藻属（Ｚｏｓｔｅｒａ），生长于低潮带和潮下带浅海区，是
北半球沿海分布最广泛的一类海草，我国主要分布在
辽宁、河北、山东地区。大叶藻具有完整的根、茎、叶分
化，能够在海洋中沉水生活并完成种子的萌发，开花和
结实。大叶藻生活于海水中，在长期的进化过程中形成
了１套特殊的耐盐机制，而这一特殊的机制决定于其特
殊的分子遗传基础即基因资源。目前，从生理水平和分
子水平对陆生植物耐盐机制已开展了广泛深入的研究，
但很少涉及到沉水盐生植物。因此，全面了解大叶藻基
因资源，将为阐释沉水盐生植物的抗盐机制，培育抗盐
性稳定持久的作物新品种提供理论与实践的基础。
对于真核生物而言，ｍＲＮＡ是其遗传信息表达的
载体，而ｃＤＮＡ文库则是特定时空条件下生物体基因
信息的１种储存方式，因此，构建容量大、全长基因比
例高的ｃＤＮＡ文库不仅可以高效率获得全长基因，而
且可以为利用表达序列标签 （Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔａｇｓ，ＥＳＴｓ）技术分析功能基因组学特性提供条件。
目前，获取基因全长ｃＤＮＡ文库的技术主要包括：Ｏｌｉ－
ｇｏ－ｃａｐｐｉｎｇ技术、ＣＡＰｔｕｒｅ技术、ＣＡＰ－ｔｒａｐｐｅｒ技术、
ＣＡＰ－Ｓｅｌｅｃｔ技术、ＣＡＰ－ｊｕｍｐｉｎｇ技术和ＳＭＡＲＴ技术
等［１－４］。比较而言，ＳＭＡＲＴ技术更快速、简便，而且集
成性好。本研究采用ＳＭＡＲＴ技术，以３种盐度下培
养的大叶藻为材料，构建了大叶藻叶片的全长ｃＤＮＡ
文库，为筛选大叶藻耐盐基因和系统研究大叶藻功能
基因组特性奠定了基础。
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１实验材料　　大叶藻实验样品采自威海俚岛海
岸。首先在室内以海水素（海大通用海水素厂）配制的
人工海水暂养５ｄ，然后分别设置不同盐度实验组，盐
度分别为０，３０，４５，其它培养条件均相同：温度（１５±１）
℃，光照强度１２５μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１，光暗周期１２Ｌ∶
１２Ｄ，２４ｈ通气。实验开始后分别在０．５，１，３，６，９，１２，
２４，４８和７２ｈ取样，清洗干净后投入液氮保存。
１．１．２试剂　　Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｎｇｅｎ公
司，ｍＲＮＡ纯化试剂盒 Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｍＲＮＡ　ｍｉｎｉｋｉｔ购自
德国 Ｑｉａｇｅｎ公司，ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｋｉｔ购自
美国 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，噬菌体蛋白包装试剂盒 Ｍａｘ－
ＰｌａｘＴＭＬａｍｂｄａ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ购自 Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ公
司，其它生化试剂均为国产分析纯。
ｃＤＮＡ文库构建所涉及的引物均由ＳＭＡＲＴＴＭ
ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｋｉｔ提供（见表１）。
１．２方法
１．２．１总ＲＮＡ提取与ｍＲＮＡ纯化　　将同一盐度组
的样品等量混合后液氮研磨破碎，采用改进的 Ｔｒｉｚｏｌ
法分别提取叶片总ＲＮＡ，操作温度始终保持在４℃左
右，在Ｔｒｉｚｏｌ处理后的第一步进行离心以避免基因组
ＤＮＡ的污染。使用紫外分光光度仪检测其浓度和纯
度，并用１％琼脂糖凝胶电泳检测。
＊
＊＊
基金项目：高等学校博士点专项科研基金新教师课题（２００７０４２３０２７）；山东省自然科学基金项目（Ｑ２００７Ｅ０２）；海洋公益性行业科研专项项目
（２００８０５０７５）资助
收稿日期：２００９－０９－２３；修订日期：２００９－１０－２６
作者简介：刘利民（１９８６－），女，硕士。
通讯作者：Ｅｍａｉｌ：ｆｎｋｏｎｇ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　０年
将不同盐度处理的大叶藻叶片总ＲＮＡ等量混合，
按照Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｍＲＮＡ　ｍｉｎｉｋｉｔ的操作流程进行ｍＲＮＡ
纯化。紫外分光光度计检测ｍＲＮＡ的浓度和纯度。
表１　ｃＤＮＡ文库构建所涉及的引物
Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ
名称 Ｎａｍｅ 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＳＭＡＲＴ　ＩＶ　Ｏｌｉｇｏｎｕ－
ｃｌｅｏｔｉｄｅ
５’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－
ＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＧＣＣＧＧＧ －３’
ＣＤＳⅢ／３’ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ
５’－ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡ－
ＣＡＴＧ－ｄ（Ｔ）３０Ｎ－１Ｎ－３’，Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，ｏｒ
Ｔ；Ｎ－１＝Ａ，Ｇ，ｏｒ　Ｃ
５’ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ ５
’－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ－
３’
５’－ｐＴｒｉｐＩＥ × ２ Ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ： ５
’－ＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＡＧＣ－３’
３’－ｐＴｒｉｐＩＥ × ２ Ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ
５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ－
３’
１．２．２噬菌体文库的构建　　根据ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ
ｌｉｂｒａｒｙ试剂盒操作流程进行噬菌体文库的构建，步骤
主要包括双链ｃＤＮＡ的合成，蛋白酶Ｋ消化及ＳｆｉⅠ
酶切，ｃＤＮＡ的分级分离，载体的连接。噬菌体蛋白包
装根据 ＭａｘＰｌａｘＴＭＬａｍｂｄａ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｅｘｔｒａｃｔ试剂盒
操作流程进行。最后对构建成的噬菌体文库进行滴度
和重组率的测定，并进行ｃＤＮＡ文库的扩增。其中，在
进行双链ｃＤＮＡ的合成时，采用ＬＤ－ＰＣＲ的方法，循
环数为１８个循环。
１．２．３质粒文库的转化　　噬菌体λＴｒｉｐＩＥ×２载体能
够在ＢＭ２５．８菌株中环化成质粒ｐＴｒｉｐＩＥ×２载体，将
原始噬菌体文库与ＢＭ２５．８感受态细胞静止培养２０
ｍｉｎ，加入ＬＢ液体培养基继续培养３０ｍｉｎ，涂板（ＬＢ／
Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ），３１℃过夜培养，挑取单克隆保存。
１．３全长ｃＤＮＡ文库的测序
从构建的ｃＤＮＡ文库中随机挑取２０个单克隆，送
上海美季生物公司利用ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７３０Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎ－
ａｌｙｚｅｒ进行３’末端测序。采用生物信息学相关软件进
行相关序列的分析及功能预测。
２　结果
２．１总ＲＮＡ的提取及ｍＲＮＡ的纯化
制备的３种盐度（０，３０，４５）大叶藻叶片的总
ＲＮＡ，经紫外分光光度计测定 ＯＤ２６０／ＯＤ２８０分别为
２．０５，１．９７，２．０５，表明ＲＮＡ纯度较高。琼脂糖凝胶电
泳显示，５．８，１８和２８ｓ条带清晰，ＲＮＡ完整性较好，无
降解，同时没有明显的基因组ＤＮＡ污染（见图１）。
分别取３种盐度处理样品的总ＲＮＡ等量混合，纯
化得到２．１６μｇ　ｍＲＮＡ。紫外分光光度计检测ＯＤ２６０／
ＯＤ２８０＝２．０４，说明 ｍＲＮＡ纯度和完整性较好，可以用
于文库的构建。
１．０盐度处理的大叶藻叶片；２．３０盐度处理的大叶藻叶片；３．４５
盐度处理的大叶藻叶片。
图１　不同盐度处理的大叶藻叶片总ＲＮＡ电泳检测
Ｆｉｇ．１　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍＺ．ｍａｒｉｎａｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉｔｉｅｓ
２．２双链ｃＤＮＡ合成和ｃＤＮＡ分级分离
取１μｇ　ｍＲＮＡ进行一链ｃＤＮＡ合成后，采用ＬＤ－
ＰＣＲ进行二链ｃＤＮＡ合成。琼脂糖凝胶电泳检测显
示，电泳带呈弥散（ｓｍｅａｒ）状且集中分布在０．５～
２．０ｋｂ之间，无明显特异条带（见图２）。说明双链
ｃＤＮＡ合成质量较好，可以满足ｃＤＮＡ文库构建的要求。
１．双链ｃＤＮＡ；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ．
图２　ＬＤ－ＰＣＲ　ｃＤＮＡ电泳检测
Ｆｉｇ．２　ＬＤ－ＰＣＲ　ｃＤＮＡ
１～１７：各级收集物编号；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ．
图３　ｃＤＮＡ经ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ－４００柱的分级产物
Ｆｉｇ．３　ｃＤＮＡ　ｆｒａｃｔｒｉｏｎ　ｂｙ　ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ－４００
高质量ｃＤＮＡ文库的构建，必须有效去除小片段
的ｃＤＮＡ。本实验采用 ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ－４００柱进行
ｃＤＮＡ分级分离。琼脂糖凝胶电泳检测显示，在１７个
收集管中，从第６管开始出现条带。因此，本实验收集
并合并了第６、７、８管中的ｃＤＮＡ用于连接转化，片段
６８
１１期 刘利民，等：大叶藻全长ｃＤＮＡ文库的构建
长度集中在５００ｂｐ以上（见图３）。
２．３文库构建及质量检测
将ｃＤＮＡ片段与载体连接，蛋白包装后，进行滴度
测定。结果表明原始文库的滴度为８．６７５×１０６　ｐｆｕ／
ｍＬ，５７０ 个噬菌斑中有 １６ 个蓝斑，重组率达 到
９７．１９％；扩增后文库滴度为１．０３×１０９　ｐｆｕ／ｍＬ。随机
选取５０个噬菌斑对重组克隆插入片段大小进行检测，
ＰＣＲ鉴定显示片段大小都在５００ｂｐ以上，集中分布在
０．７５～２．０ｋｂ之间，平均插入长度８０１ｂｐ（除去载体
１９０ｂｐ）（见图４）。
１～１７：随机挑取的１７个噬菌斑；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ．
图４　ｃＤＮＡ文库插入片段大小检测
Ｆｉｇ．４　Ｓｉｚｅｓ　ｏｆ　ｉｎｓｅｒｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ
２．４质粒ｃＤＮＡ文库的转化
为便于后续大规模测序，将部分噬菌体ｃＤＮＡ文
库转化成质粒ｃＤＮＡ文库备用，并用ｐＴｒｉｐｌ　Ｅ×２质粒
上提供的检测引物进行ＰＣＲ检测转化率和插入片段
大小。在随机检测的５０个单克隆中，转化率达１００％，
插入片段大小符合扩增文库插入片段大小范围。说明
噬菌体ｃＤＮＡ文库成功的转化成质粒ｃＤＮＡ文库（见
图５）。
１～１７：质粒ＰＣＲ产物；Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｋｅｒ．
图５　质粒ｃＤＮＡ文库ＰＣＲ检测结果
Ｆｉｇ．５　Ｄｅｔｅｃｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ
２．６全长ｃＤＮＡ比例与序列分析
利用ＤＮＡＭＡＮ、ＧｅｎｅＳｃａｎ等软件对２０个随机单
克隆测序结果进行分析，发现其中１３条序列包含完整
的ＯＲＦ，７条序列为３’端ＥＳＴ，文库全长比率为６５％；
ＮＣＢＩ　Ｂｌａｓｔ比对显示，１６条序列与已知物种的基因具
有较高的相似性（见表２）。其中克隆ＺＭ１、克隆ＺＭ２、
克隆ＺＭ６在其它物种中已被证明与耐盐相关，从而为
再大叶藻中进一步验证其功能提供了序列信息。
表２　２０个文库随机单克隆测序结果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　２０ｃｌｏｎｅｓ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ
克隆编号
Ｓａｍｐｌｅ　Ｎｏ
序列长度
Ｌｅｎｇｔｈ／ｂｐ
基因功能注释
Ｇｅｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
物种
Ｏｒｇａｎｉｓｍ
Ｅ值
Ｅ　ｖａｌｕｅ
是否全长
Ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ
ＺＭ１　 １２４２ Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　 Ｃａｒｉｃａ　ｐａｐａｙａ １Ｅ－１４５ 是
ＺＭ２　 ４９２ ＳＴ６－４０　 Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ　ｈａｌｏｐｈｉｌａ　 ５ｅ－３３ 是
ＺＭ４　 ７５２ ＦＫＢＰ－ｔｙｐｅ　ｐｅｔｉｄｙｌ－ｐｒｏｌｙｌ　ｃｒｉ－ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ， Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｔｈａｌｉａｎａ　 ３Ｅ－２４ 否
ＺＭ６　 ７９５ ｃｈｒｏｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌ　ａ／ｂ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｐａｃｈｙｓａｎｄｒａ　ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ　 ４Ｅ－１２５ 是
ＺＭ１０　 ９８０ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ２Ｅ－１７ 是
ＺＭ１４　 ７４１ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＮＹ－ＢＲ－８４　 Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　 １Ｅ－７３ 否
ＺＭ１６　 ９５５
Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ　ａｎｄ
ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＭＡＰＥＧ）ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｏｒｇｈｕｍ　ｂｉｃｏｌｏｒ　 ５Ｅ－４３ 否
ＺＭ１７　 ７４０ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＯＲＢＩＤＲＡＦＴ＿０７ｇ０２６１１０　 Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ　 ２Ｅ－７８ 否
ＺＭ１８　 ９７３ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＰＭＰ２２　 Ｚｅａ　ｍａｙｓ　 ２Ｅ－６２ 是
ＺＭ２０　 ７５３ ＮＤＲ１／ＨＩＮ１－Ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２　 Ｚ．ｍａｙｓ　 ２Ｅ－２０ 是
ＺＭ２１　 ２８５ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ　ｌｉｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　 １Ｅ－４５ 是
ＺＭ２２　 ４１７ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ　ＩＩ　１０ｋＤａ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ＰｓｂＲ　 Ｐ．ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ４Ｅ－４６ 是
ＺＭ２３　 １０５９ ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　 Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ　 ２Ｅ－１０８ 是
ＺＭ２５　 ７３４ ｕｎｋｎｏｗｎ　 Ｐｉｃｅａ　ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ　 ２Ｅ－７９ 否
０ＺＭ２６　 ８９１ Ａｃｉｄｉｃ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ　 Ｖｉｇｎａ　ａｎｇｕｌａｒｉｓ　 １Ｅ－９０ 是
ＺＭ２８　 ４０８ Ｈｉｓｔｏｎｅ　２　 Ｖ．ｖｉｎｉｆｅｒａ　 １Ｅ－３７ 是
ＺＭ２９　 ８４０ ｃａｔａｌｙｔｉｃ／ｒｉｂｕｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　３－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ　 Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ　 ２Ｅ－１２１ 是
ＺＭ３２　 ７３４ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ７Ａｅ／Ｌ３０ｅ／Ｓ１２ｅ／Ｇａｄｄ４５ｆａｍｉｌｙ　 Ｏ．ｓａｔｉｖａ　 ２Ｅ－９５ 否
ＺＭ３４　 ６８０ Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ／ｂｅｎｚｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　 ２Ｅ－３９ 否
ＺＭ３５　 ６２１　 ６０Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ　 ３Ｅ－７５ 是
７８
中　国　海　洋　大　学　学　报 ２　０　１　０年
３　讨论
ＲＮＡ质量是构建高质量ｃＤＮＡ文库的关键。大
叶藻含有大量的酚类化合物，容易被氧化成奎宁化合
物，并与核酸结合影响ＲＮＡ的质量。Ａｌｅｍｚａｄｅｈ等［５］
人发现，低温条件下（４℃）酚类化合物不容易与核酸
反应，在离心时就可被除去。因此，在整个实验过程
中，操作温度始终保持处于４℃左右，有效地防止了酚
类化合物的氧化；并在Ｔｒｉｚｏｌ处理后的第一步就离心，
从而去除了酚类物质得到高质量的总ＲＮＡ。
ＳＭＡＲＴＴＭｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ试剂盒中提供了２种二
链ｃＤＮＡ合成的方法，即ＬＤ－ＰＣＲ和ｐｒｉｍｅｒ延伸法。
两者的区别主要在于，前者可以使用较少的起始材料
（只需５０ｎｇ总ＲＮＡ），但ＰＣＲ循环数较多，循环数的
增加有可能增加单克隆的重复；相比较而言，ｐｒｉｍｅｒ延
伸法需要的起始材料较多（需要 １μｇ的 ＰｏｌｙＡ
＋
ＲＮＡ）。本研究中比较了ＬＤ－ＰＣＲ和ｐｒｉｍｅｒ延伸法２
种方法对二链ｃＤＮＡ合成的影响，结果表明采用ｐｒｉｍ－
ｅｒ延伸法得到的ｃＤＮＡ量少，不能满足后续实验的需
要（数据未给出）；而采用ＬＤ－ＰＣＲ方法，并将ＰＣＲ循
环数控制在１８个，能够获得足够量的高质量ｃＤＮＡ。
本研究中，来源于原始文库的５０个随机挑取的噬菌
斑，ＰＣＲ扩增产生的片段长度均不一致，证明了原始文
库中冗余克隆数较少；而随机挑取的２０个单克隆，测
序发现其中１３条为全长基因，表明了ｃＤＮＡ合成的完
整性。因此，ＬＤ－ＰＣＲ法适合于大叶藻ｃＤＮＡ文库构
建。
加强耐盐植物耐盐基因的发掘有助于全面了解其
耐盐机制。ｃＤＮＡ文库测序获得大量的ＥＳＴ序列是
认识耐盐基因的重要方法，而全长ｃＤＮＡ文库不仅能
够提供大量的基因信息，更有利于加强对基因的启动
子区、转录调控分析、参与的生化过程及编码蛋白三维
结构等信息的了解。目前全长ｃＤＮＡ文库在植物耐盐
基因研究中广泛应用［６－１１］。Ｚｏｕａｒｉ等［１２］构建了盐生植
物獐茅（Ａｉｌｕｒｏｐｕｓ　ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）根的全长ｃＤＮＡ文库，获
得了在根部特异表达的耐盐基因；Ｉｎａｄａ等［１３］从羊草
（Ａｎｅｕｒｏｌｅｐｉｄｉｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ）的全长ｃＤＮＡ文库中筛出
了盐胁迫的环境下在根部起着调节Ｎａ＋／Ｋ＋离子运输
重要作用的ＡｃＰＭＰ３基因全长；Ｗａｎｇ等［１４］人构建了
盐胁迫下的紫杆柽柳（Ｔａｍａｒｉｘ　ａｎｄｒｏｓｓｏｗｉｉ）全长ｃＤ－
ＮＡ文库，发现了约４００个与耐盐相关的候选基因，占
总ＥＳＴｓ的１６％。Ｔａｊｉ等［１５］构建了不同胁迫条件（盐
度、温度、脱落酸）下盐芥（Ｔ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ）的全长ｃＤＮＡ
文库，并将盐芥的耐盐基因与模式植物拟南芥进行了
比较。
相对于陆生耐盐植物而言，大叶藻不仅仅只有根
部处在盐胁迫状态，其植株整体均处在高盐度条件下，
并在此条件下完成了开花，结果和萌发的整个生活史。
本研究选择大叶藻叶片作为研究的起始材料，构建其
全长ｃＤＮＡ文库。尽管仅选择２０个克隆进行了测序
分析，但已经发现了多个与盐调节相关基因。克隆
ＺＭ１为钙网织蛋白编码基因，该蛋白位于植物细胞质
膜上是一种重要的钙结合蛋白。Ｌｉ等［１６］通过对３种
拟南芥突变体的研究发现，钙网织蛋白在植物耐盐机
制中起着非常重要的作用。ＳＴ６－４０是Ｄｕ等［１８］在研
究盐芥中耐盐基因时发现的新基因，克隆ＺＭ２序列与
其相似度较高。刘贤德等［１９］在研究杜氏盐藻光合结构
时发现，叶绿素ａ／ｂ结合蛋白（ＬＨＣＰ）会随着盐度改
变而变化，从而调节光合效率。克隆ＺＭ６与ＬＨＣＰ的
相似度高，有可能在大叶藻中起到了调节光合效率以
适应盐度变化的作用。此外，还发现了与抗病密切相
关几丁质酶基因、与合成代谢密切相关的磷酸核酮糖３
－异构酶基因等多个功能基因。以本研究所构建的全
长ｃＤＮＡ文库为基础，进行规模化的表达序列标签分
析，将能够初步揭示大叶藻耐受盐度胁迫的分子基础，
为阐释大叶藻的盐度耐受机制提供理论依据，也将为
农作物耐盐型品种的开发提供重要的基因资源。
参考文献：
［１］　童志敏，张宝石，关荣霞．等．全长ｃＤＮＡ文库的构建方法 ［Ｊ］．
中国农学通报，２００６，２２（２）：５１－５５．
［２］　毛新国，景蕊莲，赵光耀．等．几种全长ｃＤＮＡ文库构建方法比较
［Ｊ］．遗传，２００６，２８（７）：８６５－８７３．
［３］　Ｓｅｋｉ　Ｍ，Ｃａｒｎｉｎｃｉ　Ｐ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｃｌｏｎｉｎｇ
ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｂｙ　ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＣＡＰ　ｔｒａｐｐｅｒ［Ｊ］．
Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，１５（５），７０７－７２．
［４］　许兰珍，何永睿，姜国金．等．ｃＤＮＡ文库构建及其在植物抗性研
究中的应用 ［Ｊ］．安徽农业科学，２００７，３５（３）：６６０－６６２，６６４．
［５］　Ａｌｅｍｚａｄｅｈ　Ａ，Ｆｕｊｉｅ　Ｍ，Ｕｓａｍｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ
ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　ｈｉｇｈ－ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｅｅｌｇｒａｓｓ（Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ　Ｌ．）
ｂｙ　ｋｅｅｐｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｌｏｗ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔ－
ｅｒ，２００５，２３：４２１ａ－４２１ｈ．
［６］　李钢，刘敏，蒋彦．等．盐生杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ　ｓａｌｉｎａ）ｃＤＮＡ文
库构建及功能基因筛选 ［Ｊ］．热带亚热带植物学报．２００４，１２（１）：
７４－７８
［７］　王玉成，杨传平，刘桂丰．紫杆柽柳ｃＤＮＡ文库构建与硫氧还蛋
白基因的克隆 ［Ｊ］．分子植物育种．２００４，２（５）：６６７－６７３．
［８］　秘彩莉，郭光艳，齐志广，等．小麦苗期盐胁迫７２ｈｃＤＮＡ文库的
构建及质量检测 ［Ｊ］．河北师范大学学报：自然科学版．２００６，３０
（５）：５８５－５８８．
［９］　朱馨蕾，马艳，张富春．盐胁迫下胡杨ｃＤＮＡ文库的构建及其ｎｈｘ
基因的克隆 ［Ｊ］．植物研究．２００７，２７（１）：８２－８８．
［１０］　Ｇａｏ　Ｃ　Ｑ，Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｃ，Ｌｉｕ　Ｇ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ｓａ－
ｌｉｎｉｔｙ－ａｌｋａｌｉ　ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｂｙ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｔａｍａｒｉｘ　ｈｉｓｐｉｄ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏ，２００８，６６：２４５－
２５８．
８８
１１期 刘利民，等：大叶藻全长ｃＤＮＡ文库的构建
［１１］　Ａｂｂａｓ　Ａ，Ｆｕｊｉｅ　Ｍ，Ｕｓａｍｉ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．ＺＭＶＨＡ－Ｂ１，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ
ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｂ　ｏｆ　ｖａｃｕｏｌａｒ　Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｅｅｌｇｒａｓｓ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａ－
ｒｉｎａ　Ｌ．ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｅｐｌａｃｅ　ｖｍａ２ｉｎ　ａ　ｙｅａｓｔ　ｎｕｌ　ｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ－
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００６，１０２（５）：３９０－３９５．
［１２］　Ｚｏｕａｒｉ　Ｎ，Ｓａａｄ　Ｒ　Ｂ，Ｌｅｇａｖｒｅ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎ－
ｃｉｎｇ　ｏｆ　ＥＳＴｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈａｌｏｐｈｙｔｅ　ｇｒａｓｓ　Ａｅｌｕｒｏｐｕｓ　ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ［Ｊ］．
Ｇｅｎｅ，２００７，４０４：６１－６９．
［１３］　Ｉｎａｄａ　Ｍ，Ｕｅｄａ　Ａ，Ｗｅｉｍｉｎｇ　Ｓｈｉ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐａｓｍａ
ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３（ＡｃＰＭＰ３）ｉｎ　ａ　ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ　ｈａｌｏ－
ｐｈｙｔｅ，Ａｎｅｕｒｏｌｅｐｉｄｉｕｍ　ｃｈｉｎｅｎｓｅ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｃｅｌｕｌａｒ　Ｎａ＋ａｎｄ　Ｋ＋
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２０：３９５－４０２．
［１４］　Ｗａｎｇ　Ｙ　Ｃ，Ｙａｎｇ　Ｃ　Ｐ，Ｌｉｕ　Ｇ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｔａｍａｒｉｘ　ａｎｄｒｏｓ－
ｓｏｗｉｉ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，１７０：２８－３６．
［１５］　Ｔａｊｉ　Ｔ，Ｓａｋｕｒａｉ　Ｔ，Ｍｏｃｈｉｄａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｃｏｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ
ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｈａｌｏｐｈｙｔｅ，
Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ　ｈａｌｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８：１１５．
［１６］　Ｌｉ　Ｚ　Ｇ，Ｃａｏ　Ｙ　Ｒ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａｎｄ　ｓａｌｉｎｉｔｙ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，１８：１２１９－１２２４．
［１７］　Ｄｕ　Ｊ，Ｈｕａｎｇ　Ｙ　Ｐ，Ｘｉ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃｇｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｅ－ｍｉｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｓａｌｔ－
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｏｗｅｒ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ
Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，５８：６５３－６６４．
［１８］　刘贤德，沈允钢．低渗胁迫导致杜氏盐藻光合机构向Ⅰ状态转换
［Ｊ］．科学通报，２００４，４９（３）：２３４－２３７．
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ａ　Ｆｕｌ－Ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ
ＬＩＵ　Ｌｉ－Ｍｉｎ，ＫＯＮＧ　Ｆａｎ－Ｎａ，ＭＡＯ　Ｙｕｎ－Ｘｉａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｈｕｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｏｃｅａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｌｉｎｉ－
ｔｉｅｓ，ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ａｄｏｐｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｔ　５＇ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＳＭＡＲＴ）．
Ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｗｅｒｅ　８．６７５×１０６ｐｆｕ／ｍＬ　ａｎｄ　１．０３×１０９
ｐｆｕ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗａｓ　９７．１９％ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｉｎ－
ｓｅｒｔｅｄ　ｃＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　８００ｂｐ．Ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙλｐｈａｇｅ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｗａｓ　ｐａｒｔｉａｌｙ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｉｎｔｏ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ．Ｆｉｆｔｙ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｃＤ－
ＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｗａｓ　ａｒｏｕｎｄ　７５０—２　０００ｂｐ．Ｔｗｅｎｔｙ　ｒａｎ－
ｄｏｍｌｙ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｉｒｔｅｅｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ　ＯＲＦ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｈａｄ　ａ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｓ　ａｎｄ　ａ　ｈｉｇｈ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌ　ｌａｙ
ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｚ．ｍａｒｉｎａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｚｏｓｔｅｒａ　ｍａｒｉｎａ；ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ；ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ
责任编辑　于　卫
９８