全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Ag r. Sci. ), 2005, 21(2):109～ 112
播娘蒿角果全长 cDNA文库的构建与分析
董海滨 , 　管荣展 , 　姜淑慧 , 　张红生
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 江苏 南京 210095)
收稿日期:2004-11-08
基金项目:国家自然科学基金项目(30370902)
作者简介:董海滨(1978-),男 ,山西运城人 ,硕士研究生 ,主要从事油
菜分子生物学研究。
通讯作者:管荣展 , (E-m ail)gu anrzh@ n jau. edu. cn
　　摘要:　以播娘蒿成熟期角果为材料 , 采用 SMART技术构建了其全长 cDNA文库。 该文库的原始滴度为
1. 49×106 pfu /m l, 重组率为 91. 42%,扩增后文库滴度为 1.15×109 pfu /m l, 随机挑取 10个噬菌斑 , PCR扩增插入
片段 , 其长度为 800 ～ 2 000 bp,表明所构建的文库达到了目的基因分离和克隆的要求。
关键词:　播娘蒿;角果;SMART技术;全长 cDNA文库
中图分类号:　S565. 903.53　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2005)02-0109-04
Construction of Full-length cDNA L ibrary ofDescura inia sophia Silique
DONG Ha i-bin, 　GUAN Rong-zhan, 　JIANG Shu-hu i, 　ZHANG Hong-sheng
(Na tina lKey Lab of Crop Genetics and Germpa lsm Enhancem en t, Nan jing Ag ricu lturalU niversity, Nan jing 210095, Ch ina)
　　Abstrac t:　By using SMARTTM techno logy, a full-leng th cDNA libra ry ofDescurainia soph ia siliquew as constructed.
The results ind ica ted the tite r o f the unamp lified cDNA lib ra ryw as about 1. 49×106 pfu /m l and the recom binant rate o f the
library w as 91. 4%, the titer o f the am plified library w as 1. 15×109 pfu /m .l Ten clones from the library w ere cho sen ran-
dom ly for sc reening cDNA inserts by using PCR. The leng th of inse rtion fragm en ts ranged from 800 bp to 2 000 bp, which
indica ted that the cDNA library w as o f h igh quality fo r clon ing ta rge t gene s.
K ey words:　D escurainia sophia (S ilique); silique;SMART technology; full-leng th cDNA library
　　播娘蒿是十字花科播娘蒿属野生植物 ,其 α-亚
麻酸含量高达 40%。此脂肪酸是人体必需的脂肪
酸 ,具有降血脂 、补脑 、抗癌等作用[ 1] 。同时 ,播娘
蒿具有耐寒 、耐旱 、耐盐碱的特点 [ 2] 。开发和利用
播娘蒿的优异基因对于改良农作物的品质和抗逆性
具有重要意义。本研究拟进行播娘蒿 cDNA文库的
构建 ,为利用播娘蒿的优异基因奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
材料为室外盆栽播娘蒿成熟期角果 。隔天取
样 ,液氮冷冻后于 - 80 ℃冰箱保存备用。
使用清华天为时代公司提供的 Trizo l试剂和植
物总 RNA提取试剂盒 RNApure提取总 RNA;使用
Q iagen公司生产的试剂盒 O ligotexmRNA m in ik it分
离纯化 mRNA;使用 C lontech公司生产的 SMARTTM
cDNA文库构建试剂盒构建 cDNA文库;使用 S tra ta-
gene公司生产的噬菌体包装蛋白 (G igapachⅢ go ld
packag ing extrac t)包装噬菌体;试验中的其它试剂均
购自南京生兴生物技术有限公司 。
1.2　方法
1.2.1　总 RNA提取　从超低温冰箱取出角果 ,置
于研钵 ,加液氮研磨至细粉状 ,挑取约 0.1 g粉末 ,
加入 RNA提取缓冲液 ,按试剂盒操作手册提取总
RNA。 1.1%的琼脂糖凝胶电泳 ,检测 RNA完整性 ,
用核酸分析仪测量 230 nm、 260 nm及 280 nm处的
OD值 ,检测 RNA纯度和得率。
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1.2.2　mRNA分离纯化　使用 Q iagen公司生产的
试剂盒 O ligo tex mRNA m ini kit分离纯化 mRNA ,严
格按照操作要求完成 。在收集到的 mRNA中 ,加入
占总体积 1 /10的乙酸钠 (3mo l /L, pH5.2)与 2倍
体积的无水乙醇 ,沉淀 mRNA ,用 6μlDEPC-H2O溶
解 。电泳检测 mRNA。
1.2.3　 cDNA 文库构建 　取 3μl mRNA (约
0.5μg)反转录成 cDNA第一链 , 经 LD-PCR合成
双链 cDNA , PCR循环次数为 23次 。双链 cDNA经
蛋白酶 K消化 、 S fiⅠ酶切 、 层析柱纯化 (CHRO-
MA SPIN 400), 收集大于 500 bp的 cDNA片段 。再
与经 SfiⅠ酶切去磷酸化载体 λT riplEx2在 16℃下
连接过夜。为了确定最佳连接效率 , 在载体浓度不
变的情况下 , 设 3个连接反应 , 连接产物最后分别
进行体外包装。
1.2.4　文库原始滴度及重组率测定　以不同比例
稀释原始文库 ,取 1μl稀释液加入到 200μl过夜
培养的 XL1-B lue菌液中 , 37 ℃温育 15 m in后加入
2 m l 45 ℃预热的 LB M/ gSO 4顶层琼脂 , 混匀倒在
LB M/ gSO 4平板上 ,快速摇动平板使顶层琼脂均匀
分布 ,凝固后于37℃倒置培养 6 ～ 18 h,定期检查确
保噬菌斑生长 ,统计噬菌斑数 ,计算滴度。除在铺平
板之 前于 顶层培 养基 中加 入 50 μl 的 IPTG
(200mg /m l)和 X-gal(20mg /m l)外 ,其余步骤同上
述文库滴定方法 ,统计蓝白斑数 ,估计重组率。
1.2.5　文库扩增和滴度测定　取 10 μl原始文库 ,
以每板 6×104噬菌体形成单位在150mm平皿上铺
平板。待噬菌体生长融合后 , 加入稀释缓冲液 ,
4 ℃过夜。第二天摇床洗脱 1 h , 收集噬菌体洗脱
液 , 加入氯仿 , 离心 , 收集上清液。取 10μl上清
液稀释 1×104倍 , 分别取5 μl、 10 μl、 20μl测定
扩增文库的滴度 。
1.2.6　插入片段大小检测 　随机挑取 10个噬菌
斑 ,连同琼脂放入 200μl稀释缓冲液中 , 37 ℃温育
1 h, 4℃过夜 ,然后进行 PCR检测 。程序是在 PCR
管中加入 2μl洗脱液 , 5μl 10×PCR buffer, 1.5 μl
2 mmo l /L dNTP, 5′端测序引物 (20 μmo l /L)和 3′端
测序引物 (20μmol /L)各 1μl、1 μl Taq DNA聚合
酶 ,加去离子水使总体积达 50 μl, 94℃, 预变性
3 m in ,再 94℃ 50 s、58 ℃ 90 s、72 ℃ 2m in, 30个
循环 , 72℃ 10 m in。 PCR结束后 ,电泳检测片段大
小 。
2　结　果
2.1　总 RNA的提取和 mRNA分离
用 Trizo l试剂提取播娘蒿角果总 RNA ,电泳检
测发现 28S rRNA和 18S rRNA附近还有弥散的条
带 ,表明有降解 ,而且含有糖 、盐 、胍等小分子污染。
采用 RNApure试剂盒提取播娘蒿角果总 RNA的电
泳结果(图 1),可见 28S rRNA和 18S rRNA条带清
晰 ,且 28S rRNA条带亮度约为 18S rRNA条带的 2
倍 ,无拖尾现象 。用 3 μl RNA稀释 50倍后经核酸
分析仪检测 , 得 230 nm、260 nm、280 nm处的读数 ,
计 算 OD260 /OD280、 OD260 /OD230 比 值 。 RNA 的
OD260 /OD280为 1.87,说明没有 DNA、蛋白或酚污染;
而 OD260 /OD230为 2.30,说明没有糖 、胍等小分子污
染。因此 ,提取的总 RNA没有降解 ,纯度较好 ,达到
了建库要求。
图 1　总 RNA的电泳图
F ig. 1　Total RNA electrophoresis
分离得到的 mRNA经乙酸钠与无水乙醇沉淀
后 ,用 6μl无 RNA酶水溶解 , 电泳检测。可以看
出 , mRNA在 400 bp与 5 kb之间呈弥散状 ,且大部分
集中在 600 bp与 2 kb之间(图 2)。
2.2　双链 cDNA合成
用约 0.5μg mRNA作为 cDNA第一条链合成
的模板 ,在 CDSⅢ /3′PCR引物和 SMART Ⅳ寡核苷
酸引物的引导下 ,反转录成第一链 cDNA ,再用 CDS
Ⅲ /3′PCR引物和 5′锚定引物 ,经 LD-PCR, 23个循
环合成双链 cDNA ,经 1.1%的琼脂糖凝胶电泳 (图
3), ds cDNA集中于 400 bp与 2 kb之间 ,整个条带呈
弥散状分布 ,与 mRNA的条带相对应 ,说明不同大
小和不同丰度的 mRNA都得到了有效反转录及扩
增。
110 江 苏 农 业 学 报 　2005年 第 21 卷 第 2期
泳道 1为 mRNA;M为 DL-15 kb。 Lane 1 and M are mRNA, DL-
15 kb respectively.
图 2　mRNA电泳图
F ig. 2　mRNA electrophores is
M为 DL-2000;泳道 1为合成的 d s cDNA。 M and land 1 are DL-
2000 and ds cDNA respect ivelv.
图 3　ds cDNA电泳图
F ig. 3　d s cDNA electrophores is
2.3　文库滴度与重组率
连接反应中 , cDNA与载体分别按 0.5∶1.0、
1.0∶1.0、1.5∶1.0的比例混合 , 16℃连接过夜 。连
接产物包装后 ,以 1∶10的比例稀释 、滴定 ,第二天统
计噬菌斑数并计算滴度。 3个连接的文库滴度分别
为 9.20×105 、1.03×106 、1.30×106 ,说明第三个连
接比例最佳 。进一步 ,将第三个连接产物以不同比
例稀释 ,测定文库滴度和重组率。最终得到原始文
库的滴度为 1.49×106 pfu /m l,重组率为 91.24%。
从稀释的扩增文库中分别取出 5 μl、10 μl和 20 μl
进行滴定 , 其形成噬菌斑数分别为 624、 1 337和
1 682。据此 , 求 得扩 增 文库 滴度 为 1.15 ×
10
9
pfu /m l。文库的滴定结果如图 4所示 。综合以
上测定结果 ,认为该文库的容量可用于分离某一稀
有基因。
图 4　扩增文库的滴定结果(10μl)
F ig. 4　 R esult of titer ing the am plified l ibrary (10μl)
2.4　插入片段大小
从原始文库平板上随机挑取 10个噬菌斑 ,洗
脱 , PCR扩增插入片段 ,扩增产物片段大小经电泳
检测 (图 5)显示 , 10个样中有 3个样的扩增产物接
近 2 kb;2个样小于 1 kb;其余 5个样的插入片段大
小在 1 kb与 2 kb之间 。
M为 DL-2000 marker。 M:DL-2000m arker.
图 5　文库中克隆插入片段大小的 PCR扩增结果
F ig. 5　Ana lys is of length o f inserted fragm ent of clones
3　讨　论
纯度高 、完整性好的 RNA是全长 cDNA文库构
建过程中的关键步骤之一。由于 RNA酶存在于所
有的生物中 ,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境 ,
所以处理 RNA样品时必须仔细小心 [ 3] 。试验中曾
111董海滨等:播娘蒿角果全长 cDNA文库的构建与分析
利用 Trizo l试剂提取播娘蒿角果 RNA , 但在溶解
RNA沉淀时 ,有一部分沉淀呈胶状难溶。分析其原
因 ,播娘蒿角果中 ,可能富含多糖和一些次生代谢
物 ,多糖会形成难溶的胶状物 ,与 RNA一起沉淀下
来;萜类化合物和 RNA酶会造成 RNA的降解 ,因此
用常规方法难以提取 RNA[ 4] 。根据以上情况 ,本研
究采用 RNApure试剂盒成功地提取了其总 RNA。
合成 cDNA第二链时 , PCR扩增循环数的确定
也很关键 。循环数过多 ,容易产生非特异 PCR产
物 ,而循环数过少则产量不足;控制循环次数对基因
在文库中拷贝数的分布也很重要 ,适当的循环次数
可以防止低拷贝数的基因丢失 ,同时也可防止高拷
贝基因过分放大 [ 5] 。本研究在合成 ds cDNA时 ,先
采用较少的循环数 ,再逐渐增加 ,最终确定 ds cDNA
合成的最佳循环数为 23个 。
本研究所获得的 cDNA 文库的原始滴度为
1.49×106 pfu /m l, 重组率为 91.42%,合成的双链
cDNA大小主要集中在 0.4 kb与 2.0 kb之间 ,整个
条带呈弥散状 ,插入片段大部分位于 1.0 kb以上 ,表
明已成功构建了播娘蒿角果的全长 cDNA文库 。
播娘蒿角果全长 cDNA文库的成功构建 ,不仅
为其抗逆性基因的克隆利用奠定了基础 ,而且也为
亚麻酸合成过程中的关键酶基因的克隆和相关研究
提供了保障。本研究还随机选择了 2个克隆将其转
化成质粒 ,测序 ,所得序列经过 BLASTn搜索和同源
性分析 ,结果表明:其中 1个为播娘蒿 60S核糖体蛋
白 L2基因的完整 cDNA序列 ,与拟南芥基因的相似
性高达 97%;另 1个为播娘蒿角果发育全长基因 ,
与拟南芥角果基因的相似性为 90%。这是目前最
早获得的播娘蒿基因序列。
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