全 文 ：利用色谱聚焦和离子交换色谱快速分离分析
薏苡38ku抗真菌蛋白
收稿日期:2006-10-25
基金项目:国家自然科学基金(30471060)
作者简介:刘静(1979-),女,黑龙江人,博士研究生,研究方
向为作物种质资源。
*通讯作者 E-mail:pyh51@yahoo.com.cn
刘 静1,2,赵奎军1,潘映红2*
(1.东北农业大学农学院,哈尔滨 150030;
2.中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程,北京 100081)
摘 要:联合利用色谱聚焦和离子交换色谱对薏苡种子抗真菌蛋白进行了快速分离分析,首次发现一种新的
薏苡抗真菌蛋白。该蛋白经 SDS-PAGE检测相对分子质量在 38左右,利用胶内酶切和 MALDI-TOF-MS完成了肽
谱分析,并进行了数据库搜索。
关键词:薏苡;抗真菌蛋白;色谱聚焦
中图分类号:Q503 文献标识码:A
真菌性病害与农业生产有十分密切的关系,往
往造成农作物在产量和品质上的重大损失,甚至颗
粒无收。植物抗真菌蛋白具有抗菌机制特殊、不易
产生耐药性、安全性高、应用灵活等特点,近年来
一直是研究热点。抗真菌蛋白不仅应用在农业生产
中,在医疗和食品领域同样具有重要价值[1-2]。
薏苡(Coixlacryma-jobiLinn)是一种可供药用
的粮食作物,国内外学者对薏苡的化学成分和药
理活性研究颇多,发现薏苡仁(薏苡干燥成熟种
仁)具有抗肿瘤、降血糖、免疫调节、抗病毒等方
面的活性[3-5]。 色谱聚焦是根据样品等电点(pI)不
同进行分离,完全能够达到和等电聚焦电泳同样
的分离效率[6-7],近年来日益受到蛋白分离工作者
的重视[8-9]。
本文以薏苡种子为试验材料,联合利用色谱
聚焦和离子交换色谱快速分离分析薏苡种子抗真
菌蛋白,首次得到一种相对分子质量在 38左右的
抗真菌蛋白。该蛋白不同于本实验室以往从薏苡
种子中分离得到的抗菌蛋白,通过肽谱分析和数
据库搜索,未找到匹配蛋白。
1 材料与方法
1.1 材料
薏苡种子购于北京超市发中国农业科学院分店。
1.2 主要仪器及试剂
AKTAPurifier10蛋白液相色谱系统、凝胶过
滤色谱柱 HitrapTM desalting(5mL)、色谱聚焦柱
MonoPTMHR5/5(1mL)及 polybufer配套试剂、阳
离子交换色谱柱 HitrapTMSpHp(1mL)和 MonoSTM
HR5/5(1mL)等均为原瑞典 Amersham公司(现美
国GEHealthcare公司)产品。基质辅助激光解吸电
离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)购 于 德 国
Bruker公司。白光扫描仪 UMAXPowerLook1120
ImageScanner购于美国 Microtek公司。Mini垂直
蛋白电泳仪购于美国Bio-Rad公司。色谱纯乙腈购
于美国FisherScientific公司。三氟乙酸(TFA)购于
德国 Merck公司。测序级胰蛋白酶购于美国
Promega公司。α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为德
国 Bruker公 司 随 质 谱 仪 提 供 。 实 验 用 水 由
Milipore公司Mili-Q超纯水系统制备。
1.3 方法
1.3.1 粗蛋白的制备
取种子1000g,搅碎成细粉,加入10倍体积
蛋白提取缓冲液(磷酸缓冲液,pH7.2),置4℃冰
箱冷浸过夜,同一样品反复浸提3次,尽量保证浸
第39卷 第1期 东 北 农 业 大 学 学 报 39(1):23~28
2008年 1月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Jan.2008
文章编号 1005-9369(2008)01-0023-06
提完全。
将浸提液低温离心,12000r·min-1,15min,
取上清弃沉淀。4℃下,在上清液中缓慢加入事先
研磨粉碎的硫酸铵至 25%饱和度,边加入边搅拌。
至硫酸铵完全溶解后,低温离心,12000r·min-1,
15min,所得沉淀即为 25%饱和度硫酸铵沉淀样
品。同法操作,上清液中继续缓慢加入硫酸铵至
50%饱和度,得 25%～50%,50%～75%和 75%～
100%饱和度的硫酸铵沉淀样品。每份样品依重量
按比例加水溶解,对水透析。透析后样品冷冻干
燥,得到不同饱和度硫酸铵盐析的蛋白样品。
样品复溶色谱聚焦起始缓冲液中,离心20000
r·min-1,15min,确保上清液澄清。取上清 0.5mL
注入已用 25mL色谱聚焦起始缓冲液平衡好的
Hitrapdesalting进行分离,流速 1mL·min-1,收集
第一个洗脱峰,即为制备好的粗蛋白样品。
Bradford法[10]测定蛋白浓度。
1.3.2 抗真菌活性检测方法
杯碟法测定样品抗真菌活性,测定加样品处的
菌丝生长距离(Ds)和对照处菌丝生长距离(Dc),抑
制率I=Dc-Ds/Dc表示活性大小。
1.3.3 最佳硫酸铵饱和度的确定
配制10mg·mL-1不同饱和度盐析蛋白溶液,低
温离心12000r·min-1,15min,取上清50μL,测
定抗绿色木霉、杨树溃疡、小麦赤霉、小麦全蚀、
棉花枯萎、稻瘟、油菜菌核病菌活性,水作对照。
1.3.4 抗菌蛋白的色谱聚焦分离
色谱聚焦条件:MonoP柱,起始缓冲液(SB)
为 0.075mol·L-1Tris溶液,用 1mol·L-1CH3COOH
调节 pH至 9.3;洗脱缓冲液(EB)为 polybufer96
稀释 10倍,1mol·L-1CH3COOH调节 pH至 6.0;
高盐离子洗脱缓冲液为 2mol·L-1CH3COONa。试
验前将各溶液过滤(0.22μm滤膜),脱气 5min。
设定流速 0.5mL·min-1,检测波长 280nm。系统
pH计在线监测流动相pH值,每次运行前用pH标
准液(pH7.0、pH10.0)校正。
色谱聚焦分离分析方法:根据样品浓度确定上
样体积,注入色谱柱,上样后用SB冲洗柱子至再
平衡,开始 100%EB洗脱。洗脱过程中形成线性
pH下降梯度,梯度(9.0～6.0)内按0.2pH间隔自动
收集。当流出液的 pH稳定在 6.0±0.1,注入 1mL
高盐离子洗脱缓冲液进行高盐洗脱。收集的样品可
立即进行试验或置-80℃的冰箱内保存待用。
1.3.5 色谱聚焦缓冲液对活性检测的影响和消除
分别取 SB和 EB,用水稀释 2×、5×和 10×,
测定抗绿色木霉活性。试采用丙酮沉淀法、脱盐柱
法和阳离子交换分离法消除色谱聚焦缓冲液对抗真
菌活性检测的影响。
丙酮沉淀法:SB和 EB等量混合,离子交换
流动相 A液作对照。分别加入 10倍体积冷丙酮,
-20℃静置10min,离心取沉淀。复溶后,测定抗
绿色木霉活性。
脱盐柱法:SB和 EB等量混合,离子交换流
动相 A液作对照。进行 Hitrapdesalting分离,测
定分离组分抗绿色木霉活性。
阳离子交换分离法:SB和 EB等量混合、色
谱聚焦分离得到的样品穿透组分分别用离子交换流
动相 A稀释 2×,水稀释 2×,稀乙酸调节 pH至
5.0。处理好后,分别进行 HitrapSp0%～100%
NaCl线性梯度洗脱(10个柱体积),测定洗脱组分
抗绿色木霉活性。
1.3.6 抗菌蛋白的离子交换色谱分离
离子交换色谱条件:HitrapSp柱,MonoS
柱,流动相 A是 25mmol·L-1乙酸,pH5.0;流动
相B是在流动相A中加入NaCl至1mol·L-1。试验
前将各溶液过滤(0.22μm滤膜),脱气 5min。检
测波长280nm,室温运行。
离子交换色谱分离分析方法:色谱聚焦分离得
到的穿透峰经 HitrapSp分离(洗脱梯度 0%～100%
NaCl,洗脱体积 10个柱体积,流速 1mL·min-1);
分离得到的活性组分用流动相 A稀释后,进行第
一次 MonoS分离(洗脱梯度 0%～77%NaCl,洗脱
体积15个柱体积,流速 0.8mL·min-1);分离出的
活性组分用流动相A稀释后,再次进行MonoS分
离(洗脱梯度12%～24%NaCl,洗脱体积15个柱体
积,流速0.8mL·min-1)。
1.3.7 蛋白质分子量的测定
参照郭尧君方法,分离胶浓度 12%,浓缩胶
浓度4%[11]。
1.3.8 蛋白质的胶内酶切
参照Fernandez方法[12]。
1.3.9 质谱测定方法和数据库检索
将样品溶解于 0.1%TFA/50%乙腈溶液中,将
CHCA用 0.1%TFA/50%乙腈配制成饱和溶液,二
·24· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
者等量混合后点靶,通风橱内风干。质谱仪选择正
离子反射模式、激光束波长 337 nm,加速电压 20
kV。外标校正。利用 Mascot搜索引擎检索 MSDB
数据库。
2 结果与分析
2.1最佳硫酸铵饱和度的确定
最佳硫酸铵饱和度的确定见表1。
由表1可知,多个硫酸铵饱和度都能在薏苡种
子浸提液中盐析出抗真菌蛋白,25%～50%、50%～
75%饱和度沉淀出的蛋白抗真菌活性最强,75%～
100%饱和度沉淀蛋白抗真菌活性较强。由于实际操
作中50%～75%饱和度蛋白样品获得量相对较多,所
以选择50%～75%饱和度的蛋白样品继续分离分析。
2.2粗蛋白样品浓度测定
经Hitrap desalting分离得到样品峰,最高紫外
280 nm处的吸收值在 4 600 mAU左右。 Bradford
法测定样品蛋白浓度是0.83 mg·mL-1。
2.3抗菌蛋白的色谱聚焦分离分析
2.3.1抗菌蛋白的色谱聚焦分离制备
取Hitrapdesalting分离得到的样品6mL(4.98mg)
进行色谱聚焦分离,结果见图 1。收集到 pI>
9.0,9.0>pI>6.0和pI<6.0的蛋白组分。穿透组分是
pI> 9.0的 蛋 白 , 保 留 体 积 为 0.85~8.2 mL和
10.0~10.5 mL,最高紫外吸收峰值约 45 mAU。
100%EB洗脱在MonoP离子交换剂的表面形成pH
线性下降梯度,在pH9.0~6.0范围内,蛋白组分依
据PI不同实现高选择性的分离。每0.2个pH间隔
收集 1次,得到 15份分离组分。保留体积为
10.5~18.7mL,其中最高紫外吸收峰值约 76mAU。
最后进行高盐离子洗脱,将余下的所有 pI< 6.0的
蛋白一次性洗脱下来,保留体积为 19.8~21.5mL,
最高紫外吸收峰值约4800mAU。可见,色谱聚焦
分离快速地将极少量 pI> 9.0和 pI在 9.0~6.0间的
蛋白组分和大量其它蛋白组分分开,pH梯度
9.0~6.0间实现pH仅间隔0.2个单位的高效分离。
2.3.2色谱聚焦缓冲液对活性检测的影响和消除
试验中发现色谱聚焦缓冲液 SB和 EB均具有
一定的抑制绿色木霉生长活性,SB稀释 5倍后抑
制作用基本消失,EB稀释至 10倍仍有抑制作用。
将SB和 EB等量混合后,进行丙酮沉淀,可得到
具有抗绿色木霉活性的透明沉淀物,表明丙酮法无
法去除色谱聚焦缓冲液中的抗菌物质。进行脱盐柱
分离得到的洗脱组分抗绿色木霉活性减弱,但对样
品活性检测仍具干扰作用。经Hitrap Sp分离 B和
EB的混合液得到的各洗脱组分均不表现抗菌活性,
对色谱聚焦分离得到的样品穿透组分进行 Hitrap Sp
表 1 硫酸铵分级组分对真菌生长的抑制率
Table 1 Inhibitory rates of different ammonium sulfate
saturation fraction on fungi growth
真菌
Fungus
硫酸铵饱和度(%)
Saturation ofammoniumsulfate
0～25 25～50 50～75 75～100
绿色木霉
Trichoderm
virida
0 0.87 0.86 0.67
杨树溃疡
Botryosphaeria
dothidea
0 0.84 0.85 0.64
小麦赤霉
Fusarium
graminearum
0 0.85 0.87 0.63
小麦全蚀
Geaumannomyces
graminis
0 0.48 0.68 0.60
棉花枯萎
Fusarium
oxysporium
0 0.31 0.33 0.31
稻瘟
Pyricularia
oryzae
0 0.36 0.39 0.38
油菜菌核
Sclerotinia
sclerotiorum
0 0.67 0.53 0
图 1 薏苡50%～75%硫酸铵盐析蛋白色谱聚焦分离
Fig. 1 Chromatogram of Coix lacryma-jobi Linn 50%～
75% ammonium sulfate saturation protein fraction
separation by chromatofocusing
刘 静等:利用色谱聚焦和离子交换色谱快速分离分析薏苡38 ku抗真菌蛋白第1期 ·25·
2.5抗菌蛋白的SDS-PAGE分析
取最终分离纯化的活性蛋白进行SDS-PAGE分
析,得到单一蛋白条带,相对分子质量在38左右(见
图3)。
2.6 38 ku抗真菌蛋白的MALDI-TOF-MS分析
胶内酶切后,采用MALDI-TOF-MS进行抗真菌
蛋白的肽质量指纹谱分析(见图4)。检出的肽谱数
据进行蛋白质数据库PMF搜索鉴定,没有找到相对
应的匹配蛋白,原因可能是数据库建设尚不完全。
分离获得抗菌活性组分。将 HitrapSp分离得到的
抗菌活性组分,SB、EB、SB和 EB等量混合溶液
10℃水浴 30min,检测表明抗菌组分的活性消
失,SB、EB、SB和 EB等量混合溶液的抗菌活性
不变。可见,阳离子交换分离能够消除色谱聚焦缓
冲液对活性检测的干扰,同时有效分离薏苡种子抗
真菌蛋白,可选择离子交换法进行下一级分离。
2.4抗菌蛋白的离子交换色谱分离
色谱聚焦分离得到的穿透组分用 Hitrap Sp进
行 0%～100% NaCl线性梯度洗脱(10个柱体积) ,
可得到4个蛋白峰(见图2a)。检测确定峰Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ具有抗菌活性,其中峰Ⅲ活性最强。峰Ⅱ、Ⅲ、
Ⅳ经流动相 A稀释后,再分别进行 Mono S 0%～
77% NaCl线性梯度洗脱(15个柱体积) ,获得多个
蛋白峰(见图 2b)。检测确定保留体积 7～11 mL的
蛋白峰具有抗菌活性。选择活性强的蛋白峰(见图
2b箭头指示)稀释后,再进行 Mono S 12%～24%
NaCl线性梯度洗脱(15个柱体积) ,得到抗真菌蛋
白单峰(见图 2c箭头指示)。可以看出,经色谱聚
焦分离去除大量杂蛋白后,只需在相同的缓冲液体
系内进行离子交换色谱分离,就能高效率的分离分
析薏苡抗真菌蛋白。
图 2 抗真菌蛋白的离子交换色谱分离
Fig. 2 Elution profile of antifungal protein by ion-exchange chromatography
97400 u
66200 u
43000 u
31000 u
20100 u
M-标准分子质量蛋白;1-薏苡抗真菌蛋白
M-Protein Marker;1-Coixlacryma-jobi Linn antifungal protein
图 3 薏苡抗真菌蛋白的SDS-PAGE
Fig. 3 SDS-PAGE profile of Coix lacryma-jobi Linn
antifungal protein
图 4 薏苡38 ku抗真菌蛋白的肽质量指纹谱
Fig. 4 Peptide mass fingerprint(PMF)o Coix lacryma-
jobi Linn 38 ku antifungal protein
a-离子交换柱Hitrap Sp分离;b-离子交换柱MonoS0%～77% NaCl分离;c-离子交换柱MonoS12%～24 NaCl分离
a-Elution profile byHitrapTMSp Hp column;b-Elution profile byMonoSTMHR 5/5 co umn (0%～77% NaCl);
c-Elution profile byMonoSTMHR 5/5 column (12%～24% NaCl)
·26· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
2.7 抗真菌蛋白的活性检测
活性检测结果见图5。
由图 5可以看出,38ku抗真菌蛋白具有明
显抗绿色木霉活性。从薏苡种子中其他蛋白的抗
绿色木霉活性可知,50%～75%饱和度硫酸铵能
盐析出多种薏苡抗真菌蛋白,粗样品表现出的强
抗真菌活性应是多种抗真菌蛋白共同作用的结
果。
3 讨 论
植物抗菌蛋白是植物在长期自然选择中产生的
自我保护成分,在新型抗菌药物和植物抗病基因工
程中发挥重要作用。从细胞内成千上万种蛋白质中
分离纯化出目标蛋白质,需要有效的技术方法来实
现。色谱聚焦分离对样品纯度要求较高,在常规蛋
白样品制备方法的基础上我们又增加了脱盐柱处
理,提高样品纯度,保证了色谱聚焦分离的顺利进
行,取得良好的分离效果。尽管用于色谱聚焦分离
的缓冲液对抗真菌活性检测有影响,但试验证明并
不干扰活性蛋白的离子交换分离和最终结果检测。
本文联合利用色谱聚焦和离子交换色谱快速分离分
析薏苡种子抗真菌蛋白,首次得到一种相对分子质
量在38ku左右的薏苡抗真菌蛋白。该抗菌蛋白相
对分子质量大于本实验室以往从薏苡种子中分离得
到的抗菌蛋白相对分子质量,数据库搜索没有找到
匹配蛋白。该抗菌蛋白很可能是一种全新的未知蛋
白,其理化性质、氨基酸组成、结构分析等还有待
进一步研究。
[ 参 考 文 献 ]
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a
b
c
a-离子交换流动相A对照;b-离子交换流动相B对照;
c-38ku抗真菌蛋白;未标记-薏苡种子中其它蛋白组分
a-SCXbuferACK;b-SCXbuferBCK;c-Coixlacryma-jobiLinn
38kuantifungalprotein;Unmarked-Otherproteinsin
Coixlacryma-jobiLinnseed
图 5 抗真菌蛋白的抗绿色木霉活性
Fig.5 InhibitoryactivityoftheCoixlacryma-jobiLinn
antifungalproteinagainstTrichodermvirida
刘 静等:利用色谱聚焦和离子交换色谱快速分离分析薏苡38ku抗真菌蛋白第1期 ·27·
Isolationandanalysisof38kuanti-fungalproteinfrom
Coixlacryma-jobiLinnbychromatofocusingand
ion-exchangechromatography
LIUJing1,2,ZHAOKuijun1,PANYinghong2
(1.ColegeofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;
2.InstituteofCropScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,
NationalKeyFacilityforCropGeneResourcesandGeneticImprovement,Beijing100081,China)
Abstract:Chromatofocusingandion-exchangechromatographywerecombinedtorapidlyisolateandanalyze
antifungalproteinsinCoixlacryma-jobiLinnseed.AnewantifungalproteininCoixlacryma-jobiLinnseedwas
firstfound.Itsrelativemolecularmasswasabout38bySDS-PAGEdeterminationanditspeptidemassfinger-
printwasobtainedthroughin-gel-digestionandMALDI-TOF-MSanalysis.Thepeptidemassfingerprintdata
obtainedthenweresearchedinthepublicdatabase.
Keywords:Coixlacryma-jobiLinn;antifungalprotein;chromatofocusing
·28· 东 北 农 业 大 学 学 报 第39卷