全 文 ：韩瑞娟 , 董立尧 ,李　俊 , 等.日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵代谢抗性的初步研究 [ J] .杂草科学 , 2010(1):3-7.
日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵代谢抗性的初步研究
韩瑞娟 1 , 董立尧1 , 李　俊 1 , 张宏军 2
(1.南京农业大学植物保护学院农药科学系 ,农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室 ,江苏南京 210095;
2.农业部农药检定所生物测定室 ,北京 100026)
　　摘要:为了明确日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-R-methyl)的代谢抗性机理 , 研究了抗性和敏感
生物型体内细胞色素 P450还原酶(cytochromeP-450 monooxygenases, P450)和谷胱甘肽 -S-转移酶(glutathione-
S-transferases, GSTs)的活性差异。结果表明 ,未用药剂处理时 ,抗性日本看麦娘 P450与 GSTs的活性均高于敏感
日本看麦娘。高效氟吡甲禾灵茎叶喷雾处理 2 d后 , 敏感植株反应剧烈 , P450与 GSTs活性均呈现急剧的变化趋
势 ,而抗性种群的变化趋势平缓。处理后第 6 d, 敏感种群较抗性种群先出现下降趋势 , 其活性也明显低于抗性种
群。处理后第 10 d活性均降到最低 ,并且依然低于施药初期。从而可以得出:高效氟吡甲禾灵被抗性日本看麦
娘体内的细胞色素 P
450
还原酶催化 ,经过羟化作用迅速解毒 ,并在 GSTs的催化下形成了无毒或低毒的化合物 , 使
其免受伤害。表明代谢酶活性增强是日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗性的机理之一。
　　关键词:日本看麦娘;高效氟吡甲禾灵;代谢;抗性;P450;GSTs
　　中图分类号:S451.22+4　　文献标志码:A　　文章编号:1003-935X(2010)01-0003-05
(上接第 2页)
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　　日本看麦娘 (Alopecurusjaponicus)是我国油菜
田的一种恶性禾本科杂草 ,是制约油菜丰产丰收的
主要因素 。高效氟吡甲禾灵 (haloxyfop-R-meth
收稿日期:2009-12-25
基金项目:国家自然科学基金(编号:30971928);博士点基金新教师
类项目(编号:20090097120046)。
作者简介:韩瑞娟(1985—), 女 ,硕士研究生 ,研究方向为除草剂毒
理及抗药性。 E-mail:2007102110@njau.edu.cn。
通信作者:董立尧 ,教授 ,从事除草剂毒理及抗药性研究。 Tel:(025)
84395672;E-mail:dly@njau.edu.cn。
yl)活性高 ,杀草谱广 ,选择性强 ,是油菜田防除一年
生禾本科杂草的主导药剂。由于高效氟吡甲禾灵的
连年广泛使用 ,近年有报道称日本看麦娘对其产生
了明显的抗药性[ 1] 。
关于抗性机制的研究 ,目前主要有两种:一是靶
标酶 ACCase结构改变 ,从而对药剂不敏感;二是对
除草剂解毒代谢能力的增强 。 Brown等报道 ,鼠尾
看麦娘(Aloecurusmyosuroides)ACCase中异亮氨酸
突变为亮氨酸是其对烯禾啶(sethoxydim)产生抗性
—3—杂草科学　2010年第 1期
的原因 [ 2] 。Hal等研究表明 ,英国种群的鼠尾看麦
娘对禾草灵(diclofop-methyl)和噁唑禾草灵(fenox-
aprop-p-ethyl)产生抗性 ,在某种程度上是由于其
对这两种药剂的代谢增强[ 3] 。据报道 ,抗吡氟禾草
灵(fluazifop-p-butyl)的马唐(Digitariasanguina-
lis)生物型经 14C标记显示:吡氟禾草灵在其体内的
吸收和输导与敏感型没有差异 ,但在抗性马唐体内
能被快速代谢为其他无毒物质。显然 ,这种代谢能
力的增强在抗性马唐体内起着重要作用 [ 4] 。
在杂草对除草剂的解毒代谢过程中有两个酶十
分重要:细胞色素 P450还原酶(cytP450)[ 5-6]和谷胱
甘肽 -S-转移酶(GSTS)[ 7-8] 。
日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的代谢抗性机理
未见报道。因此本文旨在通过测定敏感及抗性日本
看麦娘细胞色素 P450还原酶和 GSTs的活性 ,明确日
本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗药性是否与代谢增
强相关 ,从而揭示其代谢抗性机理 ,并为制定油菜田
恶性杂草日本看麦娘的防除策略和延缓抗性种群的
发展提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料
在安徽 、上海 、江苏 、浙江等我国油菜田主产区
采集有代表性的日本看麦娘成熟种子 。其采集地点
有:(A)句容油菜田;(B)合肥三十岗油菜田;(C)句
容休闲田;(D)江苏阜宁;(E)常州市武进休闲田;
(F)江都休闲田;(G)江都油菜田;(H)浙江绍兴油
菜田;(I)滁州休闲田;(J)金坛市薛坪上阳油菜田;
(K)金坛市金城油菜田;(L)上海南汇区油菜田;
(M)金坛市开发区休闲田;(N)常州市武进油菜田;
(O)金坛市薛坪上阳休闲田 。
1.2　不同种群日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵抗药
性水平的测定
采用种子生物测定法。将 40粒预先经低温浸
泡过的日本看麦娘种子放于铺有一层滤纸的培养皿
内 ,加入 5mL高效氟吡甲禾灵药液 ,置于光照培养
箱内培养 (光照:12 h。温度:白天 18 ℃,晚上 15
℃)。药剂处理 13 d后 ,测量芽长 ,计算日本看麦娘
萌发的抑制中剂量(ED50),根据 ED50值确定抗性及
敏感种群。设清水为对照。重复 4次 。经过一系列
试验得出最适的药剂剂量(表 1)。
表 1　用于种子生物测定的药剂剂量
采集地点 剂量(μga.i./m2)
N、E、F、G、H、I、K、L、M、N 0、8.625、 17.25、34.5、 69、138
A 0、862.5、 1 725、 3 450、6 900、13 800
B、C、D 0、 86.25、345、 690、1 380
J、O 0、6.9、13.79、 27.59、55.17、 110.34
　　相对抗性倍数 =不同地区日本看麦娘种群的
ED50 /敏感日本看麦娘种群的 ED50
1.3　细胞色素 P450还原酶活性测定
1.3.1　供试材料的准备　将土与沙按 2 ∶1混合均
匀 ,装入直径为 9 cm的塑料盆钵内 ,每盆播 30粒低
温浸泡过的日本看麦娘种子 ,置于光照培养箱内培
养 ,培养条件同 1.2。出苗后每盆定苗 20株 。 3周
后日本看麦娘长至 3 ～ 4叶期 ,用高效氟吡甲禾灵
97.2 mg/m2进行茎叶喷雾处理 。喷雾采用农业部
南京农业机械化研究所生产的 3WPSH-500D型生
测喷雾塔 ,圆盘直径 50 cm,主轴转动速度 6 r/min,
喷头孔径 0.3 mm,喷雾压力 0.3 MPa,雾滴直径
100 μm,喷头流量 90 mL/min。分别在处理后第 1
d、2d、3d、6 d、8 d、10 d采集样品。设清水为对照 。
1.3.2　细胞色素 P450微粒体的提取　取约 5 cm高
的幼苗 1.00 g,立即用 10 mmol/L的 Na2S2O4浸洗 ,
用沙布吸干后放入液氮中。在预冷的研钵中加
0.5 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)和 1.5 mL提取缓
冲液(0.1 mol/L磷酸 , pH值 7.5, 10%甘油 , 0.1%
BSA, 5mmol/LDTT, 1mmol/LLiCO3)研磨 ,匀浆后
于 10 000g离心 20min,取上清液于 100 000g超速
离心 80min,将沉淀的微粒体部分悬浮于适当体积
的 0.1mol/L磷酸缓冲液(含 10%甘油 , 1.5mmol/L
巯基乙醇 , pH值 8.5),贮存于 -20℃冰箱备用。以
上操作均在 0 ～ 4 ℃条件下进行 [ 9] 。
1.3.3　细胞色素 P450还原酶的活性测定 　参照
Feng等[ 10]的方法。 3 mL反应混合液中含有 2.8
mL磷酸缓冲液 、酶液 100 μL、5mg/mL细胞色素 C
100 μL。样本比色杯中加入 5 mg/mL还原型辅酶
Ⅱ(NADPH)0.02 mL启动反应 ,立即混匀 。另取 3
mL混合液加入与 NADPH等量的缓冲液作为对照。
用分光光度计测定 550nm处的光吸收值 A,每分钟
测定 1次 , 连续测定 3次。以摩尔消光系数 21
(mmol/L)-1·cm-1来计算活性 。公式如下:
蛋白活性 =D×1 000/(21×C)
其中 D为吸光值 , C为稀释后样品的蛋白质浓度
(mg/mL),蛋白活性单位为 nmol/(min· mg)。
P450相对活性为 P450施药活性与同期对照活性
—4— 杂草科学　2010年第 1期
的比值 。
试验平行测定 3次。
1.4　谷胱甘肽 -S-转移酶(GSTs)活性测定
1.4.1　供试材料的准备　同 1.3.1。
1.4.2　谷胱甘肽 -S-转移酶(GSTs)的提取　取
茎叶组织 0.5 g在液氮中冷冻 ,并快速研磨成粉末 。
加入 pH值 7.5, 0.1 mol/LTris-HCL, 1 mmol/L的
EDTA, 14mmol/L的 β -巯基乙醇 , 7.5%的 PVP-
40 ,并用双层纱布过滤。过滤后组织匀浆离心 (4
℃, 15 000 g, 20 min)。上清液用 0.1倍体积的硫酸
鱼精蛋白处理后 ,重新离心 。最后用加入硫酸铵至
饱和度为 80%,如前所述条件下离心 ,所得蛋白质
颗粒在 -20 ℃下保存。上述蛋白提取物用
2 mmol/L的磷酸钾缓冲液 (pH值 6.8)盐析 , 过
SephadexG-25柱子 ,收集馏分 。调节蛋白质浓度
至 10 mg/mL,以备测定酶的活性 [ 11] 。
1.4.3　谷胱甘肽 -S-转移酶(GSTs)的活性测定
　参照 John[ 12] 、吴进才等 [ 13]方法 。在 3 mLTris-
HCl缓冲液(0.1mol/L, pH值 8,含 25 mmol/L还原
性谷胱甘肽)中加 0.1 mL酶液 , 25 ℃保温 10 min,
加入 0.1 mL无水乙醇配制的 13 mmol/LCDNB(2, 4
-二硝基氯苯),反应 10 min后 ,于 340 nm处测得
D值。以摩尔消光系数 9.5 (mmol/L)-1 · cm-1来
计算活性。公式如下:
蛋白活性 =D×1 000 /(9.5×C)
其中 D为吸光值 , C为稀释后样品的蛋白质浓度
(mg/mL),蛋白活性单位为 nmol/(min·mg)。
GSTs相对活性为 GSTs施药活性与同期对照活
性的比值。试验平行测定 3次。
1.5　蛋白含量测定
参照 Bradford(1976)[ 14]考马斯亮蓝 G-250染
色法测定 ,以牛血清蛋白(BSA)为标准曲线 。
1.6　数据处理
用 DPS软件数量型数据分析法分别求出高效
氟吡甲禾灵对不同日本看麦娘种群的毒力回归方
程 、ED50。
2　结果与分析
2.1　不同日本看麦娘种群对高效氟吡甲禾灵的抗
性水平
由表 2可以看出 ,不同种群的日本看麦娘对高
效氟吡甲禾灵的抗性水平不同。其中句容种群
ED50值最大 ,为 1756.00 μg/m2 ,其相对抗性倍数高
达 292.90;金坛市薛坪上阳休闲田 ED50值最小 ,为
6.00 μg/m2。表明句容种群对高效氟吡甲禾灵已产
生明显的抗性 ,与本实验室前期报道结果一致 [ 1] 。
因此 ,以句容种群为抗性生物型 ,薛坪上阳种群为敏
感生物型进行试验 。
表 2　不同日本看麦娘种群对高效氟吡甲禾灵的抗性水平
采集地点 毒力回归方程 抑制中浓度 ED50(μg/m2)
相对抗
性倍数
A y=1.444 21x+0.314 23 1 756.00 292.90
B y=0.415 31x+3.838 06 627.74 104.71
C y=3.441 93x-2.705 66 173.28 28.90
D y=1.448 04x+1.860 21 147.33 24.58
E y=1.849 91x+2.371 80 26.35 4.39
F y=5.693 14x-2.887 51 24.29 4.05
G y=3.255 20x+0.495 53 24.20 4.04
H y=3.560 67x+0.397 96 19.61 3.27
I y=3.250 26x+0.848 29 18.94 3.16
J y=2.926 65x+1.558 00 15.00 2.50
K y=4.657 48x-0.415 94 14.55 2.43
L y=1.005 83x+3.842 65 14.15 2.36
M y=1.961 13x+2.771 11 13.69 2.28
N y=1.221 98x+3.862 97 8.52 1.42
O y=0.904 53x+4.296 46 6.00 1.00
　　注:相对抗性倍数 =不同地区日本看麦娘种群的 ED50 /金坛市
薛坪上阳休闲田的日本看麦娘种群 ED50
2.2　细胞色素 P450还原酶活性
未用药剂处理时抗性日本看麦娘种群的 P450活
性为 41.86 pmol/(min·mg),高于敏感日本看麦娘
种群 27.30 pmol/(min·mg)。图 1显示 ,在高效氟
吡甲禾灵 97.2 mg/m2处理 3d后 ,敏感日本看麦娘
种群 P450活性急剧上升 ,而抗性种群上升趋势平缓 ,
说明敏感种群受药剂影响较大 ,反应激烈。药剂处
理 6 d后 ,敏感种群 P450活性开始下降 ,而抗性种群
仍然保持增加趋势 ,表明抗性种群对高效氟吡甲禾
灵仍有较高的代谢能力。药剂处理 8 d后 ,抗性种
群 P450活性也开始出现下降趋势 ,但其活性明显高
于敏感种群 ,这与敏感种群先于抗性种群出现死亡
迹象相一致。
—5—韩瑞娟等:日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵代谢抗性的初步研究
　　结果表明 ,高效氟吡甲禾灵被抗性日本看麦娘
体内的细胞色素 P450还原酶催化 ,迅速降解 ,可能是
日本看麦娘对其产生抗性的机理之一 。
2.3　谷胱甘肽 -S-转移酶(GSTs)活性
未用药剂处理时 ,抗性日本看麦娘种群的 GSTs
活性 11.01nmol/(min· mg),高于敏感日本看麦娘
种群 6.39 nmol/(min· mg)。图 2显示 ,高效氟吡
甲禾灵 97.2 mg/m2处理 2d后 ,敏感日本看麦娘种
群 GSTs活性急剧下降 ,而抗性种群下降趋势较缓 。
药剂处理 3d后 ,敏感种群 GSTs活性升高 ,这可能
是日本看麦娘本身受到外界环境胁迫后表现出的应
激反应 。随后又呈下降趋势 ,说明高效氟吡甲禾灵
的药效逐渐显现 。而抗性种群在整个过程中变化都
很缓慢 ,说明抗性种群受药剂的影响较小 。药剂处
理 8 d后 ,敏感及抗性种群体内 GSTs活性又呈上升
趋势 ,但敏感种群明显低于抗性种群 ,且均低于施药
初期 ,这与敏感种群首先出现死亡迹象相一致 。
结果表明 ,经过第一阶段的代谢作用产生的代
谢产物 ,在 GSTs的催化下形成了对抗性日本看麦
娘无毒或低毒的化合物 ,使其免受伤害 ,可能是抗性
机理之一。
3　讨论
除草剂在植物体内通过其官能团或反应基的变
化经过 3个阶段完成全部代谢过程 , 即代谢作用
(metabolism)—缀合作用(conjugation)—分离(sepa-
ration),从而使其生物活性完全丧失 。第一阶段是
最重要的 ,在这一阶段中 , P450可以对不同类型的除
草剂通过脱烷基或羟基化等作用进行修饰[ 15] ,催化
众多亲脂除草剂的氧化作用[ 16] 。大量证据证明了
细胞色素 P450酶系参与了对许多除草剂的代谢和解
毒作用 [ 17] 。芳环或烷基羟基化是细胞色素 P450羟
基化酶诱导的除草剂最普遍的代谢反应。
在小麦(Triticumaestivum)中 ,禾草灵被其体内
的细胞色素 P450单加氧酶催化的芳基羟化作用迅速
解毒 [ 6] 。在抗禾草灵的不实野燕麦(Avenasterilis)
和鼠尾看麦娘中也发现了相似的代谢途径[ 18-19] 。
有报道称增强的解毒作用是瑞士黑麦草 (Lolium
rigidum)和看麦娘(Alopecurusaequalis)的抗药性机
制 ,这种抗性机制常常是由细胞色素 P450单加氧酶
活性或表达增强引起的 [ 3, 20 -21] 。
第二阶段的代谢主要是合成过程 ,即酶催化第
一阶段产生的代谢产物经过缀合作用 ,形成对植物
无毒或低毒的化合物 ,此类代谢反应主要是由谷胱
甘肽 -S-转移酶诱导 [ 16] 。多种类型除草剂在杂草
体内均是由 GSTS催化进行不可逆的缀合作用而导
致选择性的[ 22] 。
噁唑禾草灵能在小麦 、大麦 (Hordeumvulgare)
和止血马唐 (Digitariaischaemum)体内被代谢则是
由于在 GSTs催化下其羟化丙酸酯基团被亲核取代
(nucleophilicsubstitution)[ 21] 。同时在鼠尾看麦娘
的抗芳氧苯氧丙酸酯类除草剂生物型中发现了比敏
感生物型更高的 GSTs活性[ 7, 23] 。 Westernblot分析
表明抗噁唑禾草灵的看麦娘体内 GSTs活性增强与
25kd多肽和另两个异常的 27kd和 28kd免疫反应
多肽的表达提高相关 ,因此 GSTs的高活性和谷胱
甘肽的有效性有助于通过谷胱甘肽与 ACCase的轭
合使除草剂解毒 ,从而使看麦娘对噁唑禾草灵产生
抗药性[ 7] 。
为了研究日本看麦娘的代谢与抗性机理的关
系 ,本研究所选用的日本看麦娘种群是本实验室前
期报道的抗性生物型 ,关于其抗性机理未见报道。
本研究结果得出 P450活性在抗性与敏感植株体内的
变化存在着差异 , 并且由于测定活性时加入了
NADPH,从而可以看出细胞色素 P450可以催化高效
氟吡甲禾灵使其羟基化 。这一结论与 Yun等的研
究结果[ 24]相一致。 Frear等 [ 25]报道绿磺隆 (chlor-
sulfuron)在小麦体内为羟基化代谢 ,且为小麦细胞
色素 P450催化。
未用药剂处理时抗性日本看麦娘的 GSTs与
P450活性均高于敏感日本看麦娘。施药 1d后 P450与
GSTs的活性均在敏感种群体内发生急剧变化 ,而在
抗性种群中变化趋势平缓 ,并且敏感种群首先出现
下降趋势 ,说明敏感日本看麦娘种群较易受到高效
氟吡甲禾灵的影响 。随后抗性种群较敏感种群首先
出现上升趋势 ,即抗性种群代谢酶活性增强能迅速
将体内除草剂代谢使其活性丧失 ,从而保护自身使
其免受伤害。虽然敏感种群也能出现上升趋势 ,但
—6— 杂草科学　2010年第 1期
其活性依然低于抗性种群 ,且明显低于施药初期 。
这可能是由于植物本身受到外界环境的刺激而表现
出的应激反应 ,也就解释了为什么敏感种群首先出
现死亡迹象 。
研究表明 ,高效氟吡甲禾灵被抗性日本看麦娘
体内的细胞色素 P450还原酶催化 ,经过羟化作用迅
速解毒 ,并在 GSTs的催化下形成了无毒或低毒的
化合物 ,使其免受伤害 。因此 ,代谢酶活性增强是日
本看麦娘对高效氟吡甲禾灵产生抗性的机理之一。
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