全 文 ：收稿日期:2008-07-20;修回日期:2008-10-14
作者简介:梁臣(1956年—),男 ,黑龙江依兰人 ,高级工程师 ,主要从
事森林保护工作。
杜松枯梢病的初步研究
梁臣 1 ,张宏敏 1 ,梁佳鑫 1 ,柏玉东2
(1.双鸭山市林业局,黑龙江 双鸭山　155100;2.双鸭山矿务局林业处 ,黑龙江 双鸭山　 155100)
摘要:根据柯赫氏证病法则和病原菌形态特征证明杜松枯梢病是由桧色二孢 DiplodiajuniperiWest-
end.引起的。病原菌的适生温度 15 ～ 35℃,最适温度 30 ℃,温度低于20℃生长缓慢 ,低于 15 ℃
时完全停止生长 。菌丝在 pH值 5.8 ～ 8.2之间均能生长 ,最适 pH为 6,偏酸更好 。不同的碳源对
生长无显著影响 ,乳糖为最佳碳源。蛋白胨为最佳有机氮源 ,硝酸钙为最佳无机氮源 。
关键词:杜松;枯梢病;病原菌;桧色二孢;培养特性
中图分类号:S763.15　文献标志码:A　文章编号:1671-0886(2009)01-0004-03
ShootblightofJuniperusrigida/LIANGChen, etal.(ShuangyashanForestryBureauofHeilongjiang
Province, Shuangyashan155100 , China)
Abstract:ThepathogensofshootblightofJuniperusrigidaSieb.etZucc.wasdeterminedasDiplodia
juniperiWestendaccordingtoKochsPostulateandmorphologicalcharacterofthepathogens.Thesuit-
abletemperatureforthesurvivalofthepathagenwas15-35 ℃withanoptimumtemperatureof30 ℃.
Thegrowthslowedatthetemperaturebelow20℃ andstoppedatthetemperatarebelow15℃.Myce-
liumgrewatthepHvaluebetween5.8 and8.2withtheoptimumpHvalueof6.Carbonsourceshad
nosignificantefectonthegrowth, themostsuitablecarbonsourceswaslactose.Optimumorganicni-
trogensourcewaspeptone, calciumnitratewasthebestinorganicnitrogensource.
Keywords:Juniperusrigida;shootblight;pathogen;DiplodiajuniperiWestend.;culturecharacteris-
tics
　　杜松 JuniperusrigidaSieb.etZucc.是我国主
要的园林绿化树种之一 ,在南方有大量栽植 ,在东北
地区也有大量引种。黑龙江省自 20世纪 60年代就
有引种 ,以后逐年增加 ,目前全省城市园林苗圃都有
引种 ,对绿化北国城市 、美化环境起到了很好的作
用 。近年来 ,杜松枯梢病在一些苗圃和园林绿篱上
时有发生 ,严重影响了杜松的绿化效果。为了解该
病原菌的适应能力及其所致病害特点 ,以便采取有
效的预防和控制措施 ,作者对杜松枯梢病病原学和
培养特性进行了研究 ,探索温度 、pH值 、不同营养条
件等对菌丝生长的影响。
1　材料和方法
1.1　病原菌　病原菌采自哈尔滨工业大学科技园
杜松绿化林 ,并截取病株的地上部分带回实验室保
湿培养 、保存 ,用该科技园的杜松 2 ～ 3 a生水培枝
条作接种材料。
1.2　试验方法[ 1]
1.2.1　病原菌的分离 、纯化　用小刀切取患杜松枯
梢病的病梢 0.3 ～ 0.4 cm的小段 ,用纱布包好 ,在超
净工作台上用漂白粉 (加 14倍水 )表面消毒
1.5 min,再用无菌水冲洗 3次 ,然后接种在 PDA平
板上 ,每皿均匀放置 5小块 ,做好标记 ,然后倒置于
25 ℃的培养箱中培养;待菌落长好后 ,分离菌落边
缘的菌丝转接到 PDA平板上 ,倒置于 25 ℃培养箱
中培养;再将纯化出的菌丝移入 PDA试管斜面上培
养 ,待菌落长满斜面后 ,放入 4 ℃冰箱中保存备用 。
1.2.2　病原菌的形态鉴定　将杜松枯梢病病组织
制成徒手切片 ,在显微镜下观察分生孢子器 、分生孢
子和分生孢子梗的形态特征并测量其大小。
1.2.3　病原菌致病性测定　取病枝 、病叶上孢子器
若干个放到培养皿中 ,加入一定量的无菌水 ,压碎分
生孢子器 ,取 1滴镜检 ,当浓度达到在 100倍镜下每
·4· ForestPestandDisease　Jan.　2009　No.1
个视野有 30 ～ 50个孢子时 ,进行对水培杜松枝条接
种试验 。将 1.2.1中纯化的培养 7 d的菌落菌丝和
孢子悬浮液接种到杜松水培枝条上 ,采用针刺接种
和无伤接种 ,以接种无菌水为对照 ,套塑料袋保湿 ,
48 h后解除保湿 ,正常管理 。定期观察病害发生情
况 。从人工接种发病的水培杜松枝上采集标本 ,用
1.2.1方法进行分离纯化病原菌并比较接种前后的
菌株特征和发病症状 。
1.2.4　病原菌的生物学特性
(1)温度对病原菌生长速度的影响　将分离纯
化的菌株在 PDA平板上培养 5 d,然后用灭菌打孔
器(直径为 5 mm)沿菌落边缘取菌饼 ,将这些同质
等量的菌饼接种到 PDA平板中间 ,每皿 1块 ,然后
在 4 , 8, 15, 20, 25, 30, 35 ℃共 7个温度下恒温培
养 ,每处理 5个重复 ,每隔 24 h用十字交叉法测量
菌落直径。
(2)pH值对病原菌生长速度的影响　用磷酸
盐缓冲液配制梯度 pH值 ,与 PDA培养基均匀混合
后 ,获得 5.8, 6.0, 6.4, 6.8, 7.0, 7.3, 7.6, 8.2共 8
个 pH值的 PDA平板 。将分离纯化的直径为 5 mm
的菌饼接种于平板中央 , 每处理 5个重复 , 置于
25 ℃恒温箱中培养 ,每隔 24 h测量 1次菌落直径。
(3)不同碳源对病原菌生长速度的影响　固氮
培养基:门冬酰胺(氮源)2 g,葡萄糖(碳源)2 g,磷
酸氢二钾 1.5 g, 硫酸镁 0.75 g, 琼脂 15 g, 水
l000 mL;
以固氮培养基为基础培养基 ,分别以等量的蔗
糖 、麦芽糖 、乳糖 、淀粉 、甘露醇 5种碳源取代葡萄糖
和无碳源制成平板。接种和测量方法同上 。
(4)不同氮源对病原菌生长速度的影响　固碳
培养基:葡萄糖(碳源)2 g,门冬酰胺(氮源)2 g,磷
酸氢二钾 1.5 g, 硫酸镁 0.75 g, 琼脂 20 g, 水
1 000 mL;以固碳培养基为基础培养基 ,分别以等量
的蛋白胨 、硝酸钙 、L-天冬酸 、甘氨酸 、尿素 5种氮
源取代门冬酰胺和无氮源制成平板。接种和测量方
法同上 。
2　结果与分析
2.1　病原菌及其致病性　将纯化的菌丝体和孢子
悬浮液接种到杜松水培枝条 , 6 d后开始出现病状 ,
10 d后接种枝嫩梢针叶褪绿变黄接近枯死 , 15 d后
病部嫩梢枯死 , 30d后可见半埋生的黑色小点 。接
种发病症状与自然发病症状基本一致 。经镜检 ,病
原菌的分生孢子器近球形 ,有不明显的乳头状孔口 ,
单生 ,半埋生于寄主表皮下 ,分生孢子双胞 ,分隔处
缢缩 ,长椭圆形 ,褐色 ,大小(18.5 ～ 20)μm×(9 ～
12)μm。用接种发病材料再分离得到与原来接种体
一样的真菌。经柯赫氏证病法则和病原菌形态学证
明杜松枯梢病是由桧色二孢 DiplodiajuniperiWest-
end.引起的 [ 2 -3] 。
2.2　温度对病原菌生长的影响　不同温度对菌丝
生长速度的影响见表 1。病原菌的适生温度为 15 ～
35 ℃,在 30 ℃下菌丝生长最快 ,低于 20 ℃菌落生
长缓慢 ,低于 15 ℃时完全停止生长 。
表 1　温度对病原菌生长速度的影响
温度
℃
菌落直径 /mm
24h 48h 72h 96h 120h
菌落平均生长
速度 / (mm/d)
35 8.30 17.80 27.20 34.10 40.70 8.14
30 21.10 32.70 43.50 56.80 70.40 14.08
25 15.20 25.52 35.60 45.80 54.80 10.96
20 7.10 10.50 18.70 25.60 30.60 5.10
15 0 8.40 12.80 16.70 19.80 3.95
8 0 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0
2.3　pH值对病原菌生长速度的影响　pH值对病
原菌生长的影响见表 2。病原菌在 pH值为 5.8 ～
8.2时均能生长 ,在 5.8 ～ 6.8之间生长速度较快 ,最
适 pH值为 6。在 PDA培养基上菌落平均生长直径
8.16 mm/d以上 ,说明病原菌适宜在微酸性环境中
生长 。在 pH5.8 ～ 6.8之间 ,菌落稀疏 ,正面白色 ,
有少许绒毛状突起 ,反面内环棕色 ,有环;而在 pH
6.8 ～ 8.2之间 ,菌落形态稍有不同 ,即菌落绒毛状 ,
反面淡黄色 ,平均生长直径在 8.16 mm/d以下 ,说
明病原菌不适宜在微碱性环境下生长。
表 2　pH值对病原菌生长的影响
温度
℃
pH值
24h 48h 72h 96h 120h
菌落平均生长
速度 / (mm/d)
5.8 12.40 19.20 28.50 37.50 52.60 10.51
6.0 13.60 23.60 34.00 41.90 55.50 11.10
6.4 11.20 15.82 24.60 36.20 46.40 9.28
6.8 10.00 17.60 22.50 32.70 41.70 8.34
7.0 10.20 14.90 20.30 28.40 35.60 7.12
7.3 9.10 12.80 18.90 225.60 32.90 6.58
7.6 8.00 10.00 17.30 25.80 31.60 6.50
8.2 7.60 9.10 15.50 22.30 29.50 5.90
2.4　不同碳源对病原菌生长速度的影响　菌落在
葡萄糖 、蔗糖 、麦芽糖 、乳糖 、淀粉 、甘露醇作为碳源
·5·中国森林病虫　2009年 1月　第 28卷　第 1期
的培养基和无碳源培养基上都能正常生长 ,但菌落
的形态特征稍有差异 。比较菌落的形态特征和生长
速度 ,乳糖为最佳碳源 ,蔗糖和甘露醇次之 ,见表 3。
表 3　不同碳源对病原菌生长速度的影响
碳源
菌落直径 /mm
24 h 48 h 72 h 96 h 120h
平均生长
速度 /(mm/d)
葡萄糖 8.70 15.50 24.50 30.50 38.20 7.64
蔗糖 8.90 17.50 27.0 33.00 40.70 8.14
麦芽糖 8.70 15.75 25.00 31.00 38.70 7.74
乳糖 9.00 17.00 28.00 34.00 41.70 8.34
淀粉 8.70 15.50 24.50 30.50 38.20 7.64
甘露醇 9.10 17.50 27.00 33.00 40.70 8.14
无碳源 8.80 16.00 26.00 32.00 39.70 7.94
2.5　不同氮源对病原菌生长速度的影响　菌落在
硝酸钙和蛋白胨作为氮源的培养基上扩展最快 ,在
表 4　不同氮源对病原菌生长速度的影响
氮源
菌落直径 /mm
24 h 48 h 72 h 96 h 120h
平均生长
速度 /(mm/d)
门冬酰胺 8.00 15.00 22.00 29.00 36.30 5.60
蛋白胨 8.50 16.50 25.00 42.30 40.00 8.00
硝酸钙 8.80 16.80 25.50 42.30 41.20 8.24
L-天冬酸 8.50 16.00 23.00 31.50 38.50 7.70
甘氨酸 6.50 12.00 16.50 18.50 20.50 4.10
尿素 0 0 0 0 0 0
无氮源 0 0 0 0 0 0
尿素培养基上和无氮源的培养基上基本不生长 ,不
能形成菌落。比较菌落的形态特征和生长速度 ,蛋
白胨为病原菌的最佳氮源 ,见表 4。
3　结论与讨论
3.1　杜松枯梢病病原菌　据柯赫氏证病法则和病
原菌形态特征证明杜松枯梢病是由桧色二孢引起 。
3.2　杜松枯梢病病原菌的生物学特性　病原菌的
适生温度为 15 ～ 35 ℃,生长最适温度为 30 ℃,低于
20 ℃菌落生长缓慢 ,低于 15 ℃时完全停止生长。
菌落在 pH值 5.8 ～ 8.2之间均能生长 ,最适 pH为
6,偏酸环境更好 ,微碱性环境下不利于病原菌生长。
不同的碳源对生长无显著影响 ,无碳源也能生长 ,其
中以乳糖为最佳碳源 ,蔗糖次之 。菌丝体在生长发
育时 ,以蛋白胨为最佳有机氮源 ,以硝酸钙为最佳无
机氮源;在尿素作为氮源和无氮源的培养中几乎不
生长 。
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