全 文 ：小麦粒线虫与剪股颖粒线虫单条幼虫 PCR-RFLP检测分析
马以桂 　王金成　蔡国瑞
(天津检验检疫局)
　　摘　要:剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)是牧草、草坪上的重要线虫 , 小麦粒线虫(Anguina tritici)是危害小麦的一
种重要线虫。这两种线虫均可以对寄主植物造成严重危害, 导致产量下降;由于该类线虫大多数时间以幼虫形态出
现, 鉴定种类比较困难。本实验比较两种线虫的虫瘿形态特征 、对单条线虫 DNA进行 PCR扩增 , 并使用 RsaⅠ、MspⅠ、
AluⅠ、HinfⅠ和HaeⅢ五种限制性内切酶对 PCR产物进行了限制性酶切, 通过酶切图谱可以将两种线虫区分开。
关键词:小麦粒线虫;剪股颖粒线虫;PCR-RFLP
1　前言
小麦粒线虫(Anguina tritici(Steinb.)Filip.ct-
Stekn.)和剪股颖粒线虫(Anguina agrostis Steinbuch
Filp ev)都是重要的检疫性线虫 ,都能导致寄主植物
产量严重下降 ,且都是能形成虫瘿的线虫。虫瘿内的
幼虫抗不良环境的能力极强 ,混于种子内的虫瘿是远
近距离传播的主要来源 。这两种线虫的成虫期均很
短 ,在成熟的植物种子或虫瘿中不易被发现;根据幼
虫的形态往往难以鉴定线虫的种类;而结合虫瘿的形
状 、寄生植物 、分布及线虫的 PCR-RFLP 图谱则可以
将两虫线虫区分开。
1　材料来源
小麦粒线虫来自 20 世纪 70年代本实验室保留
的虫瘿 ,虫瘿比健康小麦粒短而粗 ,近球形 ,最初油绿
色 ,后期变为黄褐色至黑褐色 ,顶部有小钩(图 1);切
开虫瘿 ,内含白色丝状物的线虫 ,该批虫瘿中的线虫
已经死亡;剪股颖粒线虫来自 2000年 12月从美国的
剪股颖草籽(Bent grass)中截获的虫瘿 ,虫瘿成雪茄
状 ,黑褐色 ,大小约是正常种子的 2倍(图 2),该批虫
瘿经水浸泡分离到大量活体幼虫。
2　方法和步骤
2.1　切割线虫
将经过洗涤的单条线虫用挑针挑至载玻片上的
去离子水小水滴中 ,用洁净的解剖刀将线虫切成 2-
3段 ,然后用吸管将线虫悬浮液吸入 200μL 的 PCR管
中 ,再用约 7μL 去离子水洗涤解剖刀和载玻片 ,将水
吸入 PCR管中;加入 1.5μL蛋白酶 K和 1.5μLPCR缓
冲液(10×buffer),再补充去离子水至总体积为 15μL。
2.2　冷冻线虫
　　将上述装有线虫悬浮液的 PCR管编号标记后放
入-70℃冷藏箱低温冷冻数小时(或过夜)。
2.3　哺育线虫
将冷冻后的线虫取出 ,迅速放入 PCR仪中(或水
浴锅中),65℃条件下保温 2h ,使蛋白酶 K充分发挥
作用 ,分解线虫的蛋白质;从而使 DNA得以释放。
2.4　蛋白酶 K灭活
将经过哺育的线虫置于 PCR 仪中(或水浴锅
中),95℃条件下保温 10min ,使蛋白酶 K失去活性。
2.5　PCR扩增
将上述反应的产物(DNA模板)8μL 加入到PCR管
中 ,加入相关试剂组成的50μL的反应体系(表1)。然后
将PCR管放入PCR仪中进行DNA片段的扩增(表 2)。
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2004 年　　　　　　　　　　　　　　　　　　检验检疫科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 14卷　第 4 期
作者简介:马以桂(1966-),男 , 1991年毕业于南京农业大学植保专业 ,农学士 、农艺师 ,已发表论文 30 篇。
表1　1个试样的 PCR混合物(50μL体系)组成
　　　溶液 用量(μL) 　　终浓度
10xPCR-缓冲液 5 1×PCR-缓冲液
25mM MgCl2 4 2.0 mM MgClz
2.5 mM dNTP s 2 0.1 mM dNTP s
5μM 上游引物 6 0.6μM 上游引物
5μM 下游引物 6 0.6μM 下游引物
5U/μL Tag-酶 0.4 2 U Tag-酶
DNA 模板 8
去离子水 18.6
表 2　PCR反应程序
反应时间 反应温度(℃) 作用
2.5 min 94 DNA初始变性
40s 94 DNA 变性
40s 58 引物退火
1.5min
72
(40 反应循环) DNA合成(引物延伸)
5 72 DNA合成的最后延伸
数小时 4 保存
＊PCR结束后可立即将样品取出,也可将之暂时放在PCR仪中 ,4℃保存。
表 3　Anguina agrostis和 A.tritici 限制性酶切片段数据(单位:bp)
Anguina
agrostis
PCR产物 RsaⅠ HaeⅢ MspⅠ HinfⅠ AluⅠ
850bp
290
530
180
750
210
720
220
330
200
550
750
Anguina
agrostis
PCR产物 RsaⅠ HaeⅢ MspⅠ HinfⅠ AluⅠ
850bp
140
290
430
185
650
190
270
380
200
590
100
200
450
2.6　电泳
制作 2.0%的琼脂糖胶 ,取PCR反应产物 8μL ,加
入1μL溴酚蓝载样缓冲液(6×TAE 缓冲液 , 60%甘
油 ,0.3%溴酚蓝;4℃保存), 充分混匀后移入梳孔。
样品的两侧分别加入尺度标记(Marker DNA ladder),
使用电压 120V。
2.7　凝胶成像
将电泳后的胶小心地转移到 0.1%EB溶液中染色
30min ,再将胶块小心地转移到凝胶成像仪中 ,打开紫外
灯 ,调节图象的大小和焦距 ,拍照保存(图3 、4)。
2.8　酶切
图 3　Anguina agrostis PCR产物图谱
图 4　Anguina tritict PCR产物图谱
图 5　Anguina agrostis酶切图谱
图 6　Anguina tritici酶切图谱
注:图 5 、图 6中符号表示 M:marker;1:未经酶切的 PCR产物;2:Rsa
Ⅰ ;3:HaeⅢ;4:MspⅠ ;5:HinfⅠ ;6:AluⅠ .
　　根据图 3 、4 各选择图谱较亮的一个管子中的
PCR产物 ,分别用 RsaⅠ 、MspⅠ 、Alu Ⅰ 、Hinf Ⅰ和Hae
Ⅲ5 种限制性内切酶对 PCR产物进行酶切 ,即向
200μL 的 PCR 管中加入 1μL 限制性内切酶 、1μL
Buffer 、1μL 去离子水 、7μL PCR产物 ,放入 PCR仪中 ,
37℃条件下保温 3h ,然后电泳 、凝胶成像 ,获得了线
虫的 ITS-RFLP 指纹图谱(图 5 、6)。
3　结果分析
通过图 3 ～ 6 ,可以清楚地看出 , Anguina agrostis
和Anguina tritici的 PCR产物大小无明显差异 ,大约在
850bp;Msp Ⅰ 、Hinf Ⅰ 、和Alu Ⅰ三种限制性内切酶的
酶切图谱有明显差异(两种线虫的限制性片段大小数
据见表 3),根据上述图谱可以快速准确地将两种线
虫的幼虫分开 。
参考文献:
[ 1] 　沈培垠李红梅等.剪股颖粒线虫.植物检疫.1994.349～ 352
[ 2] 　葛建军.剪股颖粒线虫.中国进出境动植检.1997 ,(3):36～ 37
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2004 年　　　　　　　　　　　　　　　　　　检验检疫科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 14卷　第 4 期