全 文 ：剪股颖粒线虫幼虫形态与分子检测方法
王金成1　马以桂1　周春娜2　杜　宇3　黄国明1　丁元明3　谢　辉2
(1.天津出入境检验检疫局　300456　2.华南农业大学　3.云南出入境检验检疫局)
Molecular identification bentgrass nematode , bying the single juvenile.Wang Jincheng1 ,Ma Yigui1 ,
Zhou Chunna2 , Du Yu3 , Huang Guoming1 , Ding Yuanming3 , Xie Hui2(1.Tianjin Entry-exit Inspection
and Quarantine Bureau , Tianjin 300456 , China;2.South China Agricultural University;3.Yunnan En-
try-Exit Inspection and Quarantine Bureau)
Abstract　Bentgrass nematode , Anguina agrostis ,parasitize the grazing and lawn grass is a kind of dan-
gerous pest.In most cases , only juveniles are isolated from the seed galls infected by Anguina agrostis ,
so molecular techniques are necessary in the species-level determination.Through PCR amplification us-
ing single nematode nucleotide as the template , two internal transcribed spacers , i.e.ITS1and ITS2 ,
were obtained.Sequenced the PCR product and then compared it with the internet-submitted nucleotide
sequences accessing through BLASTN in NCBI website.The comparison results confirmed our morpholog-
ical identification in 2000 , which may imply that ITS regions are applicable in the differentiation of the
nematode species under genus Anguina.
Key words　Bentgrass nematode , PCR , DNA ,nucleotide sequences
摘要　剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)是牧草 、草坪上的重要线虫 ,该线虫在进口草籽中
常以幼虫形态出现 ,与其它粒线虫属幼虫形态相似 ,很难快速鉴定到种。本实验通过对单条幼
虫DNA进行提取和PCR扩增 ,获得其 rDNA的 ITS区域 ,测序后与基因库中的剪股颖粒线虫的
rDNA的 ITS区域序列进行比较 ,其结果与基因库中编码为AF396343.1的核酸序列吻合 ,从而
鉴定为剪股颖粒线虫 。此外 ,还使用 5种限制性内切酶对 PCR产物进行了酶切 ,获得了剪股
颖粒线虫的 ITS-RFLP指纹图谱。
关键词　剪股颖粒线虫　PCR　DNA　序列
　　剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)危害多
种禾本科牧草和草坪 ,造成寄主地上部分产
量严重下降 ,是一种十分危险的线虫[ 1] ,该线
虫主要通过种子作远距离传播 ,我出入境检
验检疫部门多次从进口剪股颖 、画眉草等草
籽中截获该线虫 。由于剪股颖粒线虫的成虫
只能在春季成熟的草籽上出现几个星期 ,在
收获后草籽上则未见到成虫 ,从虫瘿中分离
出的剪股颖粒线虫一般都是 2龄幼虫 。由于
粒线虫属的幼虫之间形态相似 ,难以准确地
鉴定到种 ,开展该线虫的分子生物学检测方
法研究是十分迫切和必要的。
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2005 年第2 期　　　　　　植物检疫　PLANT QUARANTINE　　　　　　Vol.19　No.2
国家食品安全关键技术专项课题(2001BA804A22)
收稿日期:2004-06-15 , 2004-12-02修回
1　试验材料与方法
1.1　线虫来源
2000年 12月天津口岸从进口美国剪股
颖(bent grass)草籽中截获 ,虫瘿放在广口瓶
中室内保存。
1.2　线虫分离与形态学鉴定:
将单个线虫虫瘿放入表面皿中 ,加入适
量水 ,浸泡 24h ,虫瘿释放出线虫 。在显微镜
下镜检 ,进行形态观察与测量 。
1.3　DNA提取
用挑针逐一挑取活体幼虫若干条 ,放入
去离子水中洗涤 3次 ,备用 。在洁净的载玻
片上加 2μL去离子水 ,挑入一条经过洗涤的
线虫 ,用解剖刀将线虫切成2 ～ 3段 ,吸入 Ep-
pendorf管中 ,再用 6μL 去离子水洗涤解剖刀
和载玻片后 ,将水吸入上述 Eppendorf 管中;
加入 1.0μL 10倍稀释 PCR-缓冲液 、1.0μL
蛋白酶K后放入超低温冰箱中 , -70℃低温
冷冻 20min。将冷冻后的线虫取出 ,迅速放
入PCR仪或水浴锅中 , 65℃条件下保温 1 ～
2h ,接着将 Eppendorf管置于 PCR仪或水浴锅
中 ,95℃条件下保温 10min ,使蛋白酶 K失去
活性 。得到单条线虫 DNA模板 。
1.4　PCR反应
引 物 为 PF1 (5′ - CGTAACAAG-
GTAGCTGTAG - 3′)[ 2] 如 PR1 (5′ -
TTTCACTCGCCGTTACTAAGG -3′)[ 3] 。采用
50μL的 PCR反应体系 ,即取 8μL DNA模板 ,
5μL 10 倍 PCR-缓冲液;4μL 25mM MgCl2;
2μL 2.5mM dNTPs;6μL PF1(5μM);6μL PR1
(5μM);0.4μL 5U/μL Taq 酶;18.6μL 去离子
水。PCR反应条件为:94℃初始变性 2.5min ,
依次 94℃变性 40s ,58℃退火 40s ,72℃引物延
伸90s ,进行 40个循环 ,最后72℃下保温 5min。
(PCR仪;DNA Engine ,型号:PTC-200)
1.5　电泳
制作 1.5%的琼脂糖胶 ,取 PCR反应产
物6μL , 加入 1μL 溴酚蓝载样缓冲液(6 倍
TAE缓冲液 , 60%甘油 , 0.3%溴酚蓝;4℃保
存),充分混匀后移入梳孔 。样品的两侧分别
加入 Marker(100bp DNA ladder), 使用电压
80V电泳 1h(或根据胶块的长度确定时间 ,使
溴酚蓝距离胶块末端约 1.5cm)。
1.6　凝胶成像
将电泳后的胶小心地转移到0.1%EB溶
液中染色 30min ,再将胶块小心地转移到凝
胶成像仪中 ,打开紫外灯 ,调节图像的大小和
焦距 ,拍照保存 。
1.7　测序
将上述 PCR产物送大连宝生物公司进
行DNA测序 。
2　结果与分析
2.1　形态学观察鉴定
幼虫蠕虫形 ,食道垫刃型;唇区平 ,口针
弱 ,口针基部球小;中食道球较小 ,纺锤形;尾
圆锥形。虫体测量值如下(20条线虫体值的
平均值):L=765.7μm , a=54.4 , b=4.1 , c=
13.4 ,St=9.6μm 。
2.2　PCR检测
图 1　Anguina agrostis PCR产物图谱
M:marker;1～ 5:Anguina agrostis的 5个重复。
使用 Blastn 生物分析软件将 DNA 测序
获得 768bp 的 DNA序列与基因库中的 DNA
序列进行比较 ,该序列与基因库中的序列相
比 ,其序列中第 78 ～ 750个碱基与基因库中
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2005 年第2 期　　　　　　植物检疫　PLANT QUARANTINE　　　　　　Vol.19　No.2
编码为gi 33306949 gb AF396343.1 Anguina
agrostis 的序列几乎完全相符(Identities=672/
673(99 %),而基因库中的该序列是剪股颖粒
线虫的 ITS1 、5.8S 和 ITS2 区域的全部序列 ,
剪股颖粒线虫 ITS 区域种内保守性好 ,可用
于粒线虫的种类鉴定[ 4] 。因此 ,分子检测证
实该线虫是剪股颖粒线虫 。
2.3　ITS-RFLP
上述方法虽可准确地验证剪股颖粒线虫
的单条线虫形态鉴定结果 ,但测序不仅要耗
费大量资金 ,而且还耗时 ,不能完全适应口岸
快速验放的要求。为此 ,我们使用了 Rsa Ⅰ 、
MspⅠ 、Alu Ⅰ 、HinfⅠ 、和 HaeⅢ5种限制性内
切酶对 PCR产物进行了限制性酶切 、电泳 、
凝胶成像 ,获得了该线虫的 ITS-RFLP 指纹图
谱(图 2)。
图2　Anguina agrostis DNA酶切图谱
M:marker;1:未经酶切的PCR产物;2:RsaⅠ ;
3:HaeⅢ;4:MspⅠ ;5:HinfⅠ ;6:AluⅠ
如果对该属其他种类的线虫的 DNA 也
进行上述 PCR扩增和酶切反应 ,获得类似的
指纹图谱 ,比较指纹图谱的差异 ,有望较快鉴
定粒线虫的种类[ 5～ 7] 。
3　展望
根据粒线虫属不同种的线虫 ITS 区域序
列 ,设计特异引物 , 利用套式 PCR 或多重
PCR技术 ,或许可达到更为快速检测粒线虫
种类的目的。
同样 ,根据粒线虫属各种线虫 ITS 区域
序列的差异 ,也可设计特异引物和特异荧光
探针 ,通过实时荧光 PCR技术对线虫检测 。
由于无需 PCR后处理 ,所以会更大地缩短检
测时间[ 8 ,9] 。
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