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崖柏乙醇提取物抑菌作用的初步研究



全 文 :第31卷 第4期   中 南 林 业 科 技 大 学 学 报    Vol.31 No.4
 2011年4月 Journal of Central South University of Forestry &Technology  Apr.2011
崖柏乙醇提取物抑菌作用的初步研究
郑群明1,2,吴楚材1,谭益民1,吴章文1
(1.中南林业科技大学 森林旅游研究中心,湖南 长沙410004;2.湖南师范大学 旅游学院,湖南 长沙410081)
摘 要: 采用滤纸片扩散法和固体平板培养基稀释法对崖柏叶、木粉及其醇提取物进行体外抑菌试验,研究了
崖柏及其不同浓度醇提取物的抑菌作用,测试了崖柏叶和木粉醇提取物的最小抑菌浓度。结果表明,崖柏叶和木
粉的醇提取物对细菌的抑制作用明显,但对霉菌的抑菌效果不明显。崖柏叶醇提物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌
有显著的抑制作用。崖柏木粉醇提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显,可用于食品的抑菌,也可开
发成药物。
关键词: 生物科学与技术;崖柏;醇提取物;抑菌活性
中图分类号: S791.37 文献标志码: A 文章编号: 1673-923X(2011)04-0066-05
Preliminary study on antimicrobial activity of ethanol extract
fromThuja sutchuenensis
ZHENG Qun-ming1,2,WU Chu-cai 1,TAN Yi-min1,WU Zhang-wen1
(1.Research Center of Forest Recreation,Center South University of Forestry &Technology,Changsha
410004,Hunan,China;2.Colege of Tourism,Hunan Normal University,Changsha 410081,Hunan,China)
Abstract:The disc diffusion assay method and solid medium-flatting cultivation diluted method were used to make
the in vitro antimicrobial test,and the antimicrobial effects of leave,wood powder and different concentration etha-
nol extracts and its minimum inhibitory concentration of Thuja sutchuenensis were surveyed.The results show that
the elcohol extracts of leaves and wood powder had obvious inhibition effects on bacteria,and but they had no obvi-
ous inhibition effects on fungus.The ethanol extraction from leaves had significant inhibition effects on Escherichia
coliand Bacillus subtilis.And the ethanol extraction from wood powder had significant inhibition effects against
Escherichia coli and Staphylococcal aures,so the ethanol extraction could be used as a bacteriostatic agent for food
and to prepare drugs.
Key words:biological science and technology;Thuja sutchuenensis;elcohol extract;antibacterial activity
  柏科Cupressaceae具有止血、镇咳祛痰、扩张
支气管、抑菌、抗肿瘤、抗氧化等广泛的生物活
性[1]。柏科植物抑菌作用的研究较多集中于可作
为药用的侧柏[2-3]、新疆圆柏[4]、圆柏、龙柏[5]等,而
崖柏Thuja sutchuenensis的抑菌、保健作用却未见
报道。
崖柏为柏科崖柏属常绿乔木,为我国特有种。
崖柏树干挺直,树冠塔形,分枝平整;高可达20m,
  收稿日期:2011-01-13
  基金项目:国家林业局重点项目(FR02-2005)
  作者简介:郑群明(1972-),男,江西泰和人,副教授,中南林业科技大学博士研究生,湖南师范大学硕士生导师,主要从事森林保健旅游、
生态旅游和旅游管理研究;电话:13517479978
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2011.04.019
胸径可达2m[6];其木质坚韧、轻巧、耐腐;叶鳞形,
生于小枝之叶斜方状倒卵形,有隆起的纵脊;有的
纵脊有条形凹槽,长1.5mm~3mm,宽1.2mm~
1.5mm,先端钝,尖头内弯,两面均为绿色,无白
粉;生鳞叶的小枝排成平面,扁平;枝条密、开展。
崖柏雌雄同株,花期为4月中旬,当年10月中旬球
果成熟[7-8]。崖柏生长缓慢,年径生长量约0.2
cm。树干挺直,浅纵裂,树冠塔形,木材、枝、叶、果
实散发出较浓烈的香味。根系发达,能生长于裸露
的岩石上,耐瘠薄,喜光,多分布在石灰岩山地的南
坡和西南坡。崖柏已被世界保护联盟(IUCN)评为
世界级的极危物种[9]。自1999年崖柏被重新发现
以来[10],目前的研究主要集中在崖柏种群生态
学[9]、群落生态学[8]、遗传多样性[11-12]及其生物学
特征[13-14]。近几年,我们在调查中了解到崖柏具
有特殊的保健功能,并初步分析了崖柏挥发性有机
物具有特殊功效[15-16]。进一步研究崖柏及其提取
物的功效,可为珍稀物种的保护提供参考。
空气是微生物传播的一个非常重要的媒介[17]。
空气含菌量受气候条件、人为活动强度、地面植被
等多种因素的影响,其中植物的抑菌杀菌作用对空
气含菌量的影响很大[18-19]。利用植物的抑菌杀菌
作用,在生态旅游区合理配置植物种类,确保健康、
安全、舒适的度假环境将成为高端度假地建设的趋
势。探索崖柏的抑菌作用,可为崖柏的综合开发利
用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 供试材料
(1)崖柏叶片:500g,采自广东江门移植的崖
柏新鲜叶片(采样植株生长良好、无病虫害),用蒸
馏水清洗干净,剪碎后用保鲜袋装好,放于4℃冰箱
保存备用。
(2)崖柏木粉:1 000g,采用广东江门藏寿天然
艺术品有限公司于重庆城口境内采集的根雕备用
件,将崖柏树干基部的边材和心材锯成锯末,用保
鲜袋装好备用。
1.1.2 供试菌种
(1)大肠杆菌Escherichia coli;(2)枯草芽孢杆
菌Bacillus subtilis;(3)金黄色葡萄球菌Staphylo-
coccus aureus;(4)鲁氏毛霉Mucor rouxii;(5)黑曲
霉Aspergillus niger。以上菌种均由中南林业科
技大学生物工程实验室提供。细菌于牛肉膏蛋白
陈琼脂斜面培养基上活化(37℃培养24h)。霉菌
于马铃薯葡萄糖斜面培养基上活化(28℃培养48
h)。
1.1.3 仪器与试剂
HG303-4电热恒温干燥箱(南京实验仪器
厂);SHB-3循环水式多用真空泵(郑州杜甫仪器
厂);R-201真空旋转蒸发器(无锡星海王生化设备
有限公司);LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器
(上海申安医疗器械厂);SW-CJ-1G型单人面净化
工作台(苏州净化设备有限公司);SPX-150B-Z型
生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、琼脂、95%
乙醇、氢氧化钠、盐酸、丙酮,以上试剂均为分析纯。
1.1.4 培养基的制备[20]
细菌牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏5g,蛋
白胨10g,NaCl 5g,琼脂15g,水1 000mL,调节
pH7.2~7.4。于0.1MPa,121℃下灭菌30min,
备用。霉菌马铃薯培养基(PDA培养基):去皮马铃
薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000mL将马
铃薯去皮,切成小块,加水1000mL煮沸30min,用
双层纱布过滤,取其滤液加葡萄糖,加琼脂,并加水
补足1000mL,0.1MPa,121℃下灭菌30min备用。
1.2 实验方法
1.2.1 崖柏叶醇提取物的制备
取崖柏叶,于60℃恒温干燥后粉碎。称取粉末
100g,加入300mL 95%的乙醇,回流提取12h。
滤液减压浓缩蒸去乙醇,得崖柏叶醇提物浸膏。用
分析纯丙酮溶解后,配制成不同浓度的供试液,放
入冰箱中保存备用。
1.2.2 崖柏木粉醇提取物的制备
取崖柏木粉,于60℃恒温干燥。称取100g,加
入300mL 95%的乙醇,回流提取12h。滤液减压
浓缩蒸去乙醇,得崖柏木粉醇提物浸膏。用分析纯
丙酮溶解后,配制成不同浓度的供试液,放入冰箱
中保存备用。
1.2.3 菌悬液及含菌平板的制备
将所有供试菌株接入斜面培养基,细菌置于
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37℃恒温培养箱内培养24h,霉菌于30℃恒温培养
箱内培养48h活化[21]后,用接种环挑取一环试验
菌种或孢子,放入装有玻璃球的50mL无菌水中,
振摇10min,使菌分布均匀。
将经高温高压(121℃,0.1MPa)灭菌30min的
培养基趁热倒入无菌平板中,待冷却凝固后,用无
菌吸管吸取0.2mL菌悬液接种到平板上,在用无
菌刮铲将菌液涂布均匀,编号备用。
1.2.4 抑菌实验
采用滤纸片扩散法[22]。用打孔器将定性滤纸
打成若干直径8mm的圆片,分装于洁净干燥的小
培养皿内,干热灭菌后,浸在提取液中,备用。用无
菌镊子镊取浸有提取液的滤纸片贴在含菌平板上,
每只含菌平板上中心贴1片,并用浸有丙酮的滤纸
片作对照。每种菌平行做3次重复,放入培养箱恒
温倒置培养,细菌置37℃培养24h,霉菌置于28℃
培养 48h,取出后测量滤纸片抑菌圈直径大
小[23-27],比较抑菌效果。
1.2.5 最小抑菌浓度的测定
采用固体平板培养基稀释法测定[28]。将1mL
样品溶液稀释成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ浓度系列,分
别涂布在固体培养基平板上。待完全吸收后,再在
平板上涂布0.2mL的稀释菌液,,每个浓度做3个
重复,以不加提取液为空白对照,细菌置37℃培养
24h,以完全无菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓
度(MIC),根据 MIC初步确定抑菌浓度范围。
2 结果与分析
2.1 崖柏及其醇提物的抑菌效果
为了比较崖柏叶、崖柏木粉及其醇提物的抑菌
效果,做抑菌圈试验进行比较,结果见表1。
表1 崖柏叶、木粉及其醇提物对供试菌的抑菌效果
Table 1 Antimicrobial effects of leaf,wood and ethanol extract of T.sutchuenensis
样 品
抑菌圈直径(X±SD)/mm
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 鲁氏毛霉 黑曲霉
对照(丙酮溶液) — — — — —
崖柏叶 — — — — —
崖柏木粉 — — — — —
崖柏叶醇提物/(200mg·mL-1) 24.5±0.6  25.9±0.8  13.9±0.6 — —
崖柏叶醇提物/(20mg·mL-1) 7.3±0.6  9.8±0.6  5.0±0.6 — —
崖柏木粉醇提物/(200mg·mL-1) 18.5±0.4  14.9±0.7  17.5±0.4 — —
崖柏木粉醇提物/(20mg·mL-1) 7.5±0.4  4.0±0.3  3.0±0.4 — —
    “—”表示无抑菌圈。
  结果表明,所有样品对霉菌的生长都没有抑制
作用。崖柏叶醇提物和木粉醇提取物对大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有明显的
抑制作用,而崖柏叶和木粉这两种未处理的原材料
对这3种细菌的生长没有抑制作用。崖柏叶醇提
物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌有显著的抑制作用,
当叶醇提物浓度为200mg/mL时,抑菌圈直径分
别25.9mm和24.5mm。崖柏木粉醇提物对金黄
色葡萄球菌有显著的抑制作用,当浓度为200mg/
mL时,抑菌圈直径为17.5mm。
2.2 各样品最小抑菌浓度
我们进一步采用固体平板培养基稀释法,将崖
柏叶醇提物和木粉醇提物样品以2倍的稀释梯度
进行了处理,获得一系列浓度样品,测试了其对大
肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑
菌浓度,结果列入表2。试验表明,大肠杆菌和金黄
色葡萄球菌在崖柏叶醇提物浓度为25mg/mL时,
仍然可以生长,但当叶醇提物浓度达到50mg/mL
及以上时,不再生长,说明该叶醇提物对大肠杆菌
和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50g/mL。
而枯草芽孢杆菌在叶醇提物浓度达到25mg/mL
时,才不再生长,因此,叶醇提物对枯草芽孢杆菌的
最小抑菌浓度均为25mg/mL。同理得出,崖柏木
粉醇提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄
球菌的最小抑菌浓度分别为25、50和50mg/mL。
86 郑群明,等:崖柏乙醇提取物抑菌作用的初步研究   第4期
表2 崖柏醇提物对3种菌的最小抑菌浓度
Table 2 Minimum antimicrobial concentration of elcohol extracts in leaf and wood of T.sutchuenensis
样品 浓度/(mg·mL-1)
测试菌种
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌






200 - - -
100 - - -
50 - - -
25 + - +
12 ++ + ++
6 +++ +++ +++








200 - - -
100 - - -
50 - - -
25 - + +
12 ++ +++ +++
6 +++ +++ +++
      “+++”表示菌生长很多,“++”表示菌生长较多,“+”表示菌生长较少,“-”表示肉眼看不见菌生长。
3 结 论
(1)自然状态下的崖柏叶和崖柏木粉对大肠杆
菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subti-
lis、金黄色葡萄球菌Staphylococcal aures、鲁氏毛
霉Mucor rouxii、黑曲霉Aspergillus niger均没有
抑菌效果。
(2)崖柏叶和木粉的醇提物对细菌的抑制作用
明显,但对霉菌却没有抑制作用。崖柏叶醇提物对
大肠杆菌Escherichia coli和枯草芽孢杆菌Bacil-
lus subtilis有显著的抑制作用,当浓度为200mg/
mL时,抑菌圈直径分别25.9mm和24.5mm。崖
柏木粉醇提物对大肠杆菌Escherichia coli和金黄
色葡萄球菌Staphylococcal aures 的抑制作用明
显,当浓度为200mg/mL时,抑菌圈直径分别为
18.5mm和17.5mm。值得关注的是崖柏木粉醇
提物对金黄色葡萄球菌Staphylococcal aures的显
著抑制作用,这不仅可以用于食品的抑菌,也可开
发成药物。
(3)试验初步证明,崖柏叶醇提物对大肠杆菌
Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis和
金黄色葡萄球菌Staphylococcal aures的最小抑菌
浓度分别为50、25和50mg/mL。崖柏木粉醇提物
对大肠杆菌Escherichia coli、枯草芽孢杆菌Bacil-
lus subtilis和金黄色葡萄球菌Staphylococcal au-
res的最小抑菌浓度分别为25、50和50mg/mL。
崖柏是世界最濒危和古老的物种之一,其抑菌
功效是其得以长期生存在地球上的原因之一,进一
步探索其主要的抑菌成分和作用机理将具有更大
的价值。
致谢:广东江门藏寿天然艺术品有限公司陈奕洪先生提供了
研究材料,中南林业科技大学刘高强博士为试验提供了方便,特致
谢忱。
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(下转至第78页)
96第31卷      中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
似。也有学者指出,菌根对磷营养吸收的改善还间
接地促进宿主对钾元素的吸收,同时根外菌丝从土
壤中直接吸收与运输作用,均可以促进宿主对钾的
总体吸收量以及提高宿主体内钾的含量[9]。此外,
菌丝对土壤钾的直接吸收和向植物根系运输有关。
推测其原因是外生菌根的外延菌丝能直接吸收菌
根根际以外的钾,并运输给寄主植物,使植物的吸
收钾的数量提高。
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[本文编校:邱德勇]
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