全 文 ：了哥王中西瑞香素对照品的制备及鉴定
刘慧琼1，徐祖疆1，王定勇1，陈燕忠2
(广东药学院 1．药科学院;2．药物研究所，广东 广州 510006)
摘要:目的 建立从了哥王［Wikstroemia indica(L．)C． A． Mey］茎皮中制备西瑞香素对照品的方法。方
法 采用萃取、硅胶柱层析和重结晶方法对酶水解后了哥王茎皮的甲醇提取物进行分离纯化，通过 MS、
IR、1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，通过 TLC法和 HPLC法对对照品进行纯度检测。结果 从了哥王
茎皮中分离纯化出西瑞香素对照品，质量分数 ＞ 99． 0%。结论 该方法制备的西瑞香素对照品符合中药
化学对照品的相关要求，可作为了哥王药材及其制剂质量控制用的化学对照品。
关键词:了哥王;茎皮;西瑞香素;对照品;制备
中图分类号:R284． 2 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 01． 010
文章编号:1006-8783(2012)01-0037-03
Preparation and identification of daphnoretins reference substance from
Wikstroemia indica
LIU Hui-qiong1，XU Zu-Jiang1，WANG Ding-yong1，CHEN Yan-zhong2
(1． School of Pharmacy;2． Institute of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou
510006，China)
Abstract:Objective To establish a method for the preparation of daphnoretin s reference substance from
the stem bark of Wikstroemia indica(L．)C． A． Mey．Methods Daphnoretin was isolated and purified from
the MeOH extract of the stem bark of Wikstroemia indica by enzyme hydrolysis，solvent extraction，silica gel
column chromatography and re-crystallization． Its structure was identified by MS，IR，1H-NMR and 13C-
NMR． Its purity was detected by thin layer chromatography (TLC) and high pressure liquid
chromatography (HPLC)． Results Daphnoretin was obtained from the stem bark of Wikstroemia indica with
a purity of more than 99． 0% ． Conclusion Daphnoretin prepared by this method can meet the demands of
chemical reference substances in Traditional Chinese Medicine，which is useful in the quality control of
Wikstroemia indica and its preparations．
Key words:Wikstroemia indica;stem bark;daphnoretin;reference substances;preparation
收稿日期:2011-10-16
作者简介:刘慧琼(1978 －) ，女，硕士，讲师，主要从事天然活性成分研究，Email:moonlhq@ 163． com;通信作者:陈燕忠(1964 －) ，
男，研究员，博士，硕士生导师，主要从事药物制剂研究与新药研发，电话:020-39352501，Email:wdingyong@ 163． com。
网络出版时间:2012-01-09 15:22 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120109． 1522． 003． html
了哥王［Wikstroemia indica(L．)C． A． Mey］为
瑞香科荛花属植物，又名南岭荛花，广泛分布于我国
江西、广东、广西等省区，资源丰富。了哥王根、茎、
叶和果实均可入药，性味苦寒、微辛，具有清热解毒、
消肿散结、散瘀止痛等功效，主治跌打损伤，为民间
常用中草药［1］。据文献报道，了哥王中主要含有香
豆素类、黄酮类、木脂素类、挥发油类、甾体类等化学
成分，其中香豆素类化合物是了哥王的主要有效成
分［2］。现代药理研究表明了哥王具有抗菌［3］、消
炎［4］、抗病毒［5］、抗癌［6］等药理作用，临床上常用的
了哥王制剂有了哥王片、穿王消炎片等。但由于缺
少化学对照品，有关了哥王的质量标准中，尚无其总
香豆素的含量控制指标，了哥王相关制剂的质量控
制标准也很粗糙。因此，迫切需要研制了哥王中 1
种或多种成分的对照品。西瑞香素是了哥王中香豆
素的主要特征性成分，是了哥王消炎、抗病毒、抗癌
的主要有效成分之一［7］，且在了哥王中质量分数较
高。因此，本文从了哥王中提取、分离和纯化西瑞香
素，制备西瑞香素对照品，为制定和完善了哥王及其
制剂的质量标准提供基础。
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Feb． 2012，28(1)
1 仪器及材料
X-6 显微熔点测定仪(未校正，北京泰克仪器有
限公司) ;Nicolet PROTG460 红外光谱仪(KBr 压
片，美国 Nicolet 公司) ;Bruker AM-500 型核磁共振
仪(TMS 为内标，瑞士 Bruker 公司) ;Agilent6120 型
质谱仪(美国安捷伦公司) ;ACQUITY UPLC-FTN /
TUV型高效液相色谱仪(美国 Waters公司) ;摇摆式
高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司) ;RE-
52CS旋转蒸发器(河南省巩义市英峪予华仪器
厂) ;G2X-9240 型电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅
实业有限公司)。
了哥王于 2010 年 10 月采自广东阳春市，由广
东药学院中药学院曾令杰教授鉴定为了哥王
［Wikstroemia indica(L．)C． A． Mey］，标本存放于
广东药学院天然药物化学实验室。色谱用硅胶(青
岛海洋化工厂) ，纤维素酶(广州市前沿化工有限公
司) ，水为蒸馏水，色谱用甲醇为色谱纯，其余试剂
均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 西瑞香素的制备
取了哥王茎皮 1 kg粉碎至 60 目，置于 5 L锥形
瓶中，加入 3. 5 L蒸馏水和 10 g纤维素酶，搅拌至药
粉全部湿润，室温浸泡 24 h，抽滤，80 ℃烘干得到酶
解了哥王茎皮粉(约 0. 85 kg)。将上述酶解了哥王
茎皮粉置于 5 L圆底烧瓶中，以甲醇 3 500 mL 为溶
剂，回流提取 2 次，每次提取 2 h，抽滤，滤液合并后
减压浓缩得浸膏 250 g。将上述浸膏置于 500 mL锥
形瓶中，加入甲醇 300 mL，于 50 ℃下温热溶解，移
置 5 000 mL分液漏斗中，先用石油醚(沸点 60 ～ 90
℃，下同)萃取 3 次，每次 3 000 mL。分离出石油醚
层后，往分液漏斗中的甲醇层按体积比 1∶ 1 加入蒸
馏水，摇匀;再用二氯甲烷萃取 10 次，每次 2 000
mL。收集二氯甲烷萃取液，减压回收溶剂后得二氯
甲烷萃取物 135 g。将二氯甲烷萃取物通过硅胶柱
(100 ～ 150 目，2 kg) (150 mm × 1 500 mm)色谱进
行纯化，依次用洗脱剂 φ110 000 mL、洗脱剂 φ2 50
000 mL和乙酸乙酯 5 000 mL 洗脱，洗脱流速≤6
mL /min，收集 φ2 洗脱液部分 (其中洗脱剂 φ1 由石
油醚和乙酸乙酯按体积比 3∶ 1 组成;洗脱剂 φ2 由石
油醚和乙酸乙酯按体积比 1∶ 1 组成)。将上述 φ2 洗
脱液置于旋转蒸发仪上减压蒸发去除溶剂后得到西
瑞香素粗品(25 g) ，将西瑞香素粗品用甲醇 125 mL
回流溶解，抽滤去除不溶性杂质，滤液重新回流至澄
清后先置于室温 2 h，然后置于 0 ℃冰箱中析晶，24 h
后有大量淡黄色针状晶体析出，抽滤，收集淡黄色针
状晶体，即得西瑞香素纯品(12 g)。
2． 2 对照品的理化性质及结构鉴定
淡黄色针状晶体，mp:250． 0 ～ 251． 5 ℃，在紫外
灯(365 nm)下 TLC 检识呈蓝色荧光。ESI-MS
(negative mode) m/z: 351. 1 ［M-H］-;ESI-MS
(positive mode)m/z:353． 0［M + H］+，374． 9［M +
Na］+;IR νmax(KBr)cm
－1:3 411，1 720，1 616，
1 500，1 275，1 150，1 130，1 020，910，840;1H-NMR
(500 MHz，CDCl3) :δ 6． 33(1H，d，J = 9． 6 Hz，H-
3) ，7． 67(1H，d，J = 9． 6 Hz，H-4) ，7． 46(1H，d，J =
8． 5 Hz，H-5) ，7． 00(1H，dd，J = 8． 5 Hz，2． 1Hz，H-
6) ，6． 96(1H，d，J = 2． 1 Hz，H-8) ，7． 42(1H，s，H-
4) ，6． 84(1H，s，H-5) ，7． 00(1H，s，H-8) ，3． 97(3H，
s，6—OCH3) ，6. 15(1H，s，—OH) ;
13 C-NMR(125
MHz，CDCl3) :δ159． 5(C-2) ，137． 4(C-3) ，129． 3(C-
4) ，107． 2(C-5) ，143． 0(C-6) ，149. 1(C-7) ，103． 2
(C-8) ，147． 9(C-9) ，110. 8(C-10) ，160. 5(C-2) ，
113． 9(C-3) ，138. 4(C-4) ，129. 1(C-5) ，114． 8(C-
6) ，155． 5(C-7) ，104． 9(C-8) ，144． 6(C-9) ，
114. 9(C-10) ，56． 5(6-OCH3)。以上数据与文献
［7］报道的西瑞香素(daphnoretin)相关数据一致。
见图 1 ～ 3。
图 1 西瑞香素对照品的核磁共振氢谱
Figure 1 1H-NMR chromatogram of daphnoretin’s reference
图 2 西瑞香素对照品的核磁共振碳谱
Figure 2 13C-NMR chromatogram of daphnoretin’s reference
83 广东药学院学报 第 28 卷
图 3 西瑞香素的化学结构
Figure 3 The structure of daphnoretin
2． 3 对照品的纯度检测
2． 3． 1 对照品的 TLC 法检査 将对照品用甲醇配
制成 1 mg /mL的溶液，分别点样 5、10、20 μL，分别以
石油醚-乙酸乙酯(体积比 1∶ 2)、三氯甲烷-丙酮-冰醋
酸(体积比 3∶ 7∶ 0． 002)和三氯甲烷-甲醇(体积比 30∶
1)为展开剂，在硅胶 G板上展开。分别在 365 nm紫
外灯、日光下观察以及碘缸中显色观察。结果表明，
在 3种展开剂中对照品均为 1 个斑点，未见其他杂质
斑点，Rf 值分别为 0． 45、0． 55和 0． 65。
2． 3． 2 对照品的 HPLC 法检查 称取西瑞香素
0. 001 g，在甲醇溶液中溶解并定容到 10 mL，得到质
量浓度为 0． 1 mg /mL的样品溶液。取上述样品溶液
1 mL用流动相定容到 50 mL，得到质量浓度为 2 μg /
mL的对照品溶液。色谱柱为 ACQUITY UPLC BEH
C18柱(1． 7 μm，2． 1 mm × 50 mm) ，以甲醇-0. 2%(体
积分数)H3PO4(体积比 55∶ 45)为流动相，流速为 0． 2
mL /min，柱温为 35 ℃，检测波长为 346 nm，对照品溶
液质量浓度为 2 μg /mL，进样量为 1 μL。结果表明，
在该色谱条件下所得 HPLC图谱只有 1 个主峰，保留
时间为 1． 23 min，质量分数以峰面积归一化法计算为
99． 18%。在改变流动相分析及将釆集时间延长数倍
时，均未出现异常峰。RP-HPLC色谱图见图 4。
图 4 西瑞香素对照品的 HPLC图
Figure 4 HPLC chromatogram of daphnoretins reference
3 讨论
实验中釆用了纤维素酶室温酶解技术，使得了
哥王茎皮中大量存在的西瑞香素糖苷类物质先期全
部转化为苷元-西瑞香素，这样大大提高了西瑞香素
的提取得率。萃取阶段萃取溶剂二氯甲烷的选用，
可把大部分非西瑞香素类香豆素化合物排除在外，
简化之后的硅胶柱色谱分离操作。在硅胶柱色谱分
离过程中共使用了 3 种洗脱剂，φ1 洗脱剂去除极性
小的非西瑞香素杂质，φ2 洗脱剂洗脱得到西瑞香素
粗品，配合简单重结晶即可得到高纯度西瑞香素产
品，乙酸乙酯洗脱剂可使色谱柱再生，同时 3 种洗脱
剂使用后可通过减压蒸馏回收实现再利用。上述创
新性成果使得分离得到的西瑞香素质量分数高达
99%以上，可为制定和完善了哥王及其制剂的质量
标准提供西瑞香素对照品。同时本方法操作简便、
工艺简单、原材料可循环使用、产率高，适合大规模
工业化生产。
致谢:广州来普达克生物技术有限公司提供部
分经费支持，广东省海洋与渔业环境监测中心谢海
平主任测试对照品纯度，在此表示诚挚谢意。
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(责任编辑:刘晓涵)
93第 1 期 刘慧琼，等．了哥王中西瑞香素对照品的制备及鉴定