全 文 ：第 28 卷　第 6期
2006 年 11 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.28 , No.6
Nov., 2006
收稿日期:2005--10--20
http: journal.bjfu.edu.cn
基金项目:“十五”国家科技攻关项目(2001BA302B).
第一作者:李国平 ,博士生.主要研究方向:离子束植物生物技术.电话:0371--67767728　Email:ptlgp@sina.com　地址:450052河南郑州市
大学路 75号郑州大学离子束生物工程省重点实验室.
责任作者:黄群策 ,教授 ,博士生导师.主要研究方向:生物技术与作物育种 .电话:0371--67766836　地址:同上.
油杉花粉发育进程的共聚焦显微镜观察
李国平1 ,2　黄群策1　秦广雍1
(1郑州大学离子束生物工程省重点实验室　2莆田学院环境与生命科学系)
摘要:油杉为我国特有易危树种.为探究油杉花粉发育过程 , 其花粉样品经荧光染料曙红和 Hoechst 33342 双染并以
冬青油透明后 ,在激光扫描共聚焦显微镜下观察.结果表明:单核小孢子经过连续 4次有丝分裂后形成 5--细胞型花
粉粒 ,成熟花粉由 2 个退化的原叶细胞 、1 个精原细胞(体细胞)、1 个不育细胞(柄细胞)和 1 个管细胞组成.应用激
光扫描共聚焦显微术结合荧光染色技术能更清晰地显示出油杉花粉发育过程中的核相变化 , 观察效果远较常规的
醋酸洋红染色法理想.此技术可用于其他花粉发育阶段的鉴定.
关键词:激光扫描共聚焦显微镜 , 油杉 ,花粉 , 有丝分裂
中图分类号:Q945;S718　　文献标识码:A　　文章编号:1000--1522(2006)06--0151--04
LI Guo-ping1 , 2;HUANG Qun-ce1;QIN Guang-yong1.Application of confocal microscopy to the
assessment of pollen development stage in Keteleeria fortunei.Journal of Beijing Forestry University
(2006)28(6)151-154 [ Ch , 16 ref.]
1 Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio-engineering , Zhengzhou University , 450052 , P.R.
China;
2 Department of Environment and Life Science , Putian University , Fujian Province , 351100 , P.R.China.
Keteleeria fortunei (Murr.)Carr.is a vulnerable endemic species to China.Using laser scanning
confocal microscope(LSCM)technique , this study examined the whole development stages of pollen in K.
fortunei.Pollen samples were treated with double fluorescence staining with Eosin and Hoechst33342 ,
followed by methyl salicylate clearing.The results reveal that pollen development consists of several distinct
stages.Each uninucleate microspore undergoes four times asymmetric mitotic division(the microspore mitosis)
to give rise to a mature pollen grain containing two degenerated prothallial cells , a body cell , a stalk cell , and
a vegetative cell.The application of confocal microscopy in conjugation with fluorescence staining produces
superior images to the traditional acetocarmine staining of pollen and highlights the nuclei at all stages of pollen
development.This technique represents an efficient tool for the assessment of nuclear status of pollen grains.
Key words　laser scanning confocal microscope(LSCM), Keteleeria fortunei (Murr.)Carr., pollen , mitosis
　　油杉(Keteleeria fortunei(Murr.)Carr.)主要分布
在我国广东 、广西 、福建 、浙江南部沿海山地 ,为我国
特有树种 ,是古老的孑遗植物 ,具有重要的经济与研
究价值[ 1-2] .油杉已被列为易危 (VU)种[ 3-4] .近 20年
来 ,我国在裸子植物特有属种的胚胎发育研究方面
获得了突出的成果[ 5] .油杉属(Keteleeria)中云南油
杉(K.evelyniana Mast)的胚胎学研究曾有报道[ 6-7] .
关于油杉的苗木繁育 、结构解剖 、核型等方面已有报
道[ 8-10] .为了从雄球花发育这个角度探究油杉有性
生殖过程与物种濒危的关系 ,我们曾用常规压片法
和整体染色透明法对油杉小孢子的发生和雄配子体
的发育过程进行了较详细的观察 ,但鉴于普通光学
显微镜在分辨率 、成像清晰度和深度识别能力等方
面的局限性 ,油杉花粉发育过程中的一些主要细节
仍不甚清楚.激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning
confocal microscope , LSCM)具有独特的共轭成像装
DOI :10.13332/j.1000-1522.2006.06.028
置 、无损伤连续光学切片和图像三维重组等功能 ,已
成为研究植物细胞结构与功能的常规技术和不可替
代的工具[ 11-14] .本文应用激光扫描共聚焦显微镜术
对油杉花粉发育过程进行观察.
1　材料与方法
实验材料取自福建省莆田市东岩山上 1棵树龄
约为 55年的油杉植株.采取定点 、定株 、定向 、定时
采集样品.采样时间为2005年1月 20日 —2005年 2
月15日 ,每日上午 1次 ,每次随机采 20 ～ 30个小孢
子叶球序 ,均取自树冠中部东南方向的枝条.仔细剥
去外部包裹的鳞片 ,迅速固定于 FAA 液(V(50%酒
精)∶V(冰醋酸)∶V(36%甲醛溶液)=89∶6∶5的溶
液),贮存于4℃冰箱.
挤破小孢子叶球 ,收集花粉于 1.5 mL 离心管
中.以曙红-Hoechst 33342 双染法进行荧光染色 ,即
先以 1%曙红水溶液染色 6 ～ 12 h ,再以用柠檬酸-
磷酸氢二钠缓冲液(0.1 mol L , pH5.0)配制的 20μg
mL Hoechst 33342在黑暗中染色 12 ～ 24 h.经染色的
材料用浓度梯度酒精脱水 ,最后以冬青油透明[ 15] .
制片时吸取1滴花粉材料于载玻片上 ,再滴丁香油 ,
盖上盖玻片 ,指甲油封片.所有制片用配置有 Leica
DMIRE2研究型电动倒置显微镜的 Leica TCS--SP2型
激光扫描共聚焦显微镜观察 ,用 Ar Ar Kr 激光器的
488 nm 激光激发 ,伪彩色均采用绿色.用 LSC软件
(Leica Confocal Software)分析处理所取图像.以制片
的多数发育期确定为当日花粉的发育时期.
2　结果与分析
油杉小孢子于 2月15日从四分体中释放出来 ,
刚释放出来的小孢子具单个核 ,核居中(图版 Ⅰ-1).
随着花粉的发育 ,细胞质逐渐液泡化 ,同时细胞核逐
渐移向近极面 ,5 ～ 6 d后进入单核靠边期(图版 Ⅰ-
2).花粉在单核靠边期持续 9 ～ 10 d ,3月1日始进行
4次连续的有丝分裂.第 1次有丝分裂(图版 Ⅰ-3)
的结果形成 2个不等的细胞 ,其中近极面的较小的
细胞称为第 1原叶细胞 ,逐渐呈凸透镜状贴近壁的
内侧 ,另一个较大的细胞为胚性细胞 ,其细胞核在近
极面(图版 Ⅰ-4).胚性细胞又进行一次不等的分裂
(图版 Ⅰ--5),形成第 2个原叶细胞和精子器原始细
胞 ,第 2个原叶细胞亦逐渐呈凸透镜状 ,紧靠第 1原
叶细胞(图版Ⅰ-6).大部分花粉中的 2个原叶细胞
形成后即退化成线状结构.但有一些花粉发育过程
中其 2个原叶细胞退化较慢 ,至 3-细胞花粉阶段仍
可清晰观察到原叶细胞具完整的细胞核和细胞质
(图版 Ⅰ-7).精子器原始细胞位于中央 ,较大 ,其细
胞核亦在近极面.精子器原始细胞再进行 1次分裂
(图版Ⅰ-8),形成生殖细胞和管细胞 ,管细胞占据大
部分面积 ,呈厚底浅口的杯状体 ,生殖细胞位于管细
胞的杯口之中(图版 Ⅰ-9).至 3月 10—11 日 ,生殖
细胞又进行 1次分裂(图版 Ⅰ-10 , 11),形成精原细
胞(体细胞)和不育细胞(柄细胞),不育细胞较精原
细胞小 ,呈椭圆形至透镜形 ,紧贴着精原细胞 ,靠近
花粉的近极端(图版 Ⅰ--12).这样 ,油杉小孢子经 4
次连续的有丝分裂形成了包含 2个退化原叶细胞 、1
个不育细胞 、1个精原细胞和 1个管细胞的 5-细胞
型花粉.3月 13日 ,油杉花粉成熟并开始散粉.
3　结　　论
1)油杉成熟花粉粒内含 5个细胞 ,属于油杉型
花粉.松杉类植物中成熟花粉属于油杉型的还有冷
杉属(Abies)、雪松属(Cedrus)、落叶松属(Larix )、云
杉属(Picea)、金钱松属(Pseudolarix).
2)油杉小孢子在进入有丝分裂之前 ,除了进行
物质上的储备外 ,一个重要的变化是细胞核移至近
极面 ,小孢子细胞核位移而建立起的极性被认为是
大多数植物小孢子不对称分裂的前提条件之一[ 16] .
小孢子 4次有丝分裂都是不对称的平周分裂 ,结果
形成的 5个细胞在大小 、形态 、结构和命运等方面都
有明显差异.两个原叶细胞最终退化成仅具线状细
胞壁 ,花粉发育过程中 2个原叶细胞的退化可能是
一种细胞程序性死亡 ,其机制有待进一步研究.管细
胞呈杯状体 ,花粉萌发时将形成花粉管.精原细胞
(体细胞)和不育细胞(柄细胞)紧贴在一起 ,位于管
细胞的杯口之中 ,在雄配子体发育过程中 ,精原细胞
将再进行一次分裂形成 2 个精子 ,不育细胞则退化
消失.
3)与传统显微镜相比 ,激光扫描共聚焦显微镜
在分辨率 、灵敏度 、成像清晰度等方面大大地提高 ,
而且可以对样品进行无损伤光学系列扫描 ,进而可
以应用相关图像处理软件对连续光学切片进行三维
重建 ,体现样品空间形态结构.本文研究表明 ,花粉
样品经曙红-Hoechst 33342双染后以冬青油透明 ,在
激光扫描共聚焦显微镜下高清晰地显示出油杉小孢
子有丝分裂过程 ,细胞轮廓清晰 ,结构层次明显 ,观
察效果远较常规的醋酸洋红染色法理想.激光共聚
焦扫描显微镜技术将为花粉生物学的研究提供有价
值的新资料 ,推动植物生殖生物学的发展.
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153第 6期 李国平等:油杉花粉发育进程的共聚焦显微镜观察
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