全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:522-526
文章编号:1001-6880(2008)03-0522-05
　
　
　收稿日期:2007-03-29　　　接受日期:2007-06-14
＊通讯作者 Tel:86-451-86605353;E-mail:dzm1956@126.com
了哥王中西瑞香素的提取分离及抗肿瘤作用研究
杨振宇 ,郭　薇 ,吴东媛 ,杜智敏＊
哈尔滨医科大学附属第二医院临床药物研究所 黑龙江省高校重点实验室 , 哈尔滨 150086
摘　要:研究西瑞香素(daphnoretin)的体外抗肿瘤作用。采用溶剂提取法 、硅胶柱层析 、重结晶法从中药了哥王
中分离西瑞香素并用薄层色谱法和高效液相色谱法测定纯度。应用 MTT法观察不同浓度的西瑞香素对体外培
养的人肺腺癌细胞 AGZY-83-a、人喉癌细胞 Hep2和人肝癌细胞 HepG2的抑制作用。采用激光扫描共聚焦显微
镜(LSCM)观察细胞形态的变化并检测细胞内钙离子浓度。经紫外光谱 、质谱和核磁共振光谱确定提取分离西
瑞香素的结构 ,其纯度为 99.75%。西瑞香素对体外培养的人肺腺癌细胞 AGZY-83-a、人喉癌细胞 Hep2和人肝
癌细胞 HepG2均有明显抑制作用 , 且呈浓度依赖性。其对上述三种肿瘤细胞的半数抑制浓度 IC
50
值分别为
8.73、9.71和 31.34μg/mL。激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测结果表明应用西瑞香素处理肿瘤细胞 72 h
后 , 细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.05)。西瑞香素体外对人肺腺癌细胞 AGZY-83-a、人喉癌细胞 Hep2和人
肝癌细胞 HepG2均有明显抑制作用 , 机制可能与细胞内钙超载有关。
关键词:西瑞香素;提取分离;抗肿瘤作用;MTT;激光扫描共聚焦显微镜
中图分类号:R285.5;Q946.91 文献标识码:A
StudyonExtraction, IsolationandAnti-tumorActivityof
DaphnoretinfromWikstroemiaindica
YANGZhen-yu, GUOWei, WUDong-yuan, DUZhi-min＊
InstituteofClinicalPharmacyandPharmacology, theSecondAffiliatedHospitalofHarbin
MedicalUniversity, Harbin150086 , China
Abstract:Toinvestigatetheanti-tumoractivityofdaphnoretininvitro, daphnoretinwasobtainedfromWikstroemiaindica
bymeansofextractingwithalcohol, separatingwithsilicagelandrecrystalizing.Thin-layerchromatography(TLC)and
high-performanceliquidchromatography(HPLC)wereemployedtodeterminethepurityoftheresultantsubstance.
Chemicalstructureofthedaphnoretinwaselucidatedbyultravioletspectrometry(UV), massspectrometry(MS)and
nuclearmagneticresonance(NMR), andtheresultswereinagreementwiththereference.Thepurityofthedaphnoretin
was99.75%.MTTassaywasappliedindemonstratingeffectonanti-tumoreffectofAGZY-83-a, Hep2 andHepG2 cel
linesindiferentconcentrations.Theresultsindicatedthatthedaphnoretinhadsignificantanti-tumoractivityonthese
kindsoftumorcelsinexperimentandtheIC
50
valueswere8.73, 9.71and31.34μg/mLinvitro, respectively.Theac-
tionofdaphnoretinwasenhanceddose-dependently.Laserscanningconfocalmicroscopewasappliedtostudyonthecon-
centrationofintracellularcalciumandchangesofAGZY-83-a, Hep2 andHepG2celsinmorphologiccharacterwereob-
served.Thesurvivalratesdecreasedobviouslyafterthreekindsoftumorcellshadbeentreatedwithdaphnoretin(10, 30
μg/mL)for72 h.Onthecontrary, theconcentrationofintracelularcalciumincreasedobviously(P<0.05).Daphnoretin
couldinhibitthegrowthofAGZY-83-a, Hep2andHepG2 cellineswhichisrelatedtooverloadingofcalciumincels.
Keywords:daphnoretin;extractionandisolation;anti-tumoractivity;MTT;LSCM
　　了哥王(Wikstroemiaindica)为瑞香科荛花属植
物 ,始载于 《岭南采药录 》, 性寒味苦 , 微辛 , 有毒 。
功能清热解毒 ,化痰散结 ,通经利水。民间常用了哥
王与其他中草药配伍 ,可用于治疗支气管炎 、肺炎 、
风湿痛 、疮疖痈疽 、恶性肿瘤等。了哥王化学成分复
杂 ,文献报道主要有黄酮类 、香豆素类 、多糖类 、酸性
树脂 、挥发油 、甾体 、皂苷等 [ 1] 。西瑞香素(daphno-
retin)为香豆素类化合物 ,对它的研究多停留在成分
分析上 ,而药效学研究并不多见 ,根据文献报道有抑
制小鼠淋巴细胞白血病 P-388瘤株[ 2] ,降低心肌耗
氧量 ,改善心肌营养性血流量 [ 3] 和激活蛋白激酶
C[ 4]等作用。本试验从了哥王中提取分离西瑞香
素 ,进行了结构确认和纯度检测 ,在此基础上对西瑞
香素进行了抗肿瘤作用研究并 初步探讨了其抗肿
瘤的作用机制。
1　材料与方法
1.1　仪器与试药
X-4数字显示显微熔点测定仪 ,温度计未校正
(北京泰克仪器有限公司);MicroMASSQuatroMi-
croAPI型质谱仪和高效液相色谱仪(616泵 , 996二
极管陈列检测器 , 717自动进样器 ,美国 Waters);
DRX-500型核磁共振仪(德国 Bruker);Bio-Rad3550
型酶标仪(美国 Bio-Rad), Insightplus激光扫描共
聚焦显微镜(美国 Meridian)。
5-氟脲嘧啶注射液(5-FU,上海旭东海普药业有
限公司 ,批号 050615);胎牛血清 (Hyclone产品);
RPMI1640培养基(Gibco产品);四甲基偶氮唑盐
(MTT, Sigma产品), PBS配制成 5 mg/mL,过滤除
菌 ,保存在 4 ℃;Fluo-3 /AM(Bio-Racl产品),配成浓
度为 10μmol/mL, -20℃保存;高效 GF254硅胶板(美
国 Atlanticscientific公司);自制超纯水 , 其它试剂
均为国产分析纯 。
药材购于安徽亳州敬德药材公司 。经哈尔滨医
科大学药学院生药学教研室金锐副教授鉴定为瑞香
科荛花属植物了哥王(Wikstroemiaindica)的干燥根
茎 。
1.2　肿瘤细胞株
人肺腺癌细胞 AGZY-83-a,人喉癌细胞 Hep2,
人肝癌细胞 HepG2。肿瘤细胞株由哈尔滨医科大学
药理学教研室保存。
1.3　方法
1.3.1　Daphnoretin的提取分离
了哥王 1.35kg干燥粉碎过 10目筛 , 75%乙醇
回流提取 2次 ,每次 4 h,趁热过滤 ,滤液减压浓缩 ,
所得残渣加水制成混悬液后 ,依次经石油醚 、乙酸乙
酯 、饱和正丁醇萃取 ,乙酸乙酯层减压干燥得 78.4
g。取干燥后的乙酸乙酯层萃取物 15 g进行硅胶柱
层析 ,以氯仿 -甲醇 (100:0 ～ 90:10)梯度洗脱 , TLC
检识 ,分段收集洗脱液 ,在 98:2梯度下得到黄色絮
状沉淀 ,减压干燥后再次进行硅胶柱层析 。所得淡
黄色粗品重结晶后冷冻干燥 12 h,即得淡黄色针状
晶体 16 mg。经 UV、EI-MS、NMR光谱以及其他物
理化学方法鉴定为 daphnoretin。
1.3.2　Daphnoretin的纯度检测
1.3.2.1　薄层色谱法
将 GF254硅胶板于 110℃活化 30min,取少量 daph-
noretin晶体用甲醇溶解后毛细管点样至薄层板上 ,以
氯仿-丙酮-冰醋酸(30:70:0.02)、石油醚-乙酸乙酯-冰
醋酸(70:30:0.02)和氯仿-甲醇(96:4)作为展开剂 ,进
行展开 ,晾干 ,置 254和 365nm紫外线下检视。
1.3.2.2　高效液相色谱法
取 daphnoretin晶体 1 mg,加 5 mL色谱甲醇溶
解 ,经 0.45 μm微孔滤膜过滤后定容于 5 mL容量
瓶中 ,即为供试液。
色谱条件[ 5] :色谱柱:PhenomenexLUNAC18 ,
4.6 mm×250 mm, 5 μm;流动相:甲醇 /0.2磷酸水
溶液 (55:45);流速:1.0 mL/min;检测波长:346
nm;柱温:室温;进样体积:20μL。
1.3.3　MTT法检测 daphnoretin对 3株人癌细胞增
殖的体外抑制作用
人喉癌细胞 Hep2、人肝癌细胞 HepG2和人肺
腺癌细胞 AGZY-83-a培养于含 10%胎牛血清的 RP-
MI-1640培养基中 ,培养基内含青 、链霉素各 100 U/
mL, 5% CO2 、37 ℃温箱中培养 ,每 2 ～ 3 d传代 1
次。 Daphnoretin以二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,以细
胞培养基稀释 , DMSO稀释后的最终浓度小于
0.05%。取对数生长期细胞以每孔 1 ×104个接种
于 96孔培养板 , 5% CO2 、37℃温箱中培养 24 h使
细胞贴壁后 ,分别设处理组(肿瘤细胞 、daphnoretin
溶液)、空白对照组(与处理组相比较不加 daphnore-
tin,其余相同)、调零组(培养基)及阳性对照组(肿
瘤细胞 、5-FU溶液),每组设 3个复孔。 Daphnoretin
及 5-FU浓度均为 100、10、1、0.1、0.01 μg/mL。继
续培养 72 h后 ,吸去上清 ,每孔加入 180 μL新鲜培
养液 ,再加入 20μLMTT溶液(5mg/mL),继续培养
4h。终止培养 ,小心吸去孔内培养液 ,加入 150 μL
DMSO,置摇床上低速振荡 10 min,使结晶物充分溶
解。在酶联免疫检测仪 495 nm处测量各孔的吸光
度值(A)。根据测得的吸光度值计算抑制率和半数
抑制浓度 IC50。抑制率% =(A对照组 -A处理组 )/
(A对照组 -A调零组)×100%。并在倒置显微镜下观察
对照组与处理组细胞形态学的变化。
1.3.4　激光扫描共聚焦显微镜 Fluo-3/AM染色法
检测细胞内 Ca2 +浓度变化
在铺好单层细胞的 6孔培养板中 ,加入终质量
523Vol.20 杨振宇等:了哥王中西瑞香素的提取分离及抗肿瘤作用研究
浓度为 10、30 μg/mL的 daphnoretin和生理盐水 ,各
设 2个平行孔 ,混匀后 ,置 5% CO2 、37 ℃温箱中培
养 72h后 ,用 0.125%胰蛋白酶消化 , PBS液清洗 ,
加入 100 μLFluo-3/AM染液 , 37 ℃避光放置 1 h。
Fluo-3 /AM被动扩散进入细胞后 ,由酶水解释放出
Fluo-3, Fluo-3可与细胞内 Ca2+络合 ,并且受 488 nm
处的激光激发而产生荧光 ,其荧光值与 Ca2+浓度呈
正相关 ,即以荧光值的变化表示 Ca2+浓度变化 。用
适量 PBS液制成细胞悬液 ,应用激光扫描共聚焦显
微镜在激发波长为 488 nm,发射波长为 530 nm, 40
倍物镜下实时监测 Ca2+浓度的变化 ,对细胞 XY平
面进行扫描 ,计算细胞 XY平面内平均荧光强度
(Fluorescentintensity, FI),以 FI代表 Ca2 +浓度 。
1.3.5　统计学方法
统计学处理采用 SPSS10.0计算 IC50;采用双侧
t检验分析处理组与空白组组间细胞内钙含量的变
化 。
2　结果与分析
2.1　Daphnoretin的鉴定
所得淡黄色针状晶体在紫外下薄层检识呈蓝紫
色荧光;mp.250 ～ 252 ℃;UVλmaxMeOHnm:211,
230, 267, 350;EI-MSm/z:352[ M+ ] , 309, 179;1H
NMR(DMSO-d6 )δ:3.815(3H, s, -OCH3 ), 6.367
(1H, d, J=9.0Hz, H-3′), 8.024(1H, d, J=9.0 Hz,
H-4′), 7.699(1H, d, J=9.6 Hz, H-5′), 7.101(1H,
dd, J=9.6, 2.3 Hz, H-6′), 7.173(1H, s, H-8′),
7.879(1H, s, H-4), 7.218(1H, s, H-5), 6.877(1H,
s, H-8);13 CNMRδ:160.12(C-2), 136.19(C-3),
131.40(C-4), 109.92(C-5), 146.08(C-6), 150.62
(C-7), 103.13(C-8), 147.85(C-9), 110.69(C-10),
160.48 (C-2′), 114.32 (C-3′), 144.52 (C-4′),
130.37 (C-5′), 113.90 (C-6′), 157.44 (C-7′),
104.42(C-8′), 155.43 (C-9′), 114.85 (C-10′),
56.52(-OCH3)。综上分析并与文献[ 6]对照波谱数
据基本一致 ,确定为西瑞香素(daphnoretin)。分子结
构见图 1。
图 1　西瑞香素(Daphnoretin)的化学结构
Fig.1　Chemicalstructureofdaphnoretin
2.2　Daphnoretin的纯度检查
2.2.1　薄层色谱法
在三用紫外分析仪下 254和 365 nm处检视 ,供
试品均为重合的单个斑点且斑点在 365 nm下呈蓝
色荧光。氯仿 -丙酮-冰醋酸(30:70:0.02,图 2a)、石
油醚 -乙酸乙酯-冰醋酸(70:30:0.02,图 2b)和氯仿 -
甲醇(96:4,图 2c)三种展开剂展开后的 Rf值分别
为 0.51、0.45和 0.63。
图 2　西瑞香素的薄层展开结果
Fig.2　ResultsofdaphnoretinseparatedbyTLC
2.2.2　高效液相色谱法
对所获得的 daphnoretin采用高效液相色谱法
进行纯度检测(图 3)。根据面积归一化法计算 ,所
得 daphnoretin纯度为 99.75%。
图 3　西瑞香素(daphnoretin)的高效液相纯度检测色谱图
Fig.3　HPLCchromatogramofpuritytestofdaphnoretin
2.3　Daphnoretin对 3株人癌细胞增殖的影响
MTT检测结果表明 daphnoretin对三种肿瘤细
胞均有明显的抑制作用 ,随着 daphnoretin浓度的增
图 4　Daphnoretin对三种肿瘤细胞生长的抑制作用
Fig.4　Inhibitoryeffectofdaphnoretinonthreekindsoftumor
cels
524 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
表 1　Daphnoretin和 5-FU对三种肿瘤细胞的 IC50(μg/mL)
Table1　IC50 ofdaphnoretinonthreekindsoftumorcells(μg/
mL)
处理药物
Treatingdrug
IC50(μg/mL)
Hep2 HepG2 AGZY-83-a
Daphnoretin 9.71 31.34 8.73
5-FU 7.80 19.04 4.92
大肿瘤抑制率也升高 ,呈明显的剂量依赖性 ,结果见
图 4。对三种肿瘤细胞的半数抑制浓度 IC50见表 1。
阳性对照药物为 5-FU。
2.4　对细胞内钙的影响
Daphnoretin作用 72 h后(图 5),对照组(生理
盐水)几乎所有细胞均为绿色 ,表明细胞内钙离子
水平较低(图 5中 A1、B1、C1);Daphnoretin低浓度
组(10 μg/mL)蓝色细胞逐渐增多并个别有红色细
胞出现 ,表明细胞内钙离子浓度轻度增高(图 5中
A2、B2、C2);Daphnoretin高浓度组(30 μg/mL)细胞
多呈亮黄色和红色 ,表明胞内钙离子明显增高(图 5
中 A3、B3、C3)。由激光扫描共聚焦显微镜扫描细
胞内钙荧光强度值的处理结果见表 2,在 daphnore-
tin10 μg/mL和 30 μg/mL的浓度下处理 72 h后 ,
细胞内钙离子的荧光信号明显比空白对照组生理盐
图 5　不同浓度的 daphnoretin处理三种细胞后细胞内 Ca2+
荧光强度的变化(200×)
Fig.5　TheCa2+fluorescenceinthreecellslinestreatedwith
daphnoretinatdiferentconcentrationsunderLSCM
(200×)
A1 , B1 , C1:Controlgroup:A2, B2, C2:Celstreatedwith10 μg/mL
daphnoretin;A3, B3, C3:Celstreatedwith30μg/mLdaphnoretin
表 2　不同浓度 daphnoretin对三种细胞内钙的影响(x±s)
Table2　Effectofdaphnoretinatdiferentconcentrationsonin-
tracelular[ Ca2+] inthreecelslines(x±s)
细胞种类
Typeofcel
处理药物
Treatingdrug
剂量(μg/mL)
Dosage
Ca2+
(FI)
Hep2 NaCl - 786±101
daphnoretin 10 1231±143＊
daphnoretin 30 1804±246＊
HepG2 NaCl - 318±70
daphnoretin 10 543±72＊
daphnoretin 30 1338±257＊
AGZY-83-a NaCl - 475±50
daphnoretin 10 1565±65＊
daphnoretin 30 2349±248＊
　　注:＊与生理盐水组比较 P<0.05。
水增强 ,高 、低浓度的 daphnoretin与对照组相比均
有显著性差异(P<0.05)。由此可以看出 daphnore-
tin诱导了肿瘤细胞内钙浓度的升高。
3　讨论
　　MTT法为抗肿瘤药物筛选的常用方法 ,简便 、
高效 、可重复性好 。本实验选用与临床结合紧密的
人喉癌细胞 Hep2、人肝癌细胞 HepG2和人肺腺癌
细胞 AGZY-83-a进行细胞毒试验 ,结果发现 daphno-
retin对上述三种肿瘤细胞均有明显的细胞毒性 ,对
人肺腺癌细胞 AGZY-83-a抑制作用显著 ,其次为人
喉癌细胞 Hep2,再次为人肝癌细胞 HepG2细胞 ,均
呈明显的量效关系。其中对人肺腺癌细胞 AGZY-
83-a和人喉癌细胞 Hep2的 IC50均小于 10 μg/mL。
形态学观察表明 ,在高倍镜下可见细胞呈病理性萎
缩和不可逆性损坏 ,随药物浓度增高 ,可见细胞周围
碎片增多 ,而空白对照组未见明显的病理改变。
大量证据表明在多种细胞中凋亡的诱导和抑制
与信号传导通路有关 ,细胞内游离的 Ca2+浓度对信
号传导起着重要作用 [ 7] 。通常情况下导致细胞内
游离 Ca2+浓度升高的方式有两种 ,分别为细胞内钙
池的释放和细胞外钙离子内流。细胞受刺激因素的
作用 , 激活肌醇磷脂信号系统 , 生成三磷酸肌醇
(IP3), IP3与内质网膜上的 IP3受体结合 ,促使内
质网释放 Ca2+,这是 Ca2+浓度显著升高的直接原
因[ 8] 。钙池中 Ca2+的释放使胞浆 Ca2+浓度升高 ,进
而使线粒体内 Ca2+水平升高 ,从而导致细胞色素 C
和凋亡诱导因子的释放 ,激活 Caspase引起细胞凋
525Vol.20 杨振宇等:了哥王中西瑞香素的提取分离及抗肿瘤作用研究
亡 [ 9] 。因此 ,胞浆 Ca2+浓度的增加可作为凋亡起始
的早期信号 。
本实验在 MTT基础上 ,利用激光扫描共聚焦技
术初步研究了 daphnoretin对肿瘤细胞的作用机理 。
LSCM技术是目前研究细胞内 Ca2+浓度变化比较可
靠的方法 ,荧光探针 Fluo-3/AM为一种脂溶性钙荧
光指示剂 ,可穿过细胞膜进入细胞 , 与细胞内游离
Ca2+结合 ,根据荧光强度变化表示 Ca2+浓度的变
化 。本实验中 daphnoretin分别作用于三种肿瘤细
胞 72h后 ,利用 LSCM测定细胞内 Ca2 +浓度 ,发现
三种肿瘤细胞内 Ca2+浓度均明显升高。实验结果
表明 ,在体外 daphnoretin对人肺癌细胞 AGZY-83-a、
人喉癌细胞 Hep2和人肝癌细胞 HepG2的抑制作用
可能与细胞内钙超载有关 。
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