全 文 ：　遗 传 学 报　Acta Genetica Sinica , April 2004 , 31 (4):375 ～ 379 ISSN 0379-4172
收稿日期:2003-05-06;修回日期:2003-09-03
基金项目:日本科技厅 STA 特别研究员项目资助(编号:300037)[ Supported by Science and Technology Agency of Japan(STA)Fellowship(No.300037)]
作者简介:李新国(1965-),男 ,湖北通城县人 ,博士。研究方向:林木遗传育种 、林木基因组和林木功能基因组。 E-mail:lixinguo@bjfu.edu.cn;
Tel:010-62338415
①　通讯作者。
Isolation and Characterization of Nuclear Microsatellites
from Chamaecypress obtusa Endl.
LI Xin-Guo1 , ① , TIAN Jin-Ju2 , Tani Naoki3 , Yoshihiko Tsumura3
(1.Department of Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing　100083, China;
2.Science Co., Ltd , Beijing Forestry Universi ty , Beijing　100085 , China;
3.Genomics Analysis Laboratory , Forestry and Forest Products Research Insti tute , Ibaraki 305-8687, Japan)
Abstract:Using 300 ～ 1 000 bp DNA fragments retrieved from 2% agarose gel electrophoresis on nuclear DNA samples of
Chamaecypress obtusa with Nde Ⅱ restricted digestion , microsatellites were efficiently isolated by using Dynabeads M280 strep-
tavitin beads.These beads could immobilize hybrid products between biotin-labeled (CT)15 probe , and 300 ～ 1 000 bp DNA frag-
ments previously linkaged to Sau3AⅠ cassette.Two enriched microsatellite libraries with about 2 200 positive white clones were
constructed by inserting potential microsatellite fragments into vector pUC118 BamHⅠ/BAP and culturing with host E.coli.After
sequence analysis on 480 randomly picked out positive clones , it was revealed that the number of SSR-bearing clones accounts for
65.6%, and 215 clones were identified as non-homology.Furthermore , 380 microsatellite locus were found in 215 non-homology
clones indicating 1.7 loci per clone.Among the existed microsatellites , the expected type of(GA/CT)n is the most popular which
accounts for 86.1% and were compatible to the(CT)15 probe , however some other types including(TG/AC)n and more complicat-
ed simple sequence repeats with 3 ～ 4 bases , such as(ATAG)n ,(CAGA)n ,(TGA)n ,(ACG)n ,(TCA)n , (TCT)n , could be also de-
tected in these two libraries.Finally , primers for amplifying 128 microsatellite locus from 114 SSR-bearing clones were designed by
Oligo 5.1(http:∥lxg.users4.50megs.com/ ssr.html).
Key words:Chamaecypress obtuse;microsatellites;genomics;sequencing
日本扁柏核基因组微卫星的分离与鉴定
李新国1 , ① , 田金菊2 , 谷尚树3 , 津村义彦3
(1.北京林业大学生物技术系 , 北京　100083;2.北京林业大学林业科技股份公司 , 北京　100085;
3.日本森林综合研究所基因组分析实验室 , 日本筑波　305-8687)
摘　要:以日本扁柏 4个种源的 DNA样品为材料 , 经 NdeⅡ酶切并电泳后回收300～ 1 000 bp DNA片段 , 与含有生
物素标记的(CT)15探针杂交 ,再用磁珠(Dynabeads M280 streptavitin beads)固定杂交产物 , 成功地实现了日本扁柏核
基因组微卫星的高效分离。以 pUC118 BamHⅠ/BAP 为载体 , E.coli 为寄主 , 构建了日本扁柏 2 个富含微卫星的基
因组文库 ,共获得 2 200 多个阳性克隆。从构建的基因组文库中 , 随机挑选 480 个阳性克隆进行测序 ,发现含有微
卫星的克隆比例高达 65.6%, 其中 215 个非同源性克隆共含有 380个微卫星位点 ,平均每个克隆含 1.7 个。微卫星
种类以与探针(CT)15互补的(GA/ CT)n 为主 ,占 86.1%,同时还存在(TG/ AC)n和 3 ～ 4 个碱基为单元构成的微卫星 ,
如(ATAG)n 、(CAGA)n 、(TGA)n 、(ACG)n、(TCA)n、(TCT)n 等。利用Oligo 5.1 软件为114个含有微卫星的克隆共 128 个
微卫星位点设计出了 PCR扩增引物。
关键词:日本扁柏;微卫星;基因组;测序
中图分类号:S718.46　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2004)04-0375-05
　　微卫星(Microsatellites)是指 1 ～ 6个核苷酸为单
元的串联重复序列 ,也叫简单序列重复 (Simple Se-
quence Repeats ,SSR)。近 10多年来 ,国外已从 30多
种林木的基因组中发现了微卫星 ,如欧洲赤松[ 1] 、辐
射松[ 2] 、云杉[ 3 ,4] 、桉树[ 5] 、杨树[ 6] 、日本柳杉[ 7]等 。
微卫星普遍存在于动植物基因组中 ,多态性高 ,能用
PCR检测 ,且为共显性 ,是目前研究和应用较多的分
子标记 ,可以用于林木遗传图谱的构建 、QTL分析 、
基因型鉴别和分子标记辅助育种[ 8 ,9] 。
日本扁柏(Chamaecyparis obtusa Endl.)是优良的
用材及荒山绿化和园林观赏树种 ,是日本重要的造
林树种 ,天然分布区南至鹿儿岛县(30°15′N)北至福
岛县(37°10′N),并被引种到世界上许多国家 ,我国
长江中下游中 、高山地区也已广为栽种[ 10] 。迄今为
止 ,国内外尚无日本扁柏微卫星的研究报道。本研
究旨在对日本扁柏核基因组的微卫星进行高效分
离 ,构建富含微卫星的基因组文库 ,并通过 DNA 测
序进行微卫星鉴定 ,设计 PCR扩增引物 ,为开发日
本扁柏的微卫星分子标记打下基础 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
从日本扁柏天然分布区的伊豆 、扎幌 、名古屋和
南设柴4个种源 ,分别采集 1株优树上的新鲜叶子 ,
立即置于冰筒中 ,并于室内-80℃保存 ,供提取基因
组DNA之用 。
1.2　DNA提取
对采集的各种源叶片样品 ,分别用 CTAB 法和
试剂盒法(DNeasy Plant Mini Kit ,Qiagen , Inc.)提取核
基因组DNA。这两种方法各有优缺点 ,前者获得的
DNA量大但纯度低 ,后者获得的 DNA 量小但纯度
高。将CTAB法获得的 DNA 进行氯化铯梯度离心 ,
以提高其纯度。
1.3　微卫星的高效分离
用限制性内切酶 NdeⅡ消化核基因组 DNA ,并
进行 2%琼脂糖凝胶电泳 。因质粒克隆和测序对插
入 DNA 片段大小的限制 ,本研究只切取含 300 ～
1 000 bp DNA 片段的胶。从胶中纯化 DNA(QI-
AquickGel Extraction Kit ,Qiagen , Inc.), 将其与接头
(Sau3A Ⅰ cassette)连接(TaKaRa LA PCRTM in Vitro
Cloning Kit ,TaKaRa Co., Ltd),并进行末端修复。以
生物素(biotin)标记的(CT)15为探针 ,与上述处理后
的 DNA 进行分子杂交。利用磁珠(Dynabeads M280
streptavitin beads ,Dynal Biotech)固定杂交产物 ,并在
磁场中多次洗脱 ,以洗去未杂交的部分 。在被磁珠
固定的杂交产物中加入 TE缓冲液 ,并在 95℃下变
性 15 min ,再置于磁场中 1 min ,收集液体部分 ,即为
与接头连接的含(GA)n 微卫星的 DNA 片段。沉淀
上述DNA ,以接头对应的引物 Primer C1进行PCR扩
增 ,然后用 NdeⅡ切去接头 ,再进行 2%琼脂糖凝胶
电泳。切下含300 ～ 1 000 bp DNA片段的胶 ,从该胶
中纯化 DNA(QIAquick Gel Extraction Kit , Qiagen ,
Inc.),即为含(GA)n 微卫星的 DNA片段。
1.4　微卫星克隆与基因组文库构建
将含有(GA)n 微卫星的 DNA 片段插入质粒
pUC118的 BamH Ⅰ/BAP位点 ,并转化 E.coli 细胞 ,
利用 LB培养基(加入Amp)进行培养 ,以 IPTG 和 X-
gal为选择性标记 ,筛选白色阳性克隆 ,然后在 Terrif-
ic Broth溶液中培养 ,即为微卫星基因组文库 。
1.5　重组质粒 DNA提取与测序
按照所附的说明书提取重组质粒 DNA(Wizard®
SV 96 Plasmid DNA Purification System , Promega), 用
M13的正向引物和 Big DyeTM Terminator RRMix 对其
进行 PCR 扩增 , 然后用 ABI PRISMTM 3100 Genetic
Analyzer(Applied Biosystems)进行测序。
376 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.31　No.4　2004
1.6　序列分析与微卫星分子标记的引物设计
去除测序区段两头的碱基模糊部分 ,用 Factura
软件删除质粒 DNA 残余碱基。对所有序列进行同
源性检索 ,删除重复的序列 。统计含有微卫星的克
隆比例 、微卫星种类及其比率 ,并用 Oligo 5.1 软件
对微卫星位点的扩增进行引物设计 。
2　结　果
2.1　日本扁柏核基因组微卫星分离
鉴于试剂盒法获得的 DNA量较少 ,将其提取的
4个种源 DNA混合(样品1),并将 CTAB法提取并纯
化的南设柴种源 DNA作为样品 2 ,分别从中分离核
基因组微卫星。经限制性内切酶 NdeⅡ消化后 ,两
个DNA样品均产生大小不等的 DNA 片段(图 1)。
切下含 300 ～ 1 000 bp 片段的胶 ,并纯化出 DNA ,再
与 Sau3A Ⅰ cassette 连接 ,经 PCR检测 , DNA 片段的
长度范围仍在 300 ～ 1 000 bp之内 ,DNA抽提和连接
效果理想(图 2)。以生物素标记的(CT)15与连接产
物杂交 ,经磁珠固定得到与 cassette 连接的含微卫星
的DNA片段 ,再进行 PCR扩增 ,然后用 Nde Ⅱ切去
cassette ,即得到含微卫星的 DNA片段(图 3)。
图 1　DNA样品经 Nde Ⅱ酶切后产生的 DNA片段
M:Marker 5;1:样品 1;2 , 3:样品 2。
Fig.1　DNA fragments after NdeⅡ digestion
from two DNA samples
M:Marker 5;1:Sample 1;2 , 3:Sample 2.
2.2　微卫星基因组文库构建与碱基序列分析
构建的两个微卫星基因组文库中 ,分别有 190
个和 2 000多个阳性克隆 ,随机选取 96个和 384个
克隆进行测序 ,结果表明 ,该文库的微卫星克隆十分
丰富 ,其中第 2个文库中微卫星克隆所占比例高达
图 2　DNA片段与 cassette连接的 PCR检测
M:Marker 5;1:样品 1;2 , 3:样品 2。
Fig.2　PCR detection for linkage of DNA
fragments and cassette
M:Marker 5;1:Sample 1;2, 3:Sample 2.
图 3　经 NdeⅡ酶切后 cassette与微卫星
DNA片段分离
M:Marker 5;1 ,2:样品 1;3～ 6:样品 2 。
Fig.3　Release of microsatellite DNA fragments
after Nde Ⅱ digestion
M:Marker 5;1 , 2:Sample 1;3～ 6:Sample 2.
70.1%,两个文库平均达 65.6%(表 1),因此本研究
成功实现了对日本扁柏核基因组微卫星的高效分
离 。对含微卫星的 315个克隆进行同源性检索 ,发
现有215个克隆为非同源性碱基序列 ,其他 100个
克隆是其重复序列 。统计得出 215个克隆中共含有
380个微卫星位点 ,平均每个克隆含 1.7个 ,最多的
克隆有 6个 。对 380个微卫星位点进行分类 ,结果
见表2 。从表 2可以看出 ,以(CT)15为探针建立的微
卫星文库不仅存在丰富的(GA/CT)n微卫星(327个 ,
占 86.1%),同时还有 44个(TG/AC)n ,并且存在碱
基单元为 3 ～ 4个的重复序列共 9个 。这些特殊的
微卫星多数是伴随(GA/CT)n 出现在同一克隆中 ,但
也有部分是单独存在的。一些微卫星是 GA 或 CT
的 30 ～ 50次重复 ,最多可达 59次。从部分微卫星
克隆的碱基序列(表 3)可以看出:28 号克隆含有 1
个微卫星(AG)25 , 365 号克隆含有 1 个微卫星
(AC)20 ,387号克隆含有 3个微卫星 ,分别为(AG)53、
(GA)7 和(ATAG)6 。
377LI Xin-Guo et al.:Isolation and Characterization of Nuclear Microsatellites from Chamaecypress obtusa Endl.
表 1　日本扁柏微卫星基因组文库中含有微卫星的克隆比例
Table 1　Percentage of SSR-bearing clones in genomic libraries of Chamaecypress obtusa
文　库
Library
测序数
Sequenced clones
含微卫星克隆数
Clones with SSR
无微卫星克隆数
Clones without SSR
序列模糊克隆数
Unclear clones
微卫星克隆比例
Percentage of clones wi th SSR(%)
1 96 46 38 12 47.9
2 384 269 93 22 70.1
总计 Total 480 315 131 34 65.6
表 2　以(CT)15为探针检测到的日本扁柏核基因组微卫星的种类
Table 2　SSR types in genome of Chamaecypress obtusa detected by probe(CT)15
微卫星种类 SSR GA/CT TG/AC ATAG CAGA TGA ACG TCA TCT 总　计 Total
个　数Number 327 44 3 1 1 1 1 1 380
表 3　日本扁柏核基因组部分微卫星克隆的碱基序列(下划线为微卫星)
Table 3　Base sequences of three clones with SSR from Chamaecypress obtusa(lines on the bottom stand for microsatellites)
克　隆 Clone 碱基序列 Base sequence
Cos0028
LGATCCTTGGAAAATAAGACCGTTTACTCTTAGTGCGCTATGCAACACTAAACAACTGTTATGAATACTACTAAATAGGACATG-
CGCCCTATGCTGAAACA AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGTAATTAGG-
GAAAATATAGAGGGTAGGAAGGTGGGAGAGAGAAAATGTGTGTGGGAGAGAGGAGGGGTGAAATAGGGTAATAAAGGA
Cos0365
GATCTTGTCATGTTAATTAGAGTGAGACAACTTACAAAGCCTTCCAAGTTTAATTAAGATAACTAAATTCATATCTAGATAACCA-
TTAAAATTTATAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACATTGTTTTCACATATATTTTTCACTTTTGGATC
Cos0387
GATCCTAATGAATCCTACA AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA-
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG AAGTTCAACTGAGATATAGGGTGAGATAAGTAGAT-
AGAGAGAGGGTTAAGGGAGAAGGTAAGAAAGAGATCTAGGGTAAGAGAAGTAGATAGATAGATAGG GAGAGAGAGAGAGA-
TGCANAGGGGGAGAGGTACGAGAAAAGGTAAGAAAGAGATATAGGGTAAGAGAA ATAGATAGATAGATAGATAGATAG AG -
AGGGGTAATGAGGGAGAGGTAGAGGGC
2.3　日本扁柏微卫星分子标记的引物设计
考虑引物长度 、退火温度 、A+T/G+C 、碱基配
对等限制条件 ,利用 Oligo 5.1软件对含微卫星的
215个克隆共 380个微卫星位点进行引物设计 ,最终
为114个克隆共 128个微卫星位点设计出了 PCR扩
增引物(http:∥lxg.users4.50megs.com/ssr.html),其
余克隆和微卫星位点未能设计出理想的引物 。表 4
列出了部分微卫星位点的正向和反向引物 。这些引
物对应的微卫星位点可以作为开发日本扁柏微卫星
分子标记的基础 ,进而用于遗传图谱构建 、QTL 分析
和其他遗传学研究 。
表 4　日本扁柏核基因组 10 个微卫星位点的 PCR 扩增引物
Table 4　Primers for amplifying 10 SSR loci in Chamaecypress obtusa
微卫星位点
SSR loci
正向引物(5′※3′)
Forward primers
反向引物(5′※3′)
Reverse primers
Cos0004 CCCGCCGCCGCATCTTTTTC CGTGTTGTTCCGCATCTCCA
Cos0013 AGAGAGAAGGGGAAGAGTGT TCCCAAGACCCACTAATCCA
Cos0028 CGCTATGCAACACTAAACAA CCCTCCTCTCTCCCACACAC
Cos0041 GGGAGAGAGGGAGGGGAAGG GGCTCGTATGGTGTGTGGAA
Cos0173 GAATGGAAAGGGAGATAGGT TGCTCCTCTCTCATTATTTA
Cos0187 CAGAGTGGAGGGAGACATAG TTGCGAATGGGAAATGAAGG
Cos0190 GGCTTTCCACTCTAAAAACA TTGCACCACCTACTCTCTCC
Cos0198 GGCTTGTAGTCTATGTATGG GAATAGTTCACTGGAGGTGG
Cos0200 GATCCCAAGTGACTTAGGAC AGATATAAACTCTCCCACAC
Cos0208 TGAGATTGAAAGTTGGAGGG CCTTTATGGCGTTGAGATTG
378 遗传学报　Acta Genetica Sinica　Vol.31　No.4　2004
3　讨　论
分离微卫星一般是先建立基因组文库 ,再用寡
核苷酸为探针进行杂交 , 然后对阳性克隆进行测
序[ 11] ,这种方法通常需要构建较大的文库 ,还需对
文库进行大量筛选。本研究采取与之相反的策略 ,
先以生物素标记的寡核苷酸为探针与 DNA 片段杂
交 ,再借助磁珠的固定作用高效分离出含微卫星的
DNA片段 ,以此构建富含微卫星的基因组文库 ,然
后进行测序 。这样构建的文库富含微卫星 ,不存在
大量筛选克隆的问题 。从构建的两个日本扁柏微卫
星基因组文库来看 ,含微卫星的克隆比例分别占
47.9%和 70.1%,说明以上策略是完全可行的 。第
1个文库的初始 DNA为4个种源 DNA的混合 ,目的
是希望能提高文库中微卫星克隆的比例 ,但实际效
果不如第 2个文库 ,可能与起始 DNA用量以及杂交
产物洗脱强度不同有关。
已有的研究发现 ,林木基因组中最普遍存在的
微卫星是(AG/TC)n 或(AT/TA)n[ 8] 。辐射松基因组
平均每 750 kb就有 1个(AG/TC)n 或(CA/GT)n ,测
序后 80%的亚克隆含混合微卫星 ,TA 是主要的附
加重复单位[ 2] 。本研究以(TC)15为探针也发现了日
本扁柏基因组存在大量的(AG/TC)n微卫星 ,同时还
发现了较多的(CA/GT)n以及少量以 3 ～ 4个碱基为
单元的微卫星 。这些特殊的微卫星并不都是伴随
(AG/TC)n出现在同一克隆中 ,因此有必要用其他探
针研究日本扁柏基因组其他类型的微卫星 ,以便开
发出更多的微卫星分子标记。
在构建的含 2 200多个微卫星克隆的日本扁柏
基因组文库中 ,随机选择了 480个克隆进行测序 ,但
检测到的微卫星种类和数量基本上能代表该基因组
文库 ,因为随着测序数增加 ,新碱基序列与已有序列
的同源性将大大增加 。本研究设计出的 128对引物
可作为开发日本扁柏微卫星分子标记的基础 ,利用
其进行 PCR扩增 ,然后选择多态性高且稳定的位点
即可作为分子标记。在对微卫星克隆的碱基序列进
行同源性检索时 ,发现了日本扁柏基因组微卫星文
库中存在与日本柳杉 、松树等树种的微卫星同源的
碱基序列 ,说明日本扁柏微卫星分子标记也许能用
于亲缘关系较近的其他树种 ,其使用范围可以进一
步扩大 。
参考文献(References):
[ 1 ] 　Kostia S , Varvio S L , Vakkari P , Pulkkinen P.Microsatelli tes se-
quence in a conifer , Pinus sylvestris.Genome , 1995, 38(6):
1244～ 1248.
[ 2 ] 　David S , Michael E D.Occurrence and inheritance of microsatellites
in Pinus radiata.Genome , 1994, 37(5):977～ 983.
[ 3 ] 　Ven W T G , McNicol R J.Microsatellite as DNA markers in Sitka
spruce.Theor Appl Genet , 1996 ,93(4):613～ 617.
[ 4 ] 　Rajora O P , RahmanM H , Dayanandan S ,Mosseler A.Isolation , char-
acterization , inheritance and linkage of microsatellite DNA markers in
white spruce (Picea glauca)and their usefulness in other spruce
species.Mol Gen Genet , 2001, 264(6):871～ 882.
[ 5 ] 　Brondani R P , Brondani C ,Grattapaglia D.Towards a genus-wide ref-
erence linkage map for Eucalyptus based exclusively on highly infor-
mative microsatellite markers. Mol Genet Genomics , 2002 ,
267(3):338～ 347.
[ 6 ] 　Schoot J V D , Pospiskova M , Vosman B , Smulders M J M.Develop-
ment and characterization of microsatellite markers in black poplar
(Populus nigra L.).Theor Appl Genet , 2000 , 101(1/2):317～ 322.
[ 7 ] 　Moriguchi Y , Iwata H , Ujino-Ihara T , Yoshimura K , Taira H ,
Tsumura Y.Development and characterization of microsatellite mark-
ers for Cryptomeria japonica D.Don.Theor Appl Genet , 2003 , 106
(4):751～ 758.
[ 8 ] 　LI Xin-Jun, HUANG Min-Ren , PAN Hui-Xin ,WANG Ming-Xiu.Mi-
crosatellite markers and application in the forest genome.Journal of
Nanjing Forestry University ,1999 , 23(5):64～ 69.
　李新军 , 黄敏仁 , 潘惠新 , 王明庥.林木基因组中的微卫星
(SSR)及其应用.南京林业大学学报 ,1999 , 23(5):64～ 69.
[ 9 ] 　HUANG Qin-Jun , SU Xiao-Hua , ZHANG Xiang-Hua.Microsatellite
markerand its application in tree genetics and breeding.World
Forestry Research ,2002 , 15(3):14～ 21.
　黄秦军 ,苏晓华 ,张香华.SSR分子标记与林木遗传育种.世界
林业研究 , 2002 , 15(3):14～ 21.
[ 10] 　JIANG Ze-Ping , WANG Huo-Ran.Japanese Cedar (Chamaecypress
obtuse)Grown in China.Forest Research , 2000, 13(3):308～ 315.
　江泽平 ,王豁然.日本扁柏生物学及其引种研究.林业科学研
究 , 2000 , 13(3):308～ 315.
[ 11] 　GUO Jian-Chun , HU Xin-Wen , Yanagihara seiji , Yoshinobu Egawa.
Isolation and characterization of microsatellites in Snap bean.Acta
Botanica Sinica , 2000 , 42(11):1179～ 1183.
　郭建春 , 胡新文 , 柳原诚司 , 江川宜伸.菜豆基因组微卫星
DNA 的分离与鉴定.植物学报 , 2000 ,42(11):1179～ 1183.
(责任编辑:陈晓芳)
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