全 文 ：无花果曲霉原生质体形成与再生
条件的探讨*
宛晓春
李
平
(安徽农业大学农业部茶叶生物技术重点开放实验室, 合肥 230036)
丁霄霖
陶文沂
(无锡轻工大学,无锡 214036)
摘要
根据正交试验得出无花果曲霉原生质体形成的最佳条件, 用 1% 的混合酶液
( 0. 5%纤维素酶+ 0. 25%蜗牛酶+ 0. 25%溶菌酶)作用无花果曲霉菌体细胞, 原生质体产
量达 3. 2! 107 个∀ml- 1, 渗透压稳定剂为 0. 6mol∀L- 1KCl于 0. 2mol∀L - 1 PO3+4 ( pH 5. 8)
中,酶解时间和酶解温度分别为 3. 0h、30# . 比较不同酶解时间、再生稳定剂和碳源等因
素对原生质体再生的影响,可确定最佳再生条件,再生率达 30%以上.
关键词
无花果曲霉
原生质体形成与再生
Optimized conditions for protoplast formation and regeneration of Aspergillus f icuum. Wan
Xiaochun, L i Ping ( K ey L aborator y of T ea Biotechnology of M inistry of Agriculture, A nhui
Agr icultural University , H ef ei 230036) , Ding Xiaolin and Tao Wenyi ( Wux i Light Indus

try Univer sity , Wux i 214036) .
Chin . J . A pp l. Ecol . , 1998, 9( 4) : 440~ 442.
Orthogonal experiments w er e designed to study the optimized conditions for protoplast forma

tio n of A sp ergillus f icuum . A 1% mixed solution of enzymes ( 0. 5% cellulase + 0. 25% snail
enzyme + 0. 25% lysozyme) w as used to tr eat the body cells of A . f icuum , and the yield of
protoplast was up to 3. 2 ! 107 individuals∀ml- 1. The optimum osmo tic stabilizer was 0. 6 mol
∀L - 1 KCl containing 0. 2 mol∀L- 1 PO3+4 ( pH 5. 8) , and the optimum duration and optimum
temperature for enzymatic action w as 3. 0h and 30# , respectively. T he optimal conditions fo r
protoplast regeneration were also obtatined, and the r egener at ion rate was over 30% .
Key words
A spergillus f icuum , P rotoplast formation and regeneration.


* 国家∃ 八五%科技攻关资助项目( 85
609
03
02) .


1998- 02- 09收稿, 1998- 05- 11接受.
1
引

言


无花果曲霉是一株液体发酵

葡萄糖
苷酶活( 7~ 8U∀m- 1 )相对较高的菌株, 经
紫外线、亚硝基胍等反复处理筛选而得,考
虑到该菌株对诱变剂的敏感性, 若再用常
规诱变处理将难以提高其酶产量. 本文通
过正交设计试验,研究了无花果曲霉原生
质体形成与再生情况, 采用原生质体技术
对微生物进行改良[ 2, 4] , 以提高产率.
2
材料和方法
2. 1
供试材料
2. 1. 1 菌种
无花果曲霉, 来源于无锡轻工大学
食品科学研究室.
2. 1. 2 培养基
斜面培养基 PDA, 菌丝生长培养
基( GM ) [ 6] ,菌丝再生培养基( RM ) [ 3] .
2. 1. 3 试剂
纤维素酶、蜗牛酶由北京经科化学
试剂公司生产, 溶菌酶由广东省微生物研究所生
产.
2. 1. 4 渗透压稳定液
适量 KCl于 0. 2mol∀L- 1
Na2H PO4 中,用 0. 2mo l∀L - 1 NaH2PO4 调 pH5. 8,
使 KCl终浓度分别为 0. 4、0. 6 和 0. 8mol∀L- 1 .
2. 2
方法
2. 2. 1 菌丝培养
取斜面上生长成熟的孢子, 用
灭菌水制成孢子悬液, 并调整孢子浓度至 4 ! 106
应 用 生 态 学 报
1998 年 8 月
第 9 卷
第 4 期





















CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Aug. 1998, 9( 4)&440~ 442
∀ml- 1以上,取 0. 3~ 0. 5ml接种于表面覆盖有玻
璃纸的GM 固体培养基上, 于30# 培养 16~ 18h.
2. 2. 2 原生质体的分离
用灭菌镊子轻轻揭下长
有幼菌丝的玻璃纸,于酶液中保温 2~ 3h, 然后用
渗透压稳定液稀释,过 G 2漏斗, 1000g 离心, 再经
渗透压稳定液洗涤数次, 收集原生质体, 并显微
计数.
2. 2. 3 原生质体再生
取纯化后的原生质体悬液
经渗透压稳定液稀释适度后, 涂布于高渗( RM )
和低渗( GM )再生培养基平板上, 30# 培养 2~
3d, 观察菌落数,计算再生率.
2. 2. 4 原生质体再生与形成形态观察
在原生质
体形成过程中, 每隔一段时间定时观察, 并作液
体微室培养[ 5] , 观察原生质体再生情况.
3
结果与分析
3. 1
原生质体形成的最佳条件


酶的种类、渗透压稳定剂种类、酶解时
间及酶解温度等均影响原生质体的制备.
选用 16h菌龄之菌丝体作为试验对象, 经
预备试验, 选取酶系统(纤维素酶+ 蜗牛
酶、溶菌酶)、KCl稳定剂、酶解时间、酶解
温度 4个因素, 经正交试验设计(表 1) , 试
验结果如表 2所示.


经正交试验结果(表 2)直观分析得
出,酶系统是影响原生质体形成的重要因
素,且原生质体形成的最佳条件是: 0. 5%
纤维素酶+ 0. 25%蜗牛酶+ 0. 25%溶菌酶
表 1
正交试验的因素水平
Table 1 Factors of orthogonal test
序号
No.
酶系统
Enzyme system
稳定剂
Stabi

lizer
( mol∀
L- 1
KCl)
酶解温度
Tem

pera
ture
( # )
酶解时间
T ime
( h)
1 0. 5%溶菌酶 Lysozyme 0. 4 25 2
+ 0. 25%纤维素酶 Cellulase
+ 0. 25%蜗牛酶 Snail enzyme
2 0. 25%溶菌酶 Lysozyme 0. 6 30 2. 5
+ 0. 25%纤维素酶 Cellulase
+ 0. 5%蜗牛酶 Snail enzyme
3 0. 25%溶菌酶 Lysozyme 0. 8 35 3. 0
+ 0. 5%纤维素酶 Cellulase
+ 0. 25%蜗牛酶 Snail enzyme
表 2
L9( 34)正交表
Table 2 Resul t of L9( 3
4) orthogonal experiment
序号
No.
酶类
Enzyme
稳定剂
S tabi

lizer
酶解温度
T empe

rature
酶解时间
Time
原生质体数量
Protoplast
yield


( ! 106n∀ml- 1)
1 1 1 1 1 0. 68
2 1 2 2 2 2. 01
3 1 3 3 3 1. 72
4 2 1 2 3 3. 27
5 2 2 3 1 2. 05
6 2 3 1 2 0. 81
7 3 1 3 2 4. 21
8 3 2 1 3 4. 36
9 3 3 2 1 3. 06
∋ 4. 41 8. 16 5. 85 5. 79
( 6. 13 8. 42 8. 34 7. 03
) 11. 63 5. 59 7. 98 9. 35
∋ / 3 1. 47 2. 72 1. 95 1. 93
( / 3 2. 04 2. 81 2. 78 2. 34
) / 3 3. 88 1. 86 2. 66 3. 12
R 2. 41 0. 95 0. 83 1. 19
的存在, 酶解时间为 3. 0h, 酶解温度为
30 # ,稳定剂为 0. 6mol∀L- 1 KCl, 经多次
试验,该最佳条件下原生质体产量可稳定
在 3. 0 ! 107个∀ml- 1,最高达 3. 2 ! 107 个
∀ml- 1.
3. 2
原生质体再生的最佳条件


酶解时间对再生率有较大影响,而原
生质体制备与再生的最佳酶解时间不尽相
同[ 1] .试验结果(表 3)表明,获得较高再生
率的酶解时间为 2. 5h.
表 3
不同酶解时间的原生质体再生率
Table 3 Effect of enzymolysis time on regeneration rate
酶解时间 Time( h)
2 2. 5 3. 0
再生率( % ) 12. 3 32. 3 28. 1
Regenerat ion rate


对于曲霉, Kirimura 认为以 0. 7mol∀
L - 1KCl为稳定剂最好[ 7] , Das[ 7]报道0. 6
mol∀L- 1蔗糖是最好的稳定剂. 本文比较
了 5种不同常用再生稳定剂对原生质体再
生率的影响,发现 0. 6mol∀L- 1蔗糖效果最
好(表 4) . 通过再生率比较(表 5) , 在选用
的 4种不同碳源培养基中, 2%淀粉为最佳
碳源.
4414 期






宛晓春等:无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探讨




表 4
不同稳定剂的原生质体再生结果
Table 4 Effect of stabil izer on the regeneration rate
稳定剂
S tabilzer
浓度
Concent ration
( mol∀L- 1)
再生率
Regeneration rate
( % )
KCl 0. 6 24. 1
NaCl 0. 6 21. 0
NH4Cl 0. 4 20. 3
MgSO 4 0. 6 13. 0蔗糖 Sucrose 0. 6 27. 4
表 5
不同碳源下的原生质体再生率
Table 5 Effect of carbon source on the regeneration rate
碳
源 Carbon source 再生率 Regeneration rate( % )
2%葡萄糖 Glucose 22. 0
1%纤维二糖 Cellobiose 15. 0
2%蔗糖 Sucrose 11. 0
2%淀粉 Starch 31. 0
3. 3
原生质体形成与再生的形态观察


当酶解 0. 5h 后, 原生质体开始释放.
最初菌丝顶端细胞壁被酶裂解形成通道,
原生质体由此不断产生, 2h 后菌丝体成片
段,待细胞壁局部完全酶解后,原生质体即
开始原位释放,最后形成大量大小不一的
球状物.陈淑氵员等利用微室液体培养观察
到菌体细胞的 3种再生方式[ 3] , 本文研究
中也观察到此 3 种方式, 且本菌株主要以
出芽链状方式再生. 固体培养时与对照平
板( GM )相比, 再生平板上菌落生长速度
较慢,这可能是由于原生质体要重新构建
出一个完整的细胞壁, 除了需要外界提供
良好的营养环境外, 自身还要有一个适应
过程所致.
参考文献
1
王
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2
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442 应
用
生
态
学
报













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