全 文 ：耐药细菌蛋白质的分泌 新抗攻击的靶点*
官家发* * 范成英 廖连华 (中国科学院成都生物研究所, 成都 610041)
摘要! 几十年来, 由于抗生素的大量使用,导致了细菌对很多药物的抗药性. 为了克服细菌的抗药性问题, 需
要用新的思路去发掘新的抗生素, 包括发掘细菌细胞中存在的抗生素作用的新靶点. 蛋白质的分泌过程对于细
菌是生死攸关的, 它可能成为新药物的适合靶点.
关键词 耐药细菌 蛋白质分泌 新抗靶点
Protein secretion from drug resistant bacteria a suitable target for new antibiotics. GUAN Jiafa, FAN Chengy
ing, L IAO Lianhua ( Chengdu Institute of Biology , Chinese A cademy of Sciences , Chengdu 610041) . Chin. J . A pp l .
Ecol . , 2000, 11( 6) : 947~ 950.
This paper reviewed the pathw ays of bacterial protein secretion and discussed the targets of pathogenic bacter ia for an
tibio tics. I nhibition of protein secretion could lead to the grow th decline, morpholog ical alteration, and reduction of bac
ter ial virulence, as well as the deprivation o f their drug resistant. It was concluded that pro tein secretion could be a suit
able target fo r new antibio tic agents.
Key words Drugr esistance bacteria, Protein secretion, Targ et for new antibiotics.
* 国家知识创新工程试点西南基地项目( 310004) .
* * 通讯联系人.
2000- 03- 03收稿, 2000- 07- 03接受.
1 引 言
30年代和 40年代末期, 磺胺类药物和青霉素类
药物分别开始用来征服病源细菌. 当时人们认为使用
这些类型的药物会永远控制细菌性疾病.现在看来,当
时的想法是太幼稚了.虽然同抗生素问世以前相比,细
菌性疾病的发病率和死亡率已经大幅度下降,但是即
使在发达的美国,每年仍有成千上万的人死于细菌性
疾病,而且仍然是发展中国家人民死亡的主要原因.通
过迅速的适应和进化,微生物已经幸存了千百万年,大
量使用抗生素造成的强大选择性压力, 使得抗药性机
制在普通病源菌中广泛传播[ 8] . 对有些耐药性细菌,
只有很少种类的药物, 甚至根本就没有药物供医生选
择,这种情况在一些公共场所, 如医院、疗养所等是特
别危险的,这些地方存在着免疫力低下甚至完全丧失
的公民,比如艾滋病患者.人类必须发展一些新的抗生
素来对应这种严峻的挑战.
目前广泛用于临床的抗生素是以不同的细胞学过
程为攻击靶点的.氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类
抗生素抑制蛋白质的合成, 内酰胺类、糖肽类抗生素
抑制细胞壁的合成,喹诺酮类抑制 DNA 超螺旋化,磺
胺类药物抑制叶酸的合成.过去 20多年来在临床上使
用的抗生素,实际上都是已知抗生素类药物的家族成
员,只有结构上的区别,新成员比老成员的功效强些,
抗菌谱宽些,甚至能克服部分抗药性.无论是从自然界
筛选的新抗生素还是人工合成的新抗生素, 抗药性的
出现是迟早的事.试想一下那些抑制细菌细胞壁合成
的抗生素, 1987~ 1992年期间, 美国在临床上分离出
的抗青霉素的肺炎链球菌菌株增加了 60倍[ 3] .抗 2,
6二甲氧基苯基青霉素的葡萄球菌和抗万古霉素的肠
道球菌在世界范围戏剧性地增加[ 16] .这些事实警告我
们,必须去寻找全新的抗生素来对付未来的耐药性病
源菌.所谓全新,是指过去不曾主动地攻击过的细胞生
命活动之某一环节[ 9] . 细菌细胞中具有潜力的作用靶
点应具备的条件是: 关系着细菌细胞的生死存亡, 在细
菌细胞内分布广泛, 并且高度保守而在人体细胞中不
存在.换言之,只有那些与致病行为相关的功能才适合
作为理想的新抗生素的靶点.横跨细胞膜的蛋白质的
分泌过程将是最具潜力的新抗的作用靶子[ 39] .
2 细菌蛋白质的分泌途径
细胞与其所处环境的相互作用, 主要是通过蛋白
质来进行的,这些蛋白质要么是在细胞膜上起作用,要
么是穿过细胞膜来起作用.胞外蛋白的功能包括营养
物质的吸收,化学感受,运动性, 附着性以及细胞壁之
合成等.细菌细胞中大约有五分之一的蛋白质部分或
完全在细胞膜外[ 38] . 这些蛋白质的定向分布决定了细
菌细胞的生存和生长. 因为纯化的磷脂膜是不容许极
性的带电的多聚体, 如蛋白质穿过的,所以蛋白质的分
应 用 生 态 学 报 2000 年 12 月 第 11 卷 第 6 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Dec. 2000, 11( 6)∀947~ 950
泌问题实质上是蛋白质如何横跨双层磷脂内部疏水区
的问题.大多数胞外蛋白在开始时是带着一个由 20~
30个氨基酸残基组成的信号肽,经一般蛋白分泌途径
( General secretory pathw ay ) ( GSP) 跨过细胞质膜
的[ 33, 38] .大肠杆菌的 GSP 途径被广泛研究过. 大肠杆
菌属革兰氏阴性菌, 细胞质膜外还有一层外膜,这两层
膜被一层很薄的糖蛋白层分开, 细胞质膜和外膜之间
的空间叫细胞间质. 革兰氏阴性菌的 GSP 途径是负责
将蛋白质转移到细胞间质内,另外的途径再负责将蛋
白质从间质内转移出外膜.革兰氏阳性菌没有细胞外
膜,所以利用 GSP 途径足够将蛋白质分泌到细胞外.
大肠杆菌的 GSP 系统的核心由 3种蛋白质构成,
它们分别叫做 SecA、SecE和 SecY, 这 3种蛋白质对于
蛋白质的分泌以及在胞外重建后显示活性都是必需
的[ 33, 38] .大肠杆菌 GSP 途径的梗概如下: SecA蛋白连
接到前期蛋白的信号肽上[ 1, 6] . 接着部份插入细胞膜,
并驱动信号肽进入膜上由 SecE 和 SecY 组成的孔
内[ 4, 21] . SecA 是一种 AT P 酶, 它连接 ATP 并水解
ATP, 使得 SecA能从由 SecE和 SecY组成的孔内插入
和释放[ 12, 13, 22] . 膜孔的大小没有测定过, 但它能使未
折叠过的前期蛋白方便地通过细胞膜. 前期蛋白横跨
细胞膜的移位过程看来是由 SecA催化ATP 水解所产
生的能量以及细胞膜内外的质子梯度差来驱动的[ 10] .
体外试验表明, ATP 水解明显地参与了蛋白质分泌的
早期过程,并足以使蛋白移位.体外试验还表明细胞膜
内外的质子梯度能戏剧性地增加蛋白移位的速度. 这
种质子梯度在体内对于蛋白质的分泌是必需的[ 15] .前
期蛋白横跨细胞膜以后, 就被位于细胞膜外表的肽酶
将其所带的信号肽切除. 前期蛋白移位过程本身与信
号肽的切除无关,但是缺乏切除信号肽的肽酶的大肠
杆菌死得很快, 其原因可能是未被切除的信号肽尾巴
会影响胞外基础蛋白的功能[ 7] .
致病菌分泌的蛋白常常是一些致病毒性因子, 这
些致病因子参与对寄主的侵染过程[ 14] . 霍乱毒素、白
喉毒素和破伤风毒素就是典型的细菌分泌的毒素蛋
白.这些毒蛋白对于病源菌在寄主体外的生长毫无用
处[ 19, 31] ,但这些由致病菌分泌的致病因子同细胞表面
蛋白一样,常常可被用作疫苗抗体.有人设想将致病因
子的分泌系统作为靶子, 去筛选那些防止专一性病源
菌侵染或消灭这些病源菌的化学药物, 但这种想法过
去并没有引起人们的兴趣.某些毒性因子,比如淋球菌
免疫球蛋白 IgA 蛋白水解酶,经 GSP 途径释放到细胞
间质中以后,不需任何别的分泌系统的协助, 可以直接
横穿细胞外膜[ 23] .通常, 专门化的外膜隧道有助于这
些毒性因子的释放. 肠道细菌菌毛的装配就用了这样
一种系统[ 26] .菌毛是从细菌细胞表面长出的纤维状结
构,用于吸附寄主细胞.欧氏植病杆菌用了另外一种蛋
白分泌途径(通常称为#型分泌途径)分泌出果胶酶和
纤维素酶来降解植物细胞壁,哺乳动物致病菌铜绿极
毛杆菌在分泌细胞毒素 A,脂肪酶和蛋白酶时都是用
的这种途径[ 38] .
某些分泌蛋白不能利用 GSP 途径横跨细胞膜,因
为它们缺乏氨基末端信号肽.这些蛋白质利用了另外
的分泌途径横跨革兰氏阴性细菌的细胞膜. ∃型分泌
途径就是其中之一. ∃型分泌途径有 3 个主要组成部
分:内膜通道、间质衔接物和外膜孔[ 29] . 由∃型分泌途
径分泌的蛋白具有不能切除的羧基末端分泌信号, 它
能识别内膜上的一种蛋白.这种内膜蛋白有一种 ATP
连接盒,这种连接盒就是被称为ABC运输装置的膜蛋
白大家族的特征[ 20] . 这些转运装置广泛地分布于原核
和真核细胞内, 并参与各式各样的过程,比如糖的吸收
(大肠杆菌对麦芽糖的吸收) , 抗原肽的运输(人类淋巴
细胞内质网中 TAP 的运输)以及药物的消除(哺乳动
物多药抗性蛋白) . ∃型蛋白分泌系统的 ABC转运装
置蛋白是怎样同 ATP 的水解过程偶联使得基质横跨
细胞膜目前还不清楚. 同 GSP 途径一样, ∃型蛋白分
泌系统也需要跨膜质子梯度差动力[ 24] . 有人指出, 革
兰氏阴性菌的蛋白靠 ∃型蛋白分泌途径横跨双膜的过
程是一种协同作用[ 24] .
第二种非 GSP 依赖型分泌途径是 %型分泌途径.
一些革兰氏阴性致病菌利用%型分泌途径直接将致病
因子注入哺乳动物细胞[ 28] . 例如,鼠疫耶尔森氏菌抗
吞噬蛋白的分泌,志贺氏菌和沙门氏菌等肠道致病菌
寄主侵入因子的分泌都是利用的%型分泌途径[ 28] . %
型分泌途径比 ∃型途径更为复杂, 它包括细胞间质
ATP 酶, 7种可能的内膜蛋白和至少 1种外膜蛋白.这
种外膜蛋白的成分与 #型途径的外膜隧道是一样
的[ 37] .所以这种外膜成分是一个很具吸引力的目标,
朝向这个目标, 人们有可能筛选到阻断两种完全不同
的蛋白分泌途径,即 #型和 %型蛋白分泌途径的抑制
剂.
用于构建细菌鞭毛的蛋白亚基也是依靠 %型途径
分泌的. 细菌利用鞭毛推动细胞在液体环境中运
动[ 30, 35] .大多数真细菌能够构建鞭毛, 故鞭毛分泌系
统是广泛分布的,在细菌感染的过程中,鞭毛常常起着
很重要的作用, 因为许多致病菌需要在寄主组织中游
动[ 25] .鞭毛的装配是朝着细胞质膜外面进行的[ 17] ;鞭
毛蛋白亚基经%型隧道来到鞭毛基部环的中心[ 35] .分
948 应 用 生 态 学 报 11卷
泌出来的鞭毛蛋白亚基穿过生长轴型结构的中心管道
在其顶部被装配成鞭毛. 因为鞭毛蛋白亚基是通过轴
形管道横跨细胞外膜的, 所以不需要分散的象别的分
泌途径中存在的外膜隧道.
细菌性病源菌演化出各种不同的方法来攻击寄
主,其中包括分泌致病因子[ 14] .除 GSP 途径外, 其它
的蛋白质分泌途径都适合作为靶子去筛选抗革兰氏阴
性病源菌的药物.试想一下铜绿假单孢菌和幽门螺杆
菌引起的病例, 人们就会发现这些专一性的抗微生物
药物会是很有价值的. 铜绿假单孢菌是一种机会致病
菌,它会引起致死性创伤烧伤感染和长期感染囊性纤
维变性病人的肺, 最终导致死亡[ 17] .这种菌对各种抗
生素的抗性是出了名的, 并且通过上述各种蛋白分泌
途径分泌出重要的致病因子.幽门螺杆菌寄生在胃粘
膜上,是大多数胃溃疡和十二指肠溃疡的根本原因.幽
门螺杆菌感染的典型处理方法需要用 3种抗生素, 临
床上已经分离到抗 1种和抗多种抗生素的幽门螺杆
菌.千百万感染了幽门螺杆菌的人就是新型药物的巨
大市场.蛋白质的分泌对于幽门螺杆菌的致病是很重
要的,人们已经观察到幽门螺杆菌的致病力是与其独
一无二的编码多种蛋白分泌途径所需组份的连锁基因
相关的[ 5] ;细胞毒素 VacA是一种分泌蛋白; 在动物模
型中, 要建立幽门螺杆菌的感染, 鞭毛的运动是必需
的[ 11] . 针对铜绿假单孢菌和幽门螺杆菌的窄谱抗生素
可能会对人类健康有着极其深远的影响.
3 阻断蛋白质分泌药物的开发
以 GSP 途径为靶子, 开发抗微生物药物的前景如
何? GSP 的组份及其生物化学活性已经比较明确, 比
如先导肽酶和分泌蛋白 SecA,可以提供出最好的靶子
用于药物的体外筛选. 因为先导肽酶的活性位点是在
细胞质膜的外面,所以直接抗击这种酶的药物没有必
要跨过细胞膜进入细胞中去起作用. 先导肽酶是一种
新颖的丝氨酸蛋白酶[ 36] , 一组抑制大肠杆菌的先导肽
酶活性的化合物已经报导[ 2] . SecA和先导肽酶的结构
没有完全搞清, 所以目前无法作药物设计.但是根据功
能分析可以建立起蛋白分泌抑制剂的广泛初筛模型,
化学合成物库、天然产物库和混合物(微生物发酵液,
中草药粗提物)等大量物质可供筛选.
已经知道, 有两种化合物,叠氮钠和苯乙醇能抑制
分泌蛋白 SecA的功能[ 18, 34] ; 叠氮化合物影响 ATP 酶
的活性,但毒性太大而不具有抗生素的性质. SecA 的
ATP酶对磷酸化作用的抑制剂是敏感的, 对液泡型
ATP 酶和 F0F 1ATP 酶的抑制剂是敏感的; 如果能够
找到 SecA 的活性位点的高度专一性抑制剂, 一般的毒
性是可能回避的.蛋白分泌过程的几个步骤中,都有信
号肽参与. 稳定的信号肽的同系物可以开发来干扰
SecA(或者 SecESecY 复合物, 或者先导酶)与前期蛋
白的天然信号肽的连接.
因为 GSP 的核心组份已经清楚, 故可利用大肠杆
菌无细胞制剂中的 GSP 组份来重现蛋白分泌活性,这
一活性分析系统可以用于蛋白质分泌抑制剂的筛选和
识别.另外,有人建议利用经过遗传重组的完整大肠杆
菌细胞来检测 GSP 活性的抑制剂,有些大肠杆菌完整
细胞可以用于筛选降低蛋白质分泌的化合物[ 32] .由于
目前急需对付革兰氏阳性病源菌的药物, 所以用阳性
菌来建立的筛选方法可能会是很有用的, 但所用的菌
必须是背景清楚,操作方便,如枯草芽孢杆菌或金黄色
葡萄球菌等.近年来,笔者实验室建立和使用的抗耐药
性化合物的筛选模型就是以蛋白质分泌功能为靶子,
用革兰氏阳性细菌的完整细胞来构建的. 该模型设计
严密,简捷灵敏, 可对付大量样本. 作为利用这个模型
的初步研究结果,我们从来自 319株分离自西南地区
特殊生态环境的丝状真菌的培养物样品和来自我所植
化室的 48个纯品药用植物成分中筛选获得 2个阳性
样品,待与华西医科大学合作用多种标准耐药菌和近
期分离自临床的多种耐药菌作抗耐药性验证试验. 大
样本量的筛选工作正在进行之中.
需要指出, 利用完整细胞建立的蛋白质分泌功能
为靶子的筛选模型获得的抗耐药性化合物, 实际上是
一种蛋白质分泌减量剂, 与相应抗生素一起使用, 可能
克服&耐药菌产生分泌抗生素分解钝化酶∋这一生化机
制引起的耐药性,对于由&抗生素靶位的修饰∋、&抗生
素通透性的改变∋、&细胞主动外排∋等生化机制[ 27]引
起的耐药性是无能为力的.但也必须指出, & 耐药菌产
生分泌抗生素分解钝化酶∋的机制是耐药性生化机制
中最普遍的机制.为了获得全面克服耐药性的化合物,
可能应该采用无细胞制剂中 GSP 组分来重现蛋白质
分泌活性,这一活性分析系统可以用于蛋白质分泌抑
制剂的筛选和识别. 笔者实验室正在构建这一活性分
析系统.
蛋白质的分泌功能是寻找新抗的最好靶子之一,
我们对付 21世纪细菌性疾病的能力很可能取决于我
们围绕这个新奇靶点进行药物研究时付出的勤劳和智
慧.
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作者简介 官家发, 男, 1949 年生, 研究员, 主要从事工业、农
业、医药和环保等领域中各种有用微生物菌种的发掘、改良和
应用研究工作.已发表论文 20 余篇. Email: guanjiafa@ 365. com
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