全 文 ：利用定量杂交方法对几个人工和环境
微生物样品的分析研究*
黄立南 陈月琴 周 惠 屈良鹄* *
(中山大学生命科学学院, 基因工程教育部重点实验室, 广州 510275)
摘要 利用真细菌和真核生物两个域特异性探针, 初步建立起 16S rRNA 定量杂交的方法,并对几个人
工 RNA样品(由提取自 S . cer ev isiae 和P . f luor escens 纯培养细胞的 RNA按一定比例混和而成)和一个提
取自垃圾填埋场渗滤液的 RNA样品进行了初步的定量分析.结果表明该方法能从域的水平上对这些样
品的组成作较精确的分析, 从而在微生物生态学领域具有广泛的应用前景.
关键词 16S rRNA 寡核苷酸探针 定量杂交 微生物生态
文章编号 1001- 9332( 2003) 03- 0405- 04 中图分类号 Q78 文献标识码 A
Characterization of several synthetic and environmental microbial samples by quantitative hybridization.
HUANG Linan, CHEN Yueqin, ZHOU Hui and QU Lianghu ( College of Lif e Sciences, K ey Laboratory of Gene
Engineer ing , M inistry of Education, Zhongshan Univer sity , Guangzhou 510275, China ) . Chin. J . A pp l .
Ecol . , 2003, 14( 3) : 405~ 408.
L imitations of tr aditional techniques based on selective enrichment and pureculture isolat ion make it difficult to
pr ecisely char acterize the natural microbial ecosystems. Molecular techniques ar e now being developed and used
to address these limitations. Groupspecific 16S rRNAstar geted olig onucleotide probes of different phylogenetic
levels are increasingly used to identify and quantify the microbial members in complex env ironmental samples.
Two domainspecific pr obes were used in this study to elementarily characterize the defined mix tures of RNAs
extracted from pure culture ( synthet ic samples) and a RNA sample obtained fr om landfill leachate ( environmen
tal sample) . The r esults demonstrated that 16S rRNA quantitative hybridization provided an excellent estimation
of domain lev el community composition of these samples, and thus, had a huge po tential of usefulness in micro
bial ecology studies.
Key words 16S rRNA, Oligonucleotide probes, Quantitative hybridizat ion, M icr obial ecology.
* 国家杰出青年基金项目 ( 39525007 )、国家自然科学基金项目
( 39970063)和广东省自然科学基金资助项目( 011120) .
* * 通讯联系人.
2001- 02- 07收稿, 2001- 04- 20接受.
1 引 言
基于传统纯种培养与分离的微生物鉴定与计数
技术的局限性, 以致迄今仍无法建立起大部分微生
物群落的结构及其功能之间的联系,因为在一个自
然的微生物群落里,通常只有相对很小的一部分可
以用现有的技术所培养[ 3~ 5, 11, 12] .核酸技术正被广
泛应用于环境样品中微生物群落的研究. 其主要基
础是通过对同源生物多聚物的序列的比较分析从而
推断系统发育上的关系[ 14] . rRNA分子是用于有关
比较分析的理想的生物多聚物, 16S rRNA 已被大
量应用于系统树的建立, 而这些系统树反过来又可
作为以 16S rRNA 分子为靶目标的、具有不同系统
发育水平特异性的寡核苷酸探针设计的基础. 1988
年, Stahl等[ 10]首次利用 16S rRNA定量杂交技术监
测牛的胃肠道内特定微生物种群的变化, 同位素标
记的类群特异性寡核苷酸探针与从样品中抽提到的
核酸(主要是 RNA)杂交, 经通用探针的杂交结果校
正,有关微生物类群的相对或绝对丰度即可用杂交
信号的强度(即目标 16S rRNA 分子的丰度)来度
量.迄今为止,对各种厌氧系统内微生物种群和群落
的生态的了解甚少, 因为利用传统技术研究这些严
格厌氧、生长缓慢而生理特征又十分接近的微生物
类群时面临很大困难. 但从实践角度而言,鉴于微生
物在厌氧处理过程中的重要性, 有必要深入了解其
中的微生物种类的组成及其种群动态, 并建立起有
关微生物群落的结构及其功能(如代谢活动)之间的
联系. 应用 rRNA 定量杂交技术能直接检测和定量
复杂生境中的微生物类群,从而摆脱对纯种培养的
依赖,因此, 有关方法在微生物生态领域有着独特的
优势及广泛的应用前景. 鉴于国内至今仍未有涉及
其实际应用的报道, 本文利用人工混和的核酸样品
应 用 生 态 学 报 2003 年 3 月 第 14 卷 第 3 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Mar. 2003, 14( 3)!405~ 408
初步建立起 16S rRNA 定量杂交的方法, 并对一环
境微生物样品作了初步的分析.
2 材料与方法
21 供试材料
211 样品采集 将酿酒酵母( Saccharomyces cer evisiae)和
荧光假单胞菌 ( Pseudomonas f luorescens , 购自中国普通微生
物菌种保藏管理中心, 北京)分别接种至 YPD 和 2YT 液体
培养基中培养至对数期,所得纯培养细胞经离心收集于带螺
旋盖的 1. 5 ml的离心管中, 并贮存于- 80 ∀ 直至核酸抽提.
环境样品采自广州市李坑垃圾填埋场的新填埋区( 1 年
以内)的渗滤液. 样品在现场用具螺旋盖的 500 ml瓶子收集
并立即置于冰浴中, 运回实验室后马上分装于带螺旋盖的
1. 5 ml的离心管中, 离心( 12 000 # g, 4 ∀ , 10 min)、弃上清
后贮存于- 80 ∀ .
212 寡核苷酸探针合成 表 1 给出了本研究所用的 3 种
寡核苷酸探针的名称、相应的靶生物类群及其 Td 值. 所有
这些探针均与其靶生物类群的 SSU rRNA 分子的一定区域
互补,其命名已根据寡核苷酸探针数据库[ 1]进行标化. 探针
在上海生工生物工程公司合成, 用 T4 多核苷酸激酶
( Promega)和[32P] ATP对其 5∃未端进行同位素标记.
表 1 寡核苷酸探针
Table 1 Oligonucleotide probes
探针名称
Probe
name
靶生物类群
Target
group
T d ( ∀ )
通用探针 Universal probe 所有生物 44
S* Univ1390 aA20[15] Virtually all organisms
域特异性探针 Probe for domains 所有真核生物 58
SDEuca0502aA16[2] Virtually all Eucarya
SDBact0338aA18[ 2] 所有真细菌 55
Virtually all Bacteria
22 研究方法
221 核酸抽提 纯培养细胞和垃圾渗滤液样品中的核酸
用机械破碎/酚抽提法提取[ 10] .但样品在重悬于提取缓冲液
后先用液氮冻融数次, 然后加入适量玻璃珠 (直径为 0. 1
mm)和平衡酚,在旋涡混合器 ( IKAMS2Minishaker )上以最
大速度剧烈振荡 3 min; 水相用平衡酚氯仿异戊醇( 100!24
!1,体积比)抽提 2次 ,接着用氯仿抽提数次直至水相和有机
相间看不到其它物质为止.核酸用 0. 5 体积的 7. 5 M NH4Ac
及 2~ 3 体积的乙醇于- 20 ∀ 沉淀过夜, 经离心、漂洗并充
分晾干后重悬于无 RNA 酶的 ddH2O中. 回收到的核酸(主
要是 RNA [ 10] )用分光光度计( Beckman DU530)测定其浓度,
估计 1个单位的 A260 约等于 40 g%l- 1. 之后,按一定比例
将已知浓度的 S . cerevisiae 和P . f luorescens 的 RNA 混和构
成人工样品,分别记作 A、B 和 C(表 2) .
222 滤膜杂交及定量 RNA 样品用 2~ 3 体积的甲酰胺
终止缓冲液变性[ 9] , 然后用稀释水( 1 ml含 0. 02 l 2% 的溴
酚蓝)稀释至 1 ng%l- 1 . 变性 RNA 用点杂交点样器点样至
HybondN + 尼龙膜上( 0. 45m孔径 , Amersham ) , 每样品3
表 2 参照微生物 RNA 系列的杂交信号回归分析
Table 2 Regression analyses of the hybridization signals of the RNAdi
lution series from the reference organisms on each nylon membrane
尼龙膜
Memb
ranes
探 针
Probes
参照微生物
Reference
organisms
回归方程
Reg ression
equat ion
r2 值
r2 value
a S* Univ1390aA20 P. f luorescens Y= 19. 674X - 27. 389 0. 9862* *
a S* Univ1390aA20 S . cerev isiae Y= 16. 192X + 42. 036 0. 9992* *
b SDEuca0502aA16 S . cerev isiae Y= 4. 3294X+ 5. 5572 0. 9978* *
c SDBact0338aA18 P. f luorescens Y= 15. 473X+ 50. 545 0. 9965* *
* * P> 0. 01; Y)杂交信号Hybridizat ion signal; X) 16S rRNA 的量 Amount o f
16S rRNA.
次重复、每重复点样 50 l.为了统一通用探针与域特异性探
针的定量, 每一杂交反应所用的尼龙膜均点上同样的用作参
照标准的 RNA浓度梯度系列[ 7, 8] .标准 RNA 亦是抽提自相
应的参照微生物纯培养细胞的 RNA, 本实验分别用 S . cer e
visiae 和 P. f luor escens 作为 SDEuca0502aA16 和 SD
Bact0338aA18 域特异探针的参照微生物. 点样后的尼龙
膜于室温下晾干, 接着在 80 ∀ 烘箱内烘烤 2 h,然后用铅笔
在尼龙膜上标出 RNA样点的位置. 滤膜先在 40 ∀ 下预杂交
2~ 3 h,然后加入同位素标记的探针并继续杂交 16~ 19 h.
接着, 滤膜用洗膜液( 1% SDS 1 # SSC)在 40 ∀ 下洗2 h, 最
后分别在各探针的 T d值下(表 1)洗 30 min [ 8] .
室温下充分晾干滤膜, 于- 70 ∀ 自显影生成 X 光片
( Fuji Super RX) .之后, 用液闪计数仪( Packard 2000CA)测定
每一独立样点上所结合的探针的量, 用最小二乘法计算出每
张滤膜上参照微生物 RNA的标准曲线的斜率和截距.真核
生物及真细菌的丰度用它们各自的 16S rRNA 的量(通过域
特异性探针的杂交信号及相应的 RNA 标准曲线获得)占样
品中总的 16S rRNA 的量 (通过通用探针及相应的 RNA 标
准曲线获得)的百分比来表示.
3 结果与分析
图 1 为人工 RNA 样品以及用作参照标准的
RNA浓度系列在尼龙膜上的分布(该杂交实验旨在
检验 rRNA 定量杂交方法本身的准确性与可重复
性,而垃圾渗滤液核酸样品中特定生物类群的 16S
rRNA的相对丰度则由另一次独立的杂交实验测
定) .基于参照微生物 RNA 浓度系列的液闪测定结
果所作的回归分析表明, 杂交信号与尼龙膜上所点
RNA样品的量间具有明显的线性相关关系(表 2) ,
所得到的回归方程即可用来计算各人工样品中相应
微生物类群(真细菌、真核生物以及所有生物)的
16S rRNA的量. 最后, 将样品中每一特定微生物类
群的相对丰度表示为总的 16S rRNA (由通用探针
杂交结果得到)的百分率.根据每张尼龙膜上所测到
的各 RNA 样品的杂交信号以及相应的回归方程而
计算得到各人工样品或环境样品中真细菌和真核生
物 16S rRNA 的相对丰度 (表 2) , 结果表明, 利用
rRNA定量杂交方法能较准确地估算人工样品中相
406 应 用 生 态 学 报 14卷
应微生物类群的 16S rRNA的相对丰度. 而提取自
垃圾渗滤液的 RNA样品中, 真细菌 16S rRNA占总
(即所有生物) 16S rRNA 的绝大部分, 而真核生物
16SrRNA 仅占其中非常小的一部分(本实验未测
定样品中古细菌 16SrRNA的相对丰度) .
图 1 通用探针( a)、真核生物( b)和真细菌( c)域特异性探针斑点杂交
Fig. 1 Dot blot hybridizat ion of universal ( a) and domain specific (b and
c) oligonucleot ide probes.
杂交后的尼龙膜经自显影形成 X光片后, 每一独立样点上所结合的
探针的量用液闪计数器测定.每一尼龙膜上最左边的一列样点( 膜 a
上是两列)为相应的标准 RNA浓度系列(以 4倍的梯度递减 ) ,而标
准 RNA 浓度系列右边的样点从上到下各行依次是:纯 S. c RNA(对
照) ,人工样品 A、B和 C, 纯 P. f RNA(对照) .所有样品均作 3 个重
复.注意尼龙滤膜 b上的纯 P. f RNA 样点和尼龙膜 c 上的纯 S. c
RNA 样点,由于它们没有与相应的域探针杂交,从而没有在 X 光片
上显示出来. A fter autoradiography, the amount of bound probe on the
individual dots w as quant if ied by liquid scint illat ion counter.
表 3 真细菌及真核生物 16S rRNA 分子相对丰度
Table 3 Characterization of domain level probes
样品
S ample
域
Domain
占总 16S rRNA%
% of total 16S rRNA
A 真细菌 Bacteria 21. 8 & 0. 7
真核生物 Eucarya 71. 6 & 2. 8
B 真细菌 Bacteria 52. 6 & 2. 2
真核生物 Eucarya 41. 4 & 3. 6
C 真细菌 Bacteria 83. 4 & 6. 6
真核生物 Eucarya 21. 8 & 2. 8
环境样品* 真细菌 Bacteria 103. 5 & 3. 8
En vironmental sample 真核生物 Eucarya 0. 7& 0. 3
A: 75% S . cerev isiae RNA + 25% P . f lu oresens RNA; B: 50% S .
cerev isiae RNA + 50% P. f luoresens RNA; C: 25% S . cere vi siae
RNA + 75% P . f luoresens RNA. * 抽提自垃圾填埋场渗滤液的总
RNA RNA ext racted from landf ill leacahte; 样品中真细菌和真核生
物的相对丰度由另一独立的杂交实验得到 Relat ive 16S rRNA levels
of Bacteria and Eucarya in the environmental sample w ere obtained
f rom another independent hybridizat ion.
4 讨 论
基于 16S rRNA 序列比较分析的各级系统发育
类群特异性探针是定量杂交方法的重要基础. 本实
验结果表明,杂交信号与尼龙膜上所点的核酸样品
中目标 16S rRNA分子的量之间具有很好的线性相
关关系,从而能较准确地估算人工样品和环境样品
(垃圾填埋场渗滤液)中相应微生物类群 16S rRNA
的相对丰度.由于试验所用的渗滤液样品采自李坑
垃圾填埋场的新填埋区,对其初步的理化分析表明,
该区域内部所填埋的垃圾正处于产酸阶段,由此推
断以产甲烷细菌为主的古细菌群落尚未形成,因此,
仅用真细菌和真核生物两个域特异性探针对其核酸
样品进行初步分析. 将来还可用更低系统发育水平
的类群特异性探针对其进行同样的定量杂交分析,
从而获得该环境样品中各微生物类群的更加深入和
全面的信息.
洗膜步骤中所用的 Td值是一个重要的实验参
数,用以区分有或没有错配碱基的探针目标 16S
rRNA杂合体, 从而保证相应探针的特异性.如图 1
所示,尼龙膜 b和 c上用作负对照的纯 P. f RNA和
S. c RNA样品, 在相应探针的 T d值下洗膜后, 其杂
交信号基本上与背景值相仿(液闪测定结果) ,从而
保证了相应域探针的特异性.相对于非同位素技术
而言,同位素标记具有更高的灵敏度以及线性的杂
交反应等优点[ 6] ,对于利用杂交探针定量描述复杂
的微生物群落非常重要, 也使检测与定量环境样品
中低丰度( 0. 1%甚至更低)的特定 16S rRNA 成为
可能[ 3, 10] . 本实验所用参照微生物的 RNA 浓度梯
度中,可用液闪计数器从其低至 1. 5 ng(有时甚至更
低)的系列中检测到可靠而线性的杂交信号.
玻璃珠机械破碎法能保证从环境样品内种类繁
多的微生物中相对均等地回收 RNA[ 10, 13] , 从而使
核酸提取步骤所导入的误差降至最低.然而,由于一
些未知的原因, 该法有时也会抽提出一定数量的
DNA[ 6] .本研究中对抽提自纯培养细胞的核酸样品
所进行的电泳分析也证实了这一点. 相关的研究表
明,与 RNA一起抽提出来的少量 DNA对杂交反应
的贡献极小,其影响完全可以忽略不计[ 6] .
鉴于传统微生物技术的局限性, 至今仍无法对
各种环境微生物(尤其是自然或人工厌氧系统等特
殊生境中的微生物)的种群或群落生态进行全面而
深入的研究, 也无法有效地建立起微生物群落的结
构及其功能间的联系. 16S rRNA 定量杂交方法是
分析复杂微生物群落的强有力工具. 有关技术上的
复杂性以及某些尚待完善之处在已有的研究论文中
很少被提及,而在实际应用中, 杂交探针的专一性、
目标 16S rRNA 序列的可杂交性及其内部的互补
性、RNA 提取的效率及其在操作过程中的降解等,
都是必须考虑的因素. 而结合传统的微生物技术、生
化分析以及这些新兴的分子技术, 可以更好地建立
起微生物群落的结构及其功能之间的联系.
4073 期 黄立南等:利用定量杂交方法对几个人工和环境微生物样品的分析研究
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作者简介 黄立南, 男, 1971 年生, 硕士, 讲师, 主要从事环境生态学研究, 发表论文 10 余篇. T el: 02084036296, E
mail: ls04@ zsu. edu. cn
408 应 用 生 态 学 报 14卷