全 文 ：蓝细菌与福建苏铁(Cycad revoluta)的侵染性重组的研究
陈　彬 , 郑斯平 , 郑伟文
(福建省农业科学院生物技术研究所 , 福建　福州　350003)
收稿日期:2007-07-26初稿;2007-08-31修改稿
作者简介:陈彬 (1978-), 女 , 硕士 , 助理研究员 , 从事微生物分子生物学研究。
通讯作者:郑伟文 (1942-), 男 , 研究员 , 从事分子微生物和生物固氮研究 (E-mai l:bcfaas01@h otmail.com)。
基金项目:福建省科技计划项目 (2001Z026)
摘　要:将苏铁珊瑚状根及根周围的土壤中分离的蓝细菌分离物与福建苏铁 (Cycas revoluta)在实验室条件下
进行重组。通过比较重组前后蓝细菌分离物的 ST RR指纹图谱和 16S rRNA 的序列得蓝细菌分离物 RZHA4 能重
新侵染苏铁的珊瑚状根。通过 NCBI比对 , 蓝细菌分离物 RZHA4 的 16S rRNA 序列与蓝细菌 Nostocaceae IL13
-1 的相似性为 99%。
关键词:珊瑚状根;蓝细菌;STRR;16S rRNA
中图分类号:Q 933 文献标识码:A
Infection association study by reconstituting Cycad revolute and cyanobacteria
CHEN Bin , ZH ENG Si-ping , ZH ENG Wei-wen
(Biotechnology Institute , Fuj ian Academy of Agricultural S ciences , Fuz hou , Fuj ian　350003 , China)
Abstract:Cycad revolute and cyanobacte ria , which w as isolated from the corallo id r oo ts of the cycad and the sur-
rounding so il , w ere reconstituted in the labora to ry. The identitie s o f the cyanobacteria wer e confirmed by am plified
S TRR primer and sequenced 16S rRNA.Compa ring the S TRR fingerprinting and 16S rRNA sequence , it w as deter-
mined that the iso la ted cyanobacteria RZHA4 w ere able to infect the host plant. The strain RZHA4 showed high
compa rability w ith Nostocaceae cyanobacterium IL13-1 by blasting the NCBI.
Key words:cor alloid ro ot;cyanobacte ria;S TRR;16S rRNA
　　苏铁是一种生长在热带或亚热带的最原始的种
子植物 , 是唯一能与蓝细菌形成共生关系的裸子植
物 , 苏铁有一种反复二叉式分支而呈瘤块状的负向
地性根 (Apogeot ropic ro ot), 在根内存在蓝细菌 ,
此类根称为珊瑚状根[ 1] 。在珊瑚状根内的蓝细菌能
通过光合作用提供给苏铁充足的氮源[ 2] 。
在蓝细菌与植物宿主的人工共生体系中 , 最早
实现了蓝细菌与根乃拉的重组 , 得出共生的蓝细菌
具有侵染性[ 3] 。Gantar 等研究证实在固氮蓝细菌
(Nostoc)与小麦种子在缺氮的 BG11 培养基下共
培养能够形成精细的联系 , 而且蓝细菌能定植于小
麦的根和根毛中 。其中蓝细菌 Nostoc 2S9B能穿透
根的表层和皮层 , 存在于小麦根细胞间隙中[ 4-9] 。
Gantar等还将从苏铁珊瑚状根中分离并有明确
DNA 指纹图谱的蓝细菌与无菌苏铁种子共培养 ,
通过比较 DNA 指纹图谱 , 发现蓝细菌 (念珠藻
FUR94201)能重新侵染苏铁珊瑚状根[ 10] 。
在创建蓝细菌-植物的共生体系中 , 以往试验
所使用的都是自生蓝细菌 。由此推测 , 使用共生蓝
细菌可能具有更大的优势。本试验将从苏铁珊瑚状
根及根周围土壤中分离的蓝细菌与无菌的福建苏铁
苗共培养 , 不仅比较重组前后蓝细菌的 S TRRmod
-PCR DNA 指纹图谱 , 还对重组前后的蓝细菌分
离物的 16S rRNA进行测序比较 , 寻找一种能与苏
铁人工共生的蓝细菌。通过对苏铁-蓝细菌的重组
研究 , 逐步揭示人工共生的双方在细胞与分子水平
的互作机理 , 从而为人工创建作物-蓝细菌共生固
氮体系提供理论和技术上的准备[ 11] 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株及苏铁
本研究使用的蓝细菌均分离自苏铁珊瑚状根及
根周围的土壤中:RFA1 , RZHA4 , RFA5 , RFB2 ,
RPA1 , RFA13 , SFA5 , SPA1 , SPA5 , SFB9 (R
表示从珊瑚状根中分离的 , S 表示从土壤中分离
的)。上述菌株具有不同的 S TRRmod-PCR DNA
指纹图谱[ 12] 。福建苏铁种子苗 (Cycad revoluta)
购自沙县苏铁园。
福建农业学报 22(4):350 ～ 353 ,2007
F ujian Journal o f Agricultural Sciences
文章编号:1008-0384 (2007)04-0350-04
1.2　蓝细菌 DNA 的提取
蓝细菌 DNA 的提取按文献 [ 13] 法进行 , 待
蓝细菌生长到对数期后 , 吸取 500 μL 的菌液供
DNA 提取 。
1.3　蓝细菌 16S rRNA 扩增
用于蓝细菌 16S rRNA 扩增的引物序列参照文
献 [ 14] , 最终选定的引物对为 CYA106F :5′CG-
GACGGGTGAGTAACGCG TGA3′及 CYA781R
(a):5′GACTACTGGGG TA TCTAA TCCCA TT
3′。25 μL 的反应体系中含有 1 倍的 PCR 缓冲液 ,
1 mmo l · L-1 Mg 离子 , 200 μmol · L-1 dN TP ,
各 20 μmol·L-1引物 , 1 U DNA 聚合酶 (上海生
工)和 50 ng 蓝细菌 DNA 。PCR反应程序为:95
℃变性 5 min , 接着 94 ℃变性 45 s 、 62 ℃退火
45 s 、 72 ℃延伸 2 m in , 重复 35个循环 , 72 ℃,
延伸 10 min 。
1.4　蓝细菌 16S rRNA 克隆及测序
蓝细菌 16S rRNA 克隆所使用的试剂盒购自宝
生物工程有限公司 (TA KARA)。克隆过程中大肠
杆菌 DH5α感受态细胞的制备及克隆的具体步骤见
文献 [ 15] 。克隆所用的质粒为 pUC18-T 。连接
反应在 16 ℃, 反应 90 min;42 ℃, 热激 60 s。蓝
细菌 16S rRNA的序列由上海生工测序。
1.5　用于重组试验的蓝细菌分离物的竞争性实验
吸取 OD值 0.3 的上述 10 株蓝细菌分离物的
菌液 , 分别接种于 BG11的斜面上 (0.5%琼脂)。
21 d 后 , 取相同大小的蓝细菌菌块分别接种到
BG11的固体 (1.5%琼脂)培养基中 , 进行光照
(光强约 3 000 Lx , 温度 28℃)培养[ 11] 。
1.6　蓝细菌分离物与苏铁的重组
将福建苏铁 (Cycad revoluta)的种子苗用
0.1%升汞消毒 15 min , 用无菌水冲洗 3遍。
将土壤用 60目的筛网过筛后 ,在太阳光下暴晒
2 d ,然后进行高压灭菌 2遍 。种植容器经高压灭菌
后 ,再在紫外灯下光照 24 h 。然后将无菌的苏铁苗
移植到装有无菌土的容器内 。14 d后将上述 10 种
蓝细菌分离物分别单一的接种到 10个种植有苏铁
苗的无菌土壤中。此后每周浇一次 BG11培养液 。
300 d后 ,从苏铁的珊瑚状根中重新分离出蓝细菌 。
分析蓝细菌分离物的 ST RRmod-PCR DNA 指纹
图谱和 16S rRNA 的序列(试验方法同上)。
2　结果与分析
2.1　蓝细菌分离物的S TRRmod-PCR DNA 指纹
所谓 S TRR即存在于具有异形胞的丝状蓝细
菌基因组中的串联重复序列[ 16-19] , 最初由 Mazel
(1990)在眉藻 (Calothrix PCC7601)中发现[ 16] ,
Jackman (1995)等对鱼腥藻的研究所证实[ 17] 。
1998年 , Rasmussen 等建立了 ST RR-PCR技术
对自生蓝细菌基因组进行比较和鉴别[ 18] 。郑伟文
将其应用于与苏铁共生的蓝细菌的基因组指纹图谱
分析[ 19-20] 。图 1 为参试样品的 S TRRmod -PCR
产物的电泳图谱 。从图 1 可知 , 10 种蓝细菌分离
物有各自的 S TRRmod-PCR DNA 指纹图谱 。
图 1　蓝细菌分离物的 S TRR指纹图谱
Fig.1　STRRmod fingerprinting of cyanobacterial isolates
注:1.RFA1 , 2.RZHA4 , 3.RFA5 , 4.RFB2 , 5.RPA1 ,
6.SFA5 , 7.SPA1 , 8.SPA5 , 9.SFB9 , 10.RFA13 , M :
3000 bp分子标记。
2.2　用于重组的蓝细菌分离物的竞争性和抑制性
试验
将 OD值相同的蓝细菌分离物接种于斜面后再
转接到平板上 , 观察蓝细菌分离物在相同条件下的
生长情况 。发现蓝细菌分离物 RZHA 4长势最好 ,
菌落直径是最大的 , 说明在相同条件下 , 蓝细菌分
离物 RZHA4的竞争性最强 (图 2)。
2.3　蓝细菌与苏铁重组
本试验使用从苏铁珊瑚状根中分离的蓝细菌和
从土壤中分离的蓝细菌对无菌的福建苏铁苗接种。
10个月后 ,在无菌状态下成活的苏铁苗有 7 株(图
3a),其中有 5株形成珊瑚状根 ,但是有蓝细菌存在
珊瑚状根中的苏铁只有 1株(图 3b)。其余的 4株
虽然有形成苏铁珊瑚状根 ,但根内并无蓝细菌存在。
能重新侵染苏铁珊瑚状根的蓝细菌分离物是
RZHA4(图 3c)为重组苏铁珊瑚状根的纵切图和横
切图 ,能明显看到根内存在一条蓝绿色的藻带。
将重新分离出的蓝细菌进行 ST RRmod-PCR
扩增(图 4)。与图 1 进行比较 , 发现有相同的
S TRRmod DNA 指纹图谱存在。由于 S TRR DNA
指纹图谱能够鉴别蓝细菌的不同品系 ,所以可以初
步判断能重新侵染苏铁珊瑚状根的蓝细菌为
RZHA4。
351第 4期 陈　彬等:蓝细菌与福建苏铁 (Cycad revoluta)的侵染性重组的研究
图 2　蓝细菌的竞争性试验结果
Fig.2　Out-competition experiment of inocula
图 3　与蓝细菌共培养的苏铁
Fig.3　Co-culture of cycads with cyanobacteria
　　为了进一步确定 试验结果 , 又用 引物
CYA106F -781R (a)对侵染前后的蓝细菌分离物
的 16S rRNA 片段进行克隆及测序。发现蓝细菌分
离物 RZHA4与福建苏铁重组前后的 16S rRNA 序
列的相似性为 100%。蓝细菌分离物 RZHA4 的
16S rRNA 序列为 558 bp , 通过 NCBI 比对的结果
得与蓝细菌 Nostocaceae IL13-1 16SrRNA 相似性
达到 99%, 只有两个碱基不同。因此可以认为蓝
细菌分离物 RZHA4为念珠藻 。
图 4　重新分离出的蓝细菌的 S TRRmod-PC R产物的
电泳图谱
Fig.4　STRRmod fingerprinting of cyanobacterial isolate
from the reconstituted cycad
3　讨　论
上述试验结果表明了在实验室状态下的苏铁和
蓝细菌重组具有可能性 。福建苏铁继角苔和根乃拉
之后成为能与蓝细菌人工重组的植物 。在蓝细菌与
苏铁共培养的试验中 , 将苏铁在自然条件下进行萌
芽 , 将刚刚萌发的种子苗进行表面消毒后在半隔离
状态下培养 (即底下部分全封闭 , 地上部分开放 ,
交接处用无菌的 palaf ilm 包裹)。将从苏铁珊瑚状
根中分离出的蓝细菌纯分离物重新侵染无菌的苏铁
苗 。再将苏铁珊瑚状根内的蓝细菌分离出 。如果苏
铁珊瑚状根中能重新分离到原先接种的蓝细菌 , 就
可以确定重组试验已经成功 , 而并非外源污染的偶
然事件 。
本研究应用两种分子标记的方法对重组的结果
加以证实 , 不仅比较了重组前后蓝细菌的 ST R-
Rmod-PCR指纹图谱 (该法可对生物种以下的不
同蓝细菌品系进行鉴定), 证明两种状态下 , 蓝细
菌 ST RR 指纹图谱完全相同 , 还对两者的 16S
rRNA保守序列进行测序 , 表明两者的 16S rRNA
序列 100%同源 , 从碱基排列的水平上予以确认。
而 Guntar 的研究仅仅比较重组前后的蓝细菌的
16S-23S rRNA 的 ITS [ 10] 。
有趣的是 , 本研究的蓝细菌分离物 RZHA4与
以色列的 Masseret 分离的 Nostocaceae IL13 -1
16S r RN A的同源性为 99%。在应用 Blast软件进
行比对的 100 种蓝细菌中 , 同源性达 97%以上的
352 福建农业学报 第 22卷
有 70%在分类上属于念珠藻。所以认为蓝细菌分
离物 RZHA4是一种念珠藻 (Nostoc)。Guntar 的
研究是利用从各种不同的宿主中分离的已知的蓝细
菌与美洲苏铁 (Zamia furfurancea)进行重组 , 用
单藻株接种[ 10] 。本研究主要采用分离自同一种宿
主的蓝细菌分离物 , 并对不同的蓝细菌分离物进行
随机的组合后接种 , 其目的在于探讨蓝细菌和宿主
是否存在竞争性和专一性 。结果表明 , 蓝细菌分离
物 RZHA4 , 不仅在培养基条件下 , 竞争力最强 ,
而且在土壤条件下也表现出绝对优势。由此推测蓝
细菌分离物 RZHA4有可能成为在自然条件下侵入
其他植物的候选菌株 。这一结果也表明 , 尽管以前
报导与苏铁共生的蓝细菌具有高度的多态性 , 但本
研究则显示共生蓝细菌与宿主之间仍存在一定的专
一性 。
本研究用 10 棵福建苏铁幼苗与蓝细菌进行重
组 , 成活率为 78%。成功率为 11%。与 Gantar[ 10]
的实验结果相似 。瑞典斯德哥尔摩大学的 Malin[ 11]
曾用 57种蓝细菌与小麦共培养 , 发现有 21种蓝细
菌能吸附在根的表面 , 但只有蓝细菌 2S9B能穿透
根的表皮层 , 定植于根的细胞间隙中。这与本试验
的结果也有相似之处 。可能的原因有:(1)在自然
共生的状态下 , 某些土壤中的微生物可能会促进蓝
细菌侵染宿主;(2)人工共培养的系统是密闭的 ,
可能光照 , 水分等条件不如自然共生的状态;(3)
蓝细菌对宿主或共生的环境存在专一性 。
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(责任编辑:翁志辉)
353第 4期 陈　彬等:蓝细菌与福建苏铁 (Cycad revoluta)的侵染性重组的研究