全 文 ：植被对土壤微生物群落结构的影响 3
夏北成　(中山大学环境科学研究所 ,广州 510275)
Zhou Jizhong 　(Oak Ridge National Laboratory , Oak Ridge , Tennessee , USA)
James , M. Tiedje 　(Center for Microbial Ecology , Michigan State University , Michigan USA)
【摘要】　研究了不同土壤及覆盖其上的植被与土壤微生物群落结构和多样性的关系. 植
被使土壤中的微生物种类更丰富 ,群落多样性更高. 表层土壤微生物群落中没有明显的优
势种群 ,种间竞争作用较弱. 并介绍了研究土壤微生物群落的分子生物学方法.
关键词 　土壤微生物群落 　群落多样性 　DNA 提取 　克隆
Effect of vegetation on structure of soil microbial community. Xia Beicheng ( Institute of En2
vi ronmental Science , Zhongshan U niversity , Guangz hou 510275) , Zhou Jizhong ( Oak Rige
N ational L aboratory , Oak Ridge , Tennessee , USA ) and James , M. Tiedje ( Center f or Mi2
crobial Ecology , Michigan S tate U niversity , L ansing , Michigan , USA ) . 2Chin. J . A ppl .
Ecol . ,1998 ,9 (3) :296～300.
The relationships of different soils and vegetations with the structure and diversity of soil micro2
bial community were studied. Vegetation made soil microbial species more abundant , and mi2
crobial community diversity more higher. There were no obvious dominant populations in soil
microbial community , and the interspecific competition was feeble. The methods of molecular
biology in the studies of soil microbial community were also introduced in this paper.
Key words 　Soil microbial community , Community diversity , DNA extraction , Cloning.
　　3 国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目.
　　1997 - 07 - 30 收稿 ,1997 - 11 - 10 接受.
1 　引 　　言
　　土壤微生物群落是一个非常特别的生
物学总体 ,过去在理论上已认识到这一特
殊群体具有重要的生态功能 ,但由于研究
手段的局限 ,未对其给予足够的重视. 然
而 ,近年来由于环境问题的不断出现 ,引起
了科学界对这一群体的特别关注. 土壤微
生物群落对环境变化极为敏感 ,而它们又
是恢复环境的最先锋者 ,它们使得生态系
统的缓冲能力显著增强. 环境生物恢复
(Bioremediation) 已经成为环境科学和微
生物学的边缘学科 ,其主要研究对象是某
一环境中的微生物群落及其对污染物质的
降解行为. 土壤微生物群落的研究已经成
为十分活跃的领域[3 ,4 ,6 ,8 ] .
　　影响土壤微生物群落的生态因素很
多 ,James M. Tiedje 提出有关微生物群落
多样性变化的几个假设. 从微生物群落多
样性的全球格局来看 ,植物群落类型初步
决定了微生物群落的组成 ,土壤微生物群
落多样性与覆盖于土壤上的植物群落多样
性呈正相关 ;从微生物群落多样性的区域
格局来看 ,土壤微生物群落多样性与覆盖
于土壤上的植物群落的生产力和多样性呈
正相关 ,随着植物群落存在的年限而增加.
本文研究局部区域内植被对土壤微生物多
样性的影响 ,现将结果报道如下.
应 用 生 态 学 报 　1998 年 6 月 　第 9 卷 　第 3 期 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,J un. 1998 ,9 (3)∶296～300
2 　材料与方法
2. 1 　取样地点及土壤样品
　　于土壤冻结前 (1995 年 12 月初) ,在 Michi2
gan State University 的 Kellogg 生物实验站长期生
态观测点的白杨树实验区取样. 分多草 ( Weedy)
小区和无草 ( Weed2free) 小区 ,各区取样深度为 0
～4cm 和 0～15cm. 该实验观测区建立于 1989
年 ,多草小区自白杨树种植以后就未曾进行过人
为干扰 ,地表植被以多年生草本为主 ,每平方米
约有 10～12 种草本植物. 该小区内草本植物总
数约 35 种. 无草小区自 1989 年施用除草剂以来 ,
每年都使用除草剂进行除草 ,并辅以机械松土除
草.
　　每个样品分别从该小区按相同的取样深度
取 6 个土柱 ,混匀后取约 100g 土壤 ,放入冷藏盒
内 ,带回实验室藏于 - 20 ℃.
2. 2 　样品处理及 DNA 提取
2. 2 . 1 样品研磨 　从每个样品中称取 5g 土壤 ,放
入研钵中 ,倒入适量的液氮 ,立即研磨. 再倒入适
量液氮 ,研磨 ,如此重复 3～5 次 ,使土壤颗粒研
成粉末 ,并达到使部分细菌细胞壁破裂的目的.
2. 2 . 2 提取缓冲液 　缓冲液配比为 :0. 1mol 磷酸
盐 (p H 8. 0) , 0. 1mol EDTA , 0. 1mol Tris2base ,
1. 5mol NaCl ,1. 0 % CTAB[6 ,9 ] .
2. 2 . 3 DNA 提取 　1) 将 13. 5ml 提取缓冲液和
50μ蛋白酶 K(10mg·ml - 1) 与 5g 土壤于 50ml 的
离心管中 , 放入 37 ℃恒温室内的摇床上 , 以
225rpm摇 30min. 2) 加入 1. 5ml 20 % SDS ,轻轻
混匀. 放入 65 ℃水浴中加热 2h ,每隔 15～30min
轻轻摇动 1 次 ,摇匀泥浆. 3) 用 2000～3000rpm
离心 5～10min ,将上清液转入新的 50ml 离心管
中. 4)再取 4. 5ml 提取缓冲液加入原离心管 ,摇
匀泥浆 ,加入 0. 5ml 20 %SDS ,放回水浴 15min ,同
样速度离心 5～10min. 将上清液转出并与原上清
液合并. 再重复 1 次. 5) 用与上清液等量的三氯
甲烷于离心管中混匀 ,用 3300～3600rpm 的速度
离心 20min. 收集上清液 ,加入 0. 6～1. 0 倍体积
的异丙醇 , 静置于室温下 2h 或过夜. 6 ) 用
9000rpm 的速度在 25 ℃下离心 20min ,倒出清液 ,
加入 200～500μl 去离子水 ,溶解粘附于离心管壁
上的 DNA 及其杂质 ,并收集于 1. 5ml 的微型离
心管中.
　　经过上述步骤 ,获得土壤样品的 DNA 粗提
物.
2. 3 　DNA 纯化
　　DNA 粗提物中含有许多杂质 ,如有机质、腐
质酸、无机盐和一些重金属等 ,这些杂质必须从
DNA 中分离出去 ,以有利于 DNA 扩增. 粗提
DNA 提取物的纯化有多种方法 ,本项研究中采用
凝胶电泳加微型过滤柱的方法 [1 ,11 ] .
　　制作 0. 8 %的低溶点琼脂糖胶在低电压 (21
～25V)下电泳. 制胶时使用大孔梳 ,将每个样品
的粗提液装于 1～2 个孔内 ,电泳 15～20h. 然后
于紫外灯下 ,用洁净的刀片将清晰的 DNA 带切
下 (切下尽可能少的胶) ,分置于 3～5 个微型离
心管内. 每管加入 100μl 的去离子水 ,于 85 ℃水浴
中使胶全部溶解.
　　将溶解的含 DNA 琼脂糖胶经微型过滤柱过
滤 ( Promega 公司生产 ) . 取上述 DNA 溶胶液
100μl (约为 5g 土壤粗提液的 1/ 5) ,加入 100μl 纯
化缓冲液和 1ml 纯化粘接树脂液 (均为配套试
剂) ,混匀 ,静置几分钟. 于过滤柱上加一个 3ml
的注射器管套 ,将混合液转入管套内 ,用真空泵
抽吸 ,抽干后再继续抽 15～20s. 抽完后加 2ml
80 %异丙醇冲洗过滤柱 (真空抽吸) . 取下过滤
柱 ,于 1400rpm 的速度在微型离心机上离心 20s ,
以进一步祛除杂质和异丙醇. 然后加入 50～
100μl 约 75～80 ℃的去离子水 ,约 5～10min 后 ,
在微型离心机上以同样的速度离心 20s ,纯化的
DNA 便被收集于微型离心管中.
2. 4 　DNA 定量测定
　　小量纯化的 DNA 提取液可采用荧光测定法
测定 ,紫外分光光度计测定 ,将提取液进行高倍
稀释后进行测定. 这两种方法对核苷酸的测定都
是可靠的 ,但就提取物中的 DNA 中却隐含一个
不可忽视的误差 ,即被破碎了的 DNA 小片段和
一些同时被提取出来的较大片段的土壤动物
DNA 也被包含在内. 因此本项研究采用凝胶电泳
的方法进行测定.
　　用 1. 5 %的普通琼脂糖胶 ,用小孔梳作胶. 用
DNA 分子重量标记 Ⅲ作定量计算的参照. 根据标
记Ⅲ所提供的参数 (总的 DNA 含量和不同大小
7923 期 　　　　　　　　　　夏北成等 :植被对土壤微生物群落结构的影响 　　　　
片段的含量) ,用不同量的标记 Ⅲ进行电泳 ,一般
同时使用 1、3、5 和 10μl 进行电泳 ,通过这 4 种不
同量中的各个片段的 DNA 电泳带大小与适量的
被测样品中 DNA 电泳带的大小比较可测得样品
中的 DNA 含量. 此时所测得的含量只是样品中
所需要的 DNA 目标片段的含量. 在比较成功的
DNA 提取物中 ,基本上只有此一目标 DNA 的带 ,
而其他的小片段等的含量较少 ,电泳时不会形成
明显的带.
2. 5 　PCR 扩增和基因转移
　　将纯化的 DNA 用作聚合酶链反应 ( PCR) 的
模板 ,对目标 DNA 进行扩增放大. 由于本项研究
是微生物群落分析 ,因此采用对土壤中真细菌类
( Eubacteria) 微生物适应性很广的引物 (fDI 和
rPI) [7 ] ,在 Taq 酶作用下将 DNA 中的 16S 因子
放大. 并经电泳检测.
　　用新鲜扩增的 16S 因子 PCR 产物与基因转
移载体连接并插入到 E. coli 中 ( TA Cloning 技
术) ,然后转入 LB 平板培养基上置于 37 ℃恒温下
培养 ,待其菌落生长到适度大小 ,此时部分未携
带转移因子的菌落已经变为蓝色 ,再将其放入
4 ℃下 10～20h ,以使绝大部分不携带转移因子的
菌落都转变为蓝色 ,从而获得所需要的携带转移
因子的克隆 (白色菌落) .
　　用引物 TA2106 和 TA2187 将所获得的克隆
细胞直接经 PCR 扩增 ,再通过电泳检测不带 16S
因子或只携带更小因子的克隆.
2. 6 　电泳胶片图象聚类分析
　　用两组 DNA 限制性内切酶 ( Msp Ⅰ2 Rsa Ⅰ
和 Hha Ⅰ2 Hae Ⅲ) 对所有携带 16S 因子的克隆
的 PCR 产物进行消化 (置于 37 ℃下 5～12h) . 制
备 3. 1～3. 3 % 的 Metaphor 琼脂糖胶 ,在 4 ℃下对
消化了的 DNA 进行电泳分离. 每一个电泳胶片
的左中右都用同一标准标记作校正. 在紫外灯下
将所有电泳胶片的基因型图象通过摄象机录入
电脑 ,应用 Gelcompar 电泳胶片图象分析软件进
行分析. 将相同的基因型聚合到一起 ,并根据各
基因型的相似性进行聚类. 各不相同的基因型为
唯一基因型 , 每一个唯一基因型称为一个操作分
类单位 (O TU ,Operational taxonomic unit) .
3 　结果与讨论
3 . 1 　群落多样性高
　　本次研究的 4 个样品均获得极高的群
落多样性. 各样品所获得的克隆数量、
O TU 数量及群落多样性指数如表 1[9 ,10 ] .
从表 1 可看出 ,这批土壤样品的微生物群
落有极高的多样性. 所获得的克隆数比同
类研究[2 ]高很多. 这可能是以前的研究只
注重方法 ,而没有注重 O TU 的数量. 本次
研究所得的 O TU 数量还不是克隆数的极
限值 ,实际上从两个多草样品所获得的克
隆很多.
表 1 　从土壤样品中获得的克隆数及群落多样性
Table 1 Clones obtained from soil samples and the diversi2
ty of soil microbial community
多草 Weedy
Ⅰ Ⅱ
无草 Weed2free
Ⅰ Ⅱ
克隆数 (带 16S 转移因子) 606 705 210 324
Total clones with 16S inserts
OTU 数量 551 684 191 311
Number of OTUs
OTU 数与总克隆数的比值 0. 91 0. 97 0. 91 0. 96
Ratio of OTUs to total clones
群落多样性指数 3 2. 77 2. 93 2. 27 2. 49
Community diversity3 根据 Shannon 指数计算. Calculating according to the
Shannon Index. Ⅰ. 0～4cm , Ⅱ. 0～15cm.
3 . 2 　无显著优势 O TU
　　从表 1 O TU 数与总克隆数的比值可
以看出 ,唯一基因型的比值高 ,而具有相同
基因型的克隆很少. 所获得的克隆中没有
显著的优势 O TU (图 1) .
3 . 3 　植物群落的影响
　　多草小区表层土壤具有很丰富的植物
群落 ,而无草小区则除了白杨树以外没有
其他的植物生长 ,且每年都会对其进行松
土和施用除草剂. 从克隆数、O TU 数和群
落多样性指数几个指标来看 ,都明显地显
示多草小区具有更为丰富的生物种类. 多
草小区因多年有植被生长 ,且长期不受人
为的干扰 ,土壤环境稳定 ;植物根系可为微
生物栖息提供更好的场所 ,其分泌物可使
微生物具有更丰富的资源可以利用 ;植被
覆盖使得土壤湿度条件更适合于群落的发
展 ;植物根系的生长活动同样也可以改变
892 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　9 卷
图 1 　多草和无草小区不同土壤层次的微生物群落结构及 OTU 数
Fig. 1 Soil microbial community structure and number of OTU in weedy and weed2free plots.
a. 多草 Weedy ,b. 无草 Weed2free. Ⅰ. 0～4cm , Ⅱ. 0～15cm.
土壤的物理环境 ,并有利于微生物生长. 微
生物群落的发展反过来又有利于植物群落
的发展.
3 . 4 　不同层次土壤样品的基因型数量
　　由图 1 两个不同层次的样品所获得的
O TU 可以看出 ,同一小区的不同层次的样
品差异明显. 多草小区中 0～4cm 土壤样
品的 O TU 为 0～15cm O TU 的 80. 4 % ,而
无草小区中 0～4cm 土壤样品的 O TU 仅
为 0～15cm 土壤样品的 O TU 的 61. 5 %.
从 0～4cm 的样品中 O TU 所占比例来看 ,
上表层 0～4cm 的微生物群落比 4～15cm
更为丰富.
　　0～15cm 土壤样品中涵盖有 0～4cm
土壤样品中的基本信息 ,由此可以推论 ,以
5g 土壤作为一个独立处理的样品 ,并不是
最佳样品大小 ,可以将其进一步减少 ,以求
从最小的样品中获取最多的信息. 初步试
验结果表明 ,1g 土壤样品能获得 5g 土壤
样品中 80 %左右的生物信息.
3 . 5 　不同层次土壤的微生物群落
　　对另一组样品 (同一处理的不同深度)
的研究同样说明植物群落对微生物群落的
影响. 这个样品取自 Abbot’s Pits(美国 ,弗
吉尼亚州) ,用同样的方法获得土壤样品中
的微生物群落 (O TU) (表 2) [2 ,9 ] .
表 2 　不同土壤层次微生物群落的结构及其多样性
Table 2 Construction and diversity of soil microbial com2
munity in different depth
样品编号
Code of
samples
取样深度
Sampling
depth (cm)
克隆数 (个)
Clones
(ind. )
OTU 数
(个)
OTU (unit)
多样性指数
Diversity
index
AB21 5 687 665 2. 815
AB22 157 54 33 1. 443
AB23 325 74 36 1. 428
　　显然 ,表层以下土壤受植被的影响较
小 ,其 O TU 数显著减少 ,微生物群落多样
性也随之减小. O TU 数与克隆数比值大 ,
表明地面以下土壤中出现有优势的 O TU.
3 . 6 　表层土壤微生物群落无优势种群
　　从表层土壤微生物群落的结构看出 ,
基本上不存在优势种群或 O TU ,根据一般
的生态学原理 ,说明在表层土壤微生物群
落中不存在明显的竞争作用. 这与表层土
壤环境的异质性有关[10 ,12 ] . 表层土壤环境
中具有十分丰富的可用资源 ,可使微生物
群落种群间就资源的竞争减到最低 ;表层
土壤微生物群落的生态功能极其多样化 ,
因此各种群间的生态位重叠较小 ;表层土
壤环境中因为资源丰富且土壤颗粒间缺少
可供微生物种群自由移动和交流的介质 ,
9923 期 　　　　　　　　　　夏北成等 :植被对土壤微生物群落结构的影响 　　　　
从而形成种群间的空间隔离.
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