全 文 ：土壤微生物的分离、提取与纯化研究进展 3
向万胜1 ,2 3 3 　吴金水1 　肖和艾1 　李学垣2
(1 中国科学院亚热带区域农业研究所 ,长沙 410125 ;2 华中农业大学资源环境学院 , 武汉 430070)
【摘要】　综合评述了土壤微生物提取与纯化研究的最新进展及存在的主要问题. 土壤微生物的分离提取
过程一般分为土壤分散、提取与纯化 3 个步骤. 采用过滤、离心和淘选 3 种方法可以成功地分离提取大部
分土壤细菌 ;但土壤真菌的提取则相对较为困难 ,目前可采用的方法有旋转框技术、液相提取与滤膜检测、
以及低速离心技术 ,这些方法可提取出部分真菌菌丝. 两相分离技术可用以对提取的土壤微生物进行纯
化.
关键词 　土壤微生物 　提取与纯化
文章编号 　1001 - 9332 (2003) 03 - 0453 - 04 　中图分类号 　S154. 3 　文献标识码 　A
Advances in extraction and purif ication of soil microorganism. XIAN G Wansheng1 ,2 ,WU Jinshui1 ,XIAO He′
ai1 ,L I Xueyuan2 (1 Institute of S ubt ropical A griculture , Chinese Academy of Sciences , Changsha 410125 , Chi2
na;2 Depart ment of Resources and Envi ronment , Huaz hong A gricultural U niversity , W uhan 430070 , Chi2
na) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2003 ,14 (3) :453～456.
For the studies on soil microbial ecology and bio2diversity as well as on the dynamics of C ,N ,S and P in soil ,it is
necessary to quantitatively extract microorganism from soil. The recent advances on extraction and purification of
microorganism from soil were reviewed in this paper. The procedure for extracting microorganism from soil was
comprised of three steps ,i. e. , soil dispersion ,separation and purification. Most bacteria in soil could be succes2
sively extracted from soil particles by present techniques such as filtration ,centrifugation and elutriation. Howev2
er ,filamentous fungi seem more difficult to be extracted than bacteria , because it is tangled with soil particles.
Rotating wire frame ,aqueous extraction and membrane filter technique ,and low2speed centrifugation were used
for extracting filamentous fungi from soil ,but the extraction efficiency was rather low and needed to be raised.
Aqueous two2phase partitioning system was successfully adopted as a technique for bacteria purification , and it
would possibly become a technique suitable for fungi purification. The potential area of research on soil microbial
ecology as well as on soil and plant nutrition by using microbial extraction technique was also discussed.
Key words 　Soil microorganism , Extraction and purification.3 国家自然科学基金项目 (40271070)和中国科学院知识创新工程重
大资助项目 ( KZCX12SW201214) .3 3 通讯联系人.
2001 - 06 - 18 收稿 ,2002 - 02 - 04 接受.
1 　引 　　言
为了研究环境变化对土壤微生物生态与土壤生物多样
性的影响 ,弄清不同群落土壤微生物的功能 ,并对土壤微生
物群落的数量与组成进行定量的估计至关重要. 由于土壤微
生物的数量巨大 ,组成极为复杂 ,90 %以上的土壤微生物不
能采用培养法培养出来 ,因此 ,应用传统微生物学研究中的
培养法来研究土壤微生物群落的数量与组成几乎不可
能[22 ] .尽管测定土壤微生物生物量的熏蒸培养 ( FI) 或熏蒸
提取法 ( FE) 能对土壤微生物总量进行较为精确的测
定[19 ,36 ] ,但迄今尚不能直接提供土壤微生物群落数量组成
的有关信息. 因此 ,应用物理或化学方法从土壤中提取与纯
化具有代表性的微生物 ,对于微生物生态学上研究土壤微生
物的群落结构组成 ,并通过同位素标记的方法研究 C、N、P、
S等元素在土壤微生物不同群落中的转化动力学具有重要
意义. 同时 ,对于细胞生理学和分子生物学等研究领域亦具
有重要科学价值 [33 ] . 本文对土壤微生物提取与纯化研究的
最新进展及主要问题作一综述.
2 　土壤微生物的提取
211 　土壤的分散
最大限度的分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关
键.通常采用物理或化学方法 ,或是二者相结合的方法来达
到微生物与土粒分离的目的. 常用的物理分散技术是使用玻
璃珠与土壤悬液一起振荡 ,或使用韦林氏搅拌器 ( Waring
blender)搅拌分散 ,或是使用超声波分散土壤团聚体. 物理机
械分散常与化学分散法相结合 ,通过加入化学分散剂促进微
生物与土粒的分离. 最常用的分散剂为 0. 2 %焦磷酸钠 [3 ,4 ] ,
其它分散剂还有 Winogradsky 盐溶液[10 ] 、Tris 缓冲液 [29 ] 、生
理盐水[41 ,42 ] 、六偏磷酸钠[3 ] 、胆酸钠[22 ] 、纯水[5 ] ; 也有加入
螯合剂和洗涤剂的 (表 1) [3 ,10 ,22 ,29 ] .
由于各种分散方法分散效果不同 ,采用何种分散方法效
果最佳目前尚无一致结论 . Hopkins等[14 ]对10种分散方法
应 用 生 态 学 报 　2003 年 3 月 　第 14 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Mar. 2003 ,14 (3)∶453～456
表 1 　分离提取土壤微生物常用的某些分散方法
Table 1 Some methods of soil dispersion for extraction of microorgan2
ism from soil
分散方法
Dispersion method
资料来源
Reference
韦林式搅拌器 + Winogradsky 缓冲液 Waring blendor +
Winogradsky buffer solution
[ 10 ]
韦林式搅拌器 + 洗涤剂与缓冲剂混合液 (六偏磷酸钠、
焦磷酸钠和 Tween 80 等) Waring blender + mixed de2
tergent and buffer solution ( sodium hexametaphosphate ,
sodium pyrophosphate and Tween 80 etc. )
[ 26 ]
Dowex Na + 树脂 + 胆酸钠 + 玻璃珠振荡 Dowex Na +
chelating resin + sodium cholate + glass beads , vibration
[ 22 ～
25]
离子交换树脂 + 洗涤剂 + PEG + 玻璃珠振荡 Ion ex2
change resin + detergent + PEG + glass beads , vibration
[ 13 ]
韦林式搅拌器分散后 ,再加入离子交换树脂、胆酸钠和
玻璃珠振荡分散 Waring blender , then , ion exchange
resin + sodium cholate + glass beads , viberation
[ 14 ,15 ]
离子交换树脂 + PEG + 玻璃珠振荡分散 Ion exchange
resin + PEG + glass beads , vibration
[ 35 ]
离子交换树脂 + 胆酸钠 + 玻璃珠振荡分散 Ion exchange
resin + sodium cholate + glass beads , vibration
[ 30 ,33 ]
物理分散 (韦林氏搅拌器 ,或旋转杵、超声波和振荡) +
化学分散剂 (蒸馏水或复合螯合剂 (脱氧胆酸钠 + PEG
+ Chelex100) ,或焦磷酸钠) Physical dispersion ( Waring
blender , rotating pestle , sonication and vibration ) +
chemical dispersion ( distilled water , or mixed chelating
reagent (sodium deoxycholate + PEG + Chelex 100) , or
sodium pyrophosphate) .
[ 20 ,21 ]
(物理与化学分散法相结合) 进行了比较 ,认为采用 1 %胆酸
钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤样品一起在 4 °C 振荡 2
h ,其分散效果最好. Lindahl 等[20 ]对使用两种分散剂 (蒸馏水
和复合螯合剂 (脱氧胆酸钠 + PEG + Chelex100) ,分别与 4 种
物理分散方法相结合 (韦林氏搅拌器、旋转杵 (Rotating pestle) 、
超声波和振荡)的 8 种方法进行比较 ,认为使用蒸馏水与韦林
氏搅拌器对土粒的分散最为有效 ,而超声波对土壤团聚体的
分散作用较差. 上述作者后来的研究表明[21 ] ,焦磷酸钠作为
分散剂对土壤的分散效果优于蒸馏水 ,可能是由于焦磷酸钠
对土壤腐殖质具有较强的结合能力 ,有利于破坏土壤团聚结
构 ;不仅分散剂的种类能影响土壤的分散效果 ,所用器皿的大
小亦是影响因素之一. 使用大、中、小 3 种不同规格的容器研
究土壤在焦磷酸钠溶液中的分散作用与细菌的提取率 ,结果
以中型器皿效果较佳.
在选择有效的土壤分散方法时 ,分散剂的种类 (包括浓
度、加入量) 、机械作用的方式与时间 (振荡、搅拌和超声波)以
及容器的大小等均应是考虑的重要因素.
212 　土壤微生物的分离与提取
21211 细菌的提取 　多数研究者认为 ,非菌丝体的微生物可
用孔径为 20 或 30μm 的微孔筛过滤出来 ,几乎所有真菌菌
丝、放线菌及丝状藻类均可阻滞于 20 或 30μm 的微孔筛之
上[22 ,30 ,33 ] .因此 ,土壤样品经分散处理后 ,再经 20 或 30μm
的微孔筛真空抽滤 ,其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌.
其特点是操作简便 ,提取液中土壤残留物少 ,易于纯化. 由于
细菌的平均密度 (1. 1μg·cm - 3) 远小于土壤矿物质的平均密
度 (2. 6μg·cm - 3) ,采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得
到较好的分离.目前应用较多的方法是密度逐级离心或差分
离心 (density gradient centrifugation , fractionated centrifugation or
differential centrifugation ) [3 ,10 ,14 ,23 ] . Hopkins[14 ]等所采用的密
度逐级离心法可分离出 60 %以上的土壤细菌. 离心法分离土
壤微生物的关键是要选择适宜的离心速度. 离心速度愈高 ,提
取液中土壤残存颗粒含量愈低 ,但细菌沉降量愈大 ,提取率愈
低 ;反之 ,提取液中细菌提取率愈高 ,但土壤残存颗粒含量亦
愈高. Riis等[32 ]研究表明 ,土样经振荡和超声波分散处理后 ,
采用低于 100 g的一步低速离心可提取 45 %的土壤细菌.
　　淘选法所依据的主要原理是细菌与土壤矿质颗粒由于其
密度不同 ,在水中具有不同的沉降速度. 由司托克斯定理
(Stoke’s law) : v = 2 r2 g (ρp - ρm ) / 9η. 式中 , v 为沉降速率
(cm·s - 1 ) , r 为颗粒半径 (cm) , g 为重力加速度 (981 cm3 ·
s
- 2) ,ρp 为沉降颗粒密度 (g·cm - 3) ,ρm 为沉降介质密度 (g·
ml - 1) ,η为粘滞系数. 根据上述定理可推算出细菌 ( r = 0. 4
μm ,ρp = 1. 081～1. 123 g·cm - 3)的沉降速率为0. 028～0. 043
μm·s - 1 ,矿质颗粒 (ρp = 2. 6 g·cm - 3) 的沉降速率约为细菌的
5. 5 倍[15 ,24 ] .设想当一介质以流速为 f 的速率在淘选器 (图 1)
中自下而上流动时 ,某一特定粒径颗粒流出淘选器的时间 t
为 : t = h1/ [ ( f / a1) - v ] + h2/ [ ( f / a2) - v ].式中 , t 为颗粒流
出时间 (s) , f 为介质流速 (ml·s - 1) , h1 为淘选器圆柱形部分
的高度 (cm) , a1 为淘选器圆柱形部分的横截面面积 (cm2) , h2
为淘选器圆锥形部分的高度 (cm) , a2 为淘选器圆锥形部分的
平均横截面面积 (cm2) .根据细菌与土壤矿质颗粒在淘选器中
流出的时间不同 ,可将细菌与土壤颗粒分离. 如 Hopkins[15 ]等
使用的淘选器 ,当设定流速 f = 2. 8 ml·s - 1时 ,可计算出所有
沉降速率 v ≤0. 16 mm·s - 1 (ρp = 1. 3 g·cm - 3 ,颗粒半径 r ≤
28.8μm)微生物颗粒均可在淘选时间 t = 714 s 内收集到
2 000 ml 淘选流出液.
图 1 　微生物分离淘选器示意图
Fig. 1 Design of elutriators.
淘选液经加液泵由下端 A 进入 ,经流速计 B 和微孔玻璃板 C 到达淘
选器内 ,由上端 D 流出 (a 为原始设计 ;b 为改进型 ,上端 E 设置吸流
泵 ,淘选液收集于 D) Elutriate was pumped in at A through flow gauge
(B) and sintered glass plate (C) , and was collected at D. (a) shows the
original design and (b) shows a modification which allowed elutriate to be
collected from the center of the elutriator by pumping from E.
21212 真菌的提取　土壤中的真菌 (包括放线菌)主要以菌丝
的形态与土壤颗粒缠绕在一起 ,因此 ,从土壤样品中分离提取
真菌要比提取单细胞的细菌相对困难. 当采用离心法分离真
菌时 ,若离心速度 > 500g 时 , 几乎所有真菌都将沉降于离心
管底部而不能被提取出来[10 ,14 ,32 ] . 故迄今为止有关分离提取
真菌的研究文献极少. Vilarino 等[37 ]和 Green 等[12 ]曾设计了
旋转金属框装置 (rotating wire frame) ,用以提取土壤中植物根
454 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　14 卷
系的外生真菌菌丝.当金属框在盛有土壤悬液的容器中旋转
时 ,真菌菌丝体即可被缠绕在金属框架上.这一方法对于砂质
土壤是有效的 ,但对于粘土来说却有其局限性. Jacobsen 等 [18 ]
提出了液相提取与滤膜检测技术 (aqueous extraction and mem2
brane filter technique )用以提取外生真菌菌丝 , 土壤样品首先
置于韦林氏搅拌器中 ,加入 250 ml 蒸馏水高速搅拌分散 30 s ,
然后快速转移到广口瓶中 ,手摇强烈振荡后静置 60 s. 吸取悬
液 5 ml 于微孔过滤器 (1. 2μm)中真空抽滤 ,乳酸甘油2台盘蓝
(lactoglycerol2trypan blue) 染色 ,显微镜检测估算真菌菌丝长
度. Bodding等[7 ]对上述两种方法的提取效率进行了比较 ,所
采用的土壤一种为热带老成土 (utisol) , 一种为温带有机土
(histosol) .液相提取与滤膜检测技术所提取的真菌生物量 (菌
丝长度)约为 2～8 m·g - 1 , 而旋转金属框方法所提取的量极
低 ,均在 0. 5 m·g - 1以下 ,似乎前者对真菌菌丝的提取率高于
后者.然而 ,与其它对土壤真菌生物量的研究结果相比 ,土壤
真菌总生物量 (菌丝长度)变化在 100～2 000 m·g - 1之间[6 ,9 ] ,
可见上述两种方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极
少部分.作者采用过滤与低速离心相结合 ,通过测定提取物中
土壤真菌的生物标记物 (biomarker) 麦角 　醇 (ergosterol) 的含
量来估计真菌的提取量 ,研究了该方法提取土壤真菌的效果.
土样加了 1 %的胆酸钠、Na 型离子交换树脂与玻璃珠在 4 ℃
下振荡分散 2 h ,并用 20～25μm 的滤纸真空抽滤. < 20～25
μm的滤液部分检测无麦角　醇或微量 ,说明该部分几乎无真
菌或极少量. > 20～25μm的部分经重新分散处理后 ,分别采
用 100 g和 300 g 3 次离心提取土壤真菌 ,结果表明 ,所提取的
真菌量分别达到土壤真菌总生物量的 11 %和 27 %.
213 　土壤微生物的分离提取过程对微生物活性的影响
　　Lindahl 和Bakken[21 ]研究了超声波、韦林氏搅拌器和旋转
杵 3 种物理分散作用对细菌细胞损伤的影响. 结果表明 ,超声
波对微生物细胞具有显著的损伤作用 ,处理时间愈长 ,功率愈
大 ,其损伤作用愈大 ;对于处于指数生长期的细菌 ,超声波处
理 15～45 s对细胞的杀伤作用可达 40 %以上 , 对休眠期细胞
的杀伤作用相对较小 ,一般在 30 %以下. 使用旋转杵机械分
散 1～3 min 对土壤微生物的损伤约为 10 % ,而韦林氏搅拌器
对土壤微生物活性的影响则十分微小. 物理分散作用对土壤
微生物活性的影响大小主要与机械作用的强度与时间有关.
Faegri 等[10 ]研究了土壤样品与离子交换树脂、玻璃珠共振荡
2 h 对真菌菌丝长度分布的影响 ,约有 1/ 3 的菌丝被打碎成 <
22. 5μm的碎片 ,另有 22. 5～50μm 的碎片占 1/ 3. 可见分散
过程对菌丝的机械损伤十分明显. 这种损伤作用无疑会对微
生物的生理生化活性产生重要影响.
3 　土壤微生物的纯化
311 　两相分离技术 (Aqueous Two2phase Partitioning)
　　两相分离技术最早形成于 20 世纪 50 年代 ,为德国化学
家 Albertsson 所建立 ,当时主要用于生物大分子的分离[1 ] . 之
后 ,该技术逐步发展成为一种温和的生物分离法 (Bio2separa2
tion) ,广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域生
物大分子、细胞及病毒的分离[1 ,2 ,11 ,27 ,31 ,38～40 ] . 关于其分离机
制目前尚不完全清楚 ,有人认为其分离的原理主要取决于不
同组分的亲水性差异[2 ] ,也有人认为还与不同组分的电荷性
质差异有关[8 ,16 ,17 ] .当两种互不相溶的聚合物或是一种聚合
物与一种无机盐以一定浓度溶于水中时 ,便可形成不同的两
相 ,被分离组分由于其与不同相的亲和力不同 ,分别进入不同
相从而达到分离的目的.目前应用最为广泛的是 PEG(聚乙二
醇) / Dextran(萄聚糖)系统和 PEG/ 无机盐 (磷酸盐或硫酸盐)
系统.前者由于 Dextran 价格较为昂贵 ,多用于实验室小规模
的分离纯化 ,后者使用无机盐价格较便宜 ,常用于工业化规模
分离纯化.
312 　细菌的纯化
　　Strom等[34 ]成功地将两相分离技术应用于微生物与有机
废弃物及泥炭的分离. 在此项工作的启发下 ,Smith 和 Strib2
ley[33 ]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体
微生物的效果.其分离纯化过程 :土样加入胆酸钠、钠离子交
换树脂和玻璃珠一起在 4 ℃下振荡分散 2 h , 经分散处理的
土壤悬液过孔径为 20μm 筛 ,其滤液中含有大多数的土壤细
菌 ,可直接进入 PEG/ Dextran 两相分离系统纯化. PEG(平均
分子量为 503 000 道尔顿)与 Dextran(分子量为 8 000 道尔顿)
在两相分离系统中的比例分别为 2 %和 6 %(w/ w) ,加入适量
土壤滤液及蒸馏水使分离系统总质量为 100 份. 经充分混合
后静置一定时间 ,即可形成上下两相体积比约为 4∶1 的两相
分离系统.细菌主要富集在上层 PEG相 ,土壤残存颗粒将进
入下层 Dextran 相.用吸管将上层 PEG相转移出来 ,加入相同
质量的 PEG,对残留于底层的细菌重复提取纯化 3 次 ,所有操
作过程均在 4 °C 下进行. 经 4 次提取纯化 ,富集在上层 PEG
相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的 60 % ,而上
层 PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的 4 %以下.
　　Puri 等[30 ]应用该技术与15 N 示踪技术相结合 ,成功地研
究了土壤细菌与非细菌两大部分微生物对加入无机态氮的同
化作用 ,结果表明这两大部分微生物对无机氮的固定存在较
大差异 ,在短期内 (2 d)对 N 的固定与矿化起主要作用的是非
细菌部分 (主要为真菌) . 这预示着两相分离技术在未来土壤
C、N、S和 P元素循环研究中将具有广阔的应用前景.
313 　真菌的纯化
　　研究表明 ,两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤
真菌. Marco 等[28 ]研究了应用 PEG/ Dextran 两相分离体系从
真菌中分离提取香料化合物的效果.当上下两相比例不同时 ,
PEG/ Dextran 两相分离体系具有不同的分离功能 ;通过调整两
相比 ,可以促使真菌菌丝进入不同相. 例如 ,当上下两相比 Vr
为 1∶4 时 ,约有 93 %的真菌富集在上层 PEG相 ;而当 Vr 为
4. 6∶1 时 ,99 %的真菌菌丝将沉积在下层 Dextran 相. 因此 ,通
过研究选择适宜的 Vr 值 ,将两相分离技术应用于土壤真菌的
分离纯化完全有可能取得令人满意的结果. 此外 ,在选矿及环
保领域应用较为广泛的浮选法亦是可供借鉴的有效方法 [42 ] .
4 　研究展望
411 　从土壤中分离提取获得的较为纯净的微生物样本 ,可直
5543 期　　　　　　　　　　　　　向万胜等 :土壤微生物的分离、提取与纯化研究进展　　　　　　　　
接应用分子生物技术 ( PLFA、FAME 和 DNA 分析) 开展生物
多样性研究 ,以获得土壤微生物群落组成和功能等方面信息.
412 　应用分离纯化技术将土壤微生物提取出来后 ,使研究营
养元素在不同群落微生物中的分配与转化成为可能. 例如 ,与
15N 和32 P示踪技术相结合 ,可以很容易地研究 N、P 元素在细
菌和真菌两大群落中的分配和转化规律.
413 　从土壤中分别提取和纯化所得到细菌和真菌样品 ,可应
用碳自动分析仪测定其细菌生物碳和真菌生物碳量 ,可直接
估计土壤微生物中细菌和真菌两大群落的生物量组成.
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作者简介 　向万胜 ,男 ,1964 年生 ,博士生 ,副研究员 ,主要
从事土壤肥力与农业生态方面的研究 , 发表论文 30 余篇.
Tel :073124615222 ,E2mail :wsxiang @ms. csiam. ac. cn
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