全 文 ：不同温湿度下白僵菌对松毛虫的
侵染致病效应*
林华峰 樊美珍 李增智 (安徽农业大学植保系,合肥 230036)
胡 萃 (浙江农业大学, 杭州 310029)
摘要 采用荧光显微技术和电镜扫描技术,对 33 个温湿度组合条件下球孢白僵菌孢子
在马尾松毛虫活体上的萌发、侵染进程和致病效果进行了观察与测定,分析了三者之间的
关系.揭示了孢子萌发速率与环境温度的关系: V = ( T - 4. 25) / 27. 2. 其中, 孢子萌发的
起点温度为 4. 25 ! ,有效积温为 27. 2日度. 湿度是孢子萌发和侵染致病的主要制约因子,
且温度和湿度具有互补与综合作用. 温度达 10 ! 以上,相对湿度达 95% ,侵染致病效应更
为显著.
关键词 球孢白僵菌 马尾松毛虫 荧光显微技术 侵染效应
Pathogenic effect of Beauveria bassiana infected on Dendrolimus punctatus under different
temperature and humidity. L in Huafeng, Fan Meizhen, Li Zeng zhi ( Anhui Agricultural Uni
ver sity , H ef ei 230036) and Hu Cui ( Zhejang Agr icultural University , Hangzhou 310029) .
Chin . J . A pp l . Ecol . , 1998, 9( 2) : 195~ 200.
By means of fluo rescence microscopic and electron scanning microscopic techniques, the conidi
um germination, infection process and pathogenic effect of Beauver ia bassiana on the larv ae of
Dendrolimus punctatus were observed and tested under conditions of 33 combinations of tem
per ature and humidity . The results show that the relationship betw een germination velocit y
( V ) of the conidia and temperature( T ) was determined as V = ( T - 4. 25) / 27. 2, w here
4. 25 ! w as the initial temperatur e, and 27. 2 was the effective accumulated temperatur e in a
day for conidium germination. Humidity w as t he main restrictive facto r for the germination and
infection of conidia, and temperature and humidity had compensatory and comprehensive ef
fects. Pathogenic effect could occur remarkably under the condition of above 10 ! and 95% rel
ativ e humidity.
Key words Beauver ia bassiana, Dendrolimus punctatus , Fluorescence micr oscope tech
niques, Infection effect .
* 国家∀ 八五#科技攻关项目( 85- 18- 03- 02) .
1997- 09- 26收稿, 1998- 02- 09接受.
1 引 言
球孢白僵菌( Beauver ia bassiana,简称
白僵菌)作为重要的真菌杀虫剂早已被美
国、前苏联等国用于防治多种农业害虫.
在我国,防治松毛虫、玉米螟等重要害虫也
曾获得过大面积的成功[ 1] . 使用中发现,
在有些年份防治效果不太稳定, 尤其受温
湿度等气候因素影响较大. 虽然白僵菌对
温湿度的要求屡见报道, 但由于实验环境
或观测手段的不同,测得的结果不尽一致,
如在人工培养基上测得的孢子萌发温度比
在活体上要高 10 ! 以上[ 7, 10] ,不同国家在
不同寄主上测得的结果也有差异[ 2, 7~ 10] .
本试验采用荧光显微技术和电镜扫描技
术,观测了 33个温湿度组合条件下,白僵
应 用 生 态 学 报 1998 年 4 月 第 9 卷 第 2 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Apr. 1998, 9( 2)∃195~ 200
菌在马尾松毛虫( Dendrol imus punctatus )
体上的宿存与侵染过程, 并观察了寄主的
致病反应,以求较精确地测定白僵菌侵染
致病的温湿度要求, 明确病原活动与致病
过程以及温湿度条件之间的关系, 对白僵
菌致病病理学与生态学作进一步探讨.
2 材料与方法
2. 1 供试菌株
代号为 B5S, 分离自陕西紫阳的一种泥蜂
( A mmophila sp. ) ,经生物测定, 对马尾松毛虫幼
虫毒性很强. 有关生物学特性研究已有报
道[ 3~ 6] .在 SDAY 培养基上培养得新鲜孢子粉,
经测定,其孢子萌发率达 100% .
2. 2 供试寄主昆虫
新采的马尾松毛虫 3 龄幼虫经室内饲养 3d,
选健康活泼者,以鲜洁松针饲喂备用.
2. 3 虫体喷菌处理
用直径为 9cm 的培养皿, 每皿分放 15 头试
虫.用手持小型喷粉器均匀喷菌粉, 喷菌量经表
皮镜检约为 5000 孢子%mm- 2. 以不喷菌试虫为
对照.
2. 4 温湿度控制
设置 1、3、5、7、9、11、13、15、17、20、25 ! 11 个
温度水平, 用光照培养箱分两批处理. 湿度用密
闭的空间(塑料饭盒 )内不同浓度的饱和盐控制,
设 3 个水平: 湿度 75% , 100ml 水中加 100g
NaNO 3; 湿度 85% , 100ml水中加 40gKCl; 湿度
95% , 100ml水中加 25gK 2SO4 .共 33 个温湿度组
合.每处理 3 次重复.
2. 5 取样与观察
每两天 1 次,清除粪便, 更换松针, 观察试虫
行为与症状, 记载死虫与白僵出现的时间. 每两
天在每处理中取出 1 头,立即用 4%甲醛液固定,
20d 后取样间隔时间延长至 1 周, 至第 70 天结
束.固定后,取背部表皮, 经 Calcoflour w hite 荧光
染色剂( Cigma公司出品)染色, 在 Olympus 荧光
显微镜下观察菌体在寄主上的宿存与发展状况,
并对不同发展阶段作定量记载. 典型阶段使用
XL20电镜扫描, 观察孢子的形态变化和侵染过
程.根据上述观察结果, 分析菌体的活动与致病
效果的关系以及温湿度对侵染进程的影响.
3 结果与分析
3. 1 白僵菌的侵染过程
白僵菌侵染寄主要经过孢子附着、萌
发、侵入表皮和菌丝生长 4 个阶段.在这 4
个阶段中,菌体形态会产生一系列变化.根
据对菌粉处理后马尾松毛虫表皮的荧光显
微和电镜扫描观察结果,可对 4个阶段的
形态作如下划分: 1)孢子附着阶段.孢子吸
附到虫体表皮后,可吸收环境中的水份,使
孢子膨大、变形,常变成规则的多角形,体
积最大可膨胀到原来的 4~ 5倍,遇较干燥
的环境(如 75%的湿度下) ,孢子长期保持
原状,不膨大变形.原形孢子和膨大变形的
孢子都可归为附着阶段(图 1A) . 2)孢子萌
发阶段.通常是膨大变形的孢子从一角伸
出尖芽来.比起其它处的突起尖而长,并不
断生长.从孢子露芽到侵入表皮之前为孢
子萌发阶段 (图 1B) . 3)侵入表皮阶段. 延
伸的芽管转向表皮,象钉子钉向表皮,表皮
处只看见孢子以及孢子与侵入点之间的一
段菌丝(图 1C) .该段的划分标准是从芽管
侵入表皮到菌丝穿透表皮进入体腔. 4)菌
丝生长阶段.侵入以后,菌丝分枝可向各个
方向生长,其中部分菌丝可穿透体壁长出,
镜下可见菌丝段(图 1D)或成束的菌丝;菌
丝生长阶段的后期,大量菌丝长出,菌丝索
肉眼可见.
3. 2 温湿度对白僵菌孢子萌发的影响
3. 2. 1 湿度对孢子萌发结果的影响 孢子
萌发是白僵菌对寄主侵入的前题条件.表
1列出了 33种温湿度组合下,孢子的总萌
发率以及开始萌发的时间( d) .表中数据为
荧光显微镜观察的每次取样中各处理的 3
次重复平均值. 由此可看出湿度对孢子萌
发率、温度对萌发时间影响更为显著.
196 应 用 生 态 学 报 9 卷
图 1 白僵菌侵染过程的 4个阶段
Fig. 1 Four stages of B. bassiana infect ion process.
A.孢子附着阶段Conidia at tachment stage, B.孢子萌发阶段 Conidia germinat ion stage, C .侵入表皮阶段 In vaded epider
mis stage, D.菌丝生长阶段Hyphae growth stage.下同T he same below.
表 1 不同温湿度条件对白僵菌萌发的影响
Table 1 Germination of Beauveria bassina under different
RH- temperature condititons
温 度
T emperature
( ! )
RH 75%
& ∋
RH85%
& ∋
RH95%
& ∋
1 ( 0 ( 0 ( 0
3 ( 0 ( 0 ( 0
5 ( 0 ( 0 10. 00 48. 0
7 ( 0 ( 0 8. 67 61. 0
9 ( 0 ( 0 7. 33 64. 7
11 ( 0 35 13. 3 5. 33 100
13 ( 0 28 6. 7 3. 33 100
15 ( 0 18 23. 3 2. 67 100
17 ( 0 16 37. 3 2. 00 100
20 ( 0 12 16. 7 1. 67 100
25 ( 0 10 5. 3 1. 33 100
& .始萌时间 Germinat ion t im e( d) , ∋ . 总萌发率 T otal
germ ination rate( % ) .
表 1 显示, 在 95%湿度中, 孢子萌发
率最高,速度最快. 85%的湿度中, 部分温
度处理中可见孢子萌发, 但比起 95%湿度
中,萌发时间平均滞后 17. 12d, 较低温度
(11 ! )下, 滞后可达 1 个月; 而萌发率平
均降低 86. 07% ,且在 10 ! 以下就不能萌
发. 75%的湿度中,各处理中孢子均不能萌
发.由此可见, 孢子萌发需要高于 75% 以
上的湿度, 85% 的湿度中, 仅部分孢子萌
发,且时间滞后, 只有 95% 的湿度最为适
宜.湿度对孢子的萌发率和萌发时间均有
明显的影响.
3. 2. 2 温度对孢子萌发的影响 如前所
述,在 95%的湿度处理中, 孢子萌发能力
得以充分表现.此湿度中,低于 5 ! 孢子就
不能萌发; 5 ! 以上, 随温度上升萌发所需
时间缩短,在 1~ 10d范围内变化,其变化
规律可用直线回归方程表示(表 1) . 现以
95%的适宜湿度下的萌发结果为依据,应
用∀最小二乘法#原理, 归纳萌发速率 V
与温度T 的关系为:
V =
T - C
K
=
T - 4. 25
27. 2 ( r = 0. 9853)
式中, C 为萌发起点温度, K 为有效积温.
卡平方测验 ( X 2V = 0. 2193 < X 20. 05 =
15. 51)表明, 拟合的理论值与实际值高度
符合.
此外, 在 95% 的湿度中, 孢子萌发率
1972 期 林华峰等:不同温湿度下白僵菌对松毛虫的侵染致病效应
G ( %)和温度 T 存在着一定的关系: G =
18. 6111+ 4. 5117T ( r = 0. 8433) . 而 85%
的湿度中, 相关性则不明显( r = 0. 5581,
r0. 05, 10= 0. 576) , 75%的湿度中, 任何温度
均不能使孢子萌发.
3. 3 不同温湿度下白僵菌对寄主的侵染
进程
在侵染过程的 4 个阶段中, 就群体来
说,以孢子发育至该阶段的菌体数达到上
一阶段菌体数 16% (即始盛期) ,作为该阶
段的真正开始, 但第二阶段有些特殊,由于
有些处理中, 最终萌发率甚至达不到
16% ,故该阶段以出现孢子萌发时算起.按
此标准,将不同温湿度下各处理 3 个重复
的荧光显微观测值平均并绘成图 (图 2) ,
便可看出其侵染进程的差异:在 95%的适
宜湿度和孢子发育起点温度以上, 侵染进
程随温度升高而加快(图 2) ,在 5 ! 时, 需
要 14d以上才侵入寄主表皮; 15 ! 时,需要
6d以上; 25 ! 最快只需 3d, 6d 就进入菌丝
大量生长阶段 (通常也是致死阶段) . 在
85%湿度下,各温度处理中不仅孢子萌发
率大幅下降, 对寄主的侵染进程也大大减
慢(图 2) . 25 ! 下完成一个侵染过程需要
28d, 比在 95%湿度下延长 10d. 随着温度
的降低, 侵染进程更为缓慢. 而在 75% 湿
度下,各处理中孢子仍处于附着状态,不能
萌发侵染.
3. 4 温湿度对致病效果的影响
70d的系统观察结果(表 2)表明, 3种
湿度下,相同时间内,试虫校正死亡率随温
度升高而升高, 15 ! 以上, 升高速率加快,
25 ! 下, 死亡率最高. 95% 湿度下, 超过
20d, 11 ! 以上的各处理可全部死亡, 28d
虫尸可全部变白. 85%湿度下, 5 ! 以上,各
处理也有一定死亡率, 但死亡很慢, 28d内
死亡率最高不超过 55% , 僵虫略有收缩,
仅在 11 ! 以上的处理中,有部分僵虫从腹
图 2 不同温度下白僵菌对松毛虫的侵染进程
Fig. 2 Infect ion course of B . bassiana on D . p unctatus un
der dif ferent temperature.
部局部长出白色菌丝但不能全身发白.
75%的湿度下,也能测得一定的死亡率,但
直到 70d也不出现白色症状,死亡后,虫体
高度干燥收缩.
由表 2(对照图 2)可见, 95%湿度、不
同温度下马尾松毛虫的致病反应与白僵菌
孢子的发育和侵染进程一致. 在 75%和
85%两个湿度水平, 各处理的死亡时间比
镜下观测出的表皮侵染所能致死的时间有
所提前,且引起病理死亡的最低温度(与对
照比较)比有侵染表现的处理要低几度.低
湿和或低温环境下白僵菌可以使寄主致
病,但菌丝不能穿出表皮而在体外生长,因
而虫尸仅表现为收缩干燥而不发白.
白僵菌对松毛虫的侵染与致病是病原
198 应 用 生 态 学 报 9 卷
表 2 不同温湿度下白僵菌的致病效果
Table 2 Infection effects of B. bassiana under different
RH- temperature conditions
RH
( % )
温 度
Temper
ature
( ! )
处理天数 Days
6 15 28 52
75 1 0 0 0 0
3 0 0 0 0
5 0 0 0 0
7 0 0 0 12. 0( ) )
9 0 0 0 3. 3( ))
11 0 0 0 30. 0( ) )
13 0 0 2. 2( ) ) 20. 2( ) )
15 0 4. 4 9. 4( ) ) 48. 1( ) )
17 0 2. 2 9. 4( ) ) 31. 8( ) )
20 0 4. 4( ~ ) 13. 3( ) ) 51. 3( ) )
25 0 6. 7 8. 8( ) ) 45. 5( ) )
85 1 0 0 0 0
3 0 0 0 0
5 0 0 0 0
7 0 0 11. 1( ) ) 13. 5( ) )
9 0 0 20. 0( ) ) 28. 8( ) )
11 0 0 37. 8( ) ) 21. 3( ) )
13 0 0 26. 6( ) ) 17. 6( ) + )
15 0 6. 7 44. 4( ) ) 63. 2( ) )
17 2. 2 4. 4( ~ ) 45. 2( ) ) 71. 4( ) + )
20 0 9. 4( ~ ) 40. 0( ) ) 100( )+ )
25 0 13. 3( ~ ) 48. 0( ) ) 100( )+ )
95 1 4. 4 0 0 0
3 0 0 0 0
5 0 0 0 64. 0( + )
7 0 5. 7( ~ ) 26. 7( + ) 100( + * )
9 0 10. 3( ~ ) 48. 9( + ) 100( + * )
11 2. 2( ~ ) 22. 2( ~ ) 100( + ) -
13 0( ~ ) 31. 6( ~ ) 100( + * ) -
15 0( ~ ) 51. 1( ~ ) 100( + * ) -
17 4. 4( ~ ) 42. 4( ~ ) 100( + ) -
20 6. 7( ~ ) 77. 8( ~ ) 100( + ) -
25 6. 7( ~ ) 100( * ) 100( + ) -
注:表中数字为校正死亡率( % ) ; ~ 为出现衰弱病态; )
为虫体干燥收缩; * 为多种病菌混生; + 为长出白色菌
丝.
与寄主相互作用的结果. 环境中温湿度条
件不仅可影响白僵菌孢子的萌发与侵入,
也会影响松毛虫的免疫防御能力. 松毛虫
幼虫对温度的要求与白僵菌大致相同, 但
对湿度的要求则有些差异, 过低 ( 75% 以
下)或过高( 95%以上)的相对湿度对其生
长发育都不利[ 3] . 本试验中, 已表现出在
低湿环境下寄主的非病理性死亡, 而高湿
条件下,侵染致病效果显著,除了由于环境
对病原的发展有利而外, 也不排斥寄主防
御能力下降的因素.
4 讨 论
4. 1 侵染致病的温度条件
关于白僵菌孢子萌发所需的起点温
度,有的报道认为在 2 ! 下能侵染昆虫致
死[ 7] ,也有的认为在人工培养基上 15 ! 以
上才能萌发[ 10] .本试验通过系列温度水平
的侵染试验, 测得孢子萌发起点温度为
4. 25 ∗ 0. 56 ! ,有效积温为 27. 2 ∗ 0. 23日
度且观察值与理论值高度符合,这一结果
与多数人的看法相一致[ 1~ 3] .所测得的关
系式 V = ( T - 4. 25) / 27. 2,可计算一定温
度下孢子萌发所需时间, 同时表 2、表 3还
表明了一定湿度、不同温度下完成侵染过
程所需的时间. 这在白僵菌的实验生态学
研究及林间致病效果的预测中,有一定的
参考价值.
4. 2 侵染致病的湿度条件
由于湿度的控制有一定的误差范围,
不能设置象温度那么多的水平.故在前人
研究[ 9, 10]的基础上,设置了 3个代表性水
平.试验表明,孢子在表皮的萌发和侵入需
要 85%以上的湿度.尤其在 95%以上,孢
子可全部萌发, 僵虫在表面都能形成孢子
粉(发白) . 85%时,只有部分孢子可萌发侵
入,僵虫仅在腹面体表长出少量菌丝,不易
觉察. 75%下,体表孢子不能萌发,但最终
也能导致寄主少量死亡. 据组织切片显微
观察(另文报道) ,是由于部分孢子随食物
由消化道侵染所致.
4. 3 温湿度的互补和综合作用
温度和湿度都可单独地影响孢子的萌
发和侵染致病, 如 75%的湿度条件下, 不
论温度多么适宜, 虫体表面孢子都不能萌
发侵染.同样, 4 ! 以下, 湿度再适宜,也不
会使寄主发病. 但在孢子萌发的起始温度
和起始湿度以上,温湿度通常是相互影响、
综合起作用的, 尤其是其中一个因子处于
1992 期 林华峰等:不同温湿度下白僵菌对松毛虫的侵染致病效应
对病菌不适宜的水平, 另一个因子可起到
互补作用. 如在 85%湿度、25 ! 下孢子开
始萌发的时间, 与 95%湿度、5 ! 下的相当
(表 1) .在 85%湿度下, 若使第 28 天寄主
达到 48%的死亡率,要求具有 25 ! 的环境
温度,而将湿度提到 95%,只需 9 ! 的环境
温度即可达到同样结果(表 2) .
温度和湿度的有效结合是使松毛虫快
速致死的重要条件. 本试验中, 95%湿度与
10~ 25 ! 间的温度组合, 致病较快,死亡率
达100% ,是引起较高致病率所需的理想
温湿度条件.
本试验归纳了较低温度下白僵菌侵染
寄主的进程, 关于侵染的温度上限多认为
是35 ! [ 1, 2] . 在 25 ~ 35 ! 范围, 虽能使寄
主快速死亡,但由于易受杂菌干扰,且高温
也是昆虫致死因素, 故其侵染进程不易准
确测定.
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