全 文 ：转 Bt基因作物毒素土壤存活特性及与土壤
性质的关系研究进展*
孙彩霞
陈利军* *
武志杰
(中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016)
摘要
随着转 Bt基因作物的推广和应用, 其对生态环境及其它方面可能产生的影响越来越受到重视.
加之 Bt毒素蛋白检测技术的发展, 国外学者们围绕纯化毒素蛋白与土壤的相互关系等方面开展了大量研
究,并取得了一些结果.本文介绍了转 Bt基因作物产生的毒素蛋白的杀虫特性, 杀虫蛋白的测定方法, 转
Bt 基因作物向大田释放存在的潜在风险及土壤矿物质、有机质、有机矿质复合体对纯化 Bt 毒素存活的影
响, 毒素在根际土壤中的行为等方面的研究现状. 最后,提出了今后有关研究中应注意的几个问题.
关键词
转基因作物
Bt
毒素蛋白
土壤性质
文章编号
1001- 9332( 2002) 11- 1478- 05
中图分类号
S188
文献标识码
A
Research advances in soil persistence characteristics of toxins released by transgenic Bt crops and their relation

ships with soil properties. SUN Caixia, CHEN Lijun and WU Zhijie ( I nstitute of Applied Ecology , Chinese A

cademy of Sciences , Shenyang 110016) .
Chin. J . A pp l . Ecol. , 2002, 13( 11) : 1478~ 1482.
With the popularization and application of transgenic Bt crops , and increasing attention has been paid to their po

tential impact on ecological environment and other aspects. And, as the development of detecting techniques for Bt
tox in protein and soil were made by oversea resear chers. T his paper reviewed t he current situation of the studies
on the insecticidal character istics and detecting methods of toxin prot eins released by transgenic Bt crops, the po

tentical risk of their field r elease, the impact of soil miner al, organic matter and organo
mineral complex on the
persistence of pur ified Bt tox ins, and the behavior of Bt tox ins in rhizospheric soil. Based on our resear ches, several
problems which should be paid attention to in related studies were also pointed out.
Key words
T ransgenic crops, Bt, T ox ins protein, Soil properties.
* 国家自然科学基金资助项目( 40101016) .
* * 通讯联系人.
2002- 01- 23收稿, 2002- 04- 17接受.
1
引

言
基于 DNA 重组技术和植物细胞、组织培养技术的逐步
成熟, 在 1983 年诞生了第一例转基因植物 ! ! ! 转基因烟
草[ 59] . 随后, 人们对许多作物都进行了转基因改良的尝试,
使用外源基因包括除草基因、抗病、抗虫基因等以改善作物
性状.转基因植物的种植也从实验室转向田间试验, 到 1995
年多种转基因植物进入大规模商业化应用阶段.转基因作物
一旦在生态环境中稳定下来,随着时间的推移可能会在生态
系统中积累和产生级联效应.转基因生物体对人类和环境的
影响将会是长期的,很多影响可能产生时滞效应, 而不像非
生物影响那样随时间而减小, 随距离而减弱. 大量的转基因
生物是以特殊的生命形式,以超过自然进化千百万倍的速度
介入到自然界中来的, 在给人类带来巨大利益的同时, 也可
能蕴涵一定的危险.因而科学家们认识到必须加强生物安全
相关问题的研究,及时评估和监测可能引起的风险, 从而研
究制订有效的防范措施和补救措施,以确保生物技术沿着健
康的道路发展[ 27] . 我国在这方面的研究起步较晚,尤其是转
基因作物对土壤性质的影响研究尚属空白.国外的相关研究
已经取得了一些结果,本文对这方面的最新研究进展进行了
综述,期望促进我国在此领域的研究.
2
Bt杀虫蛋白及转 Bt基因作物


苏云金芽孢杆菌( Bacillus thur ingiensis )是一种革兰氏
阳性菌,分类上属原核生物细菌纲芽孢菌科芽孢杆菌属, 在
地球上分布广泛 . Bt 杀虫晶体蛋白 ( insecticidal crystal pro

tein)是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的. Bt 杀虫
蛋白可分为

外毒素, 
外毒素,
内毒素和虱因子.其中用
于转基因植物的主要是
内毒素.
内毒素在昆虫中肠的
碱性和还原性环境下被降解为 60kDa左右的活性肽, 并与受
体蛋白结合, 嵌合于细胞膜,引起膜穿孔, 最终导致昆虫瘫痪
或死亡.菌体内的杀虫蛋白以一种前体的形式存在, 称为原
毒素( protox in) ,并自发形成伴胞晶体. 晶体的形成可在一定
程度上防止杀虫蛋白在环境中降解. 不同种类的杀虫晶体蛋
白(就原毒素而言)分子量不同, 大致有 3 个区域范围: 129~
138、65~ 78 和 25~ 29 kDa.由于 Bt基因对高等哺乳动物和
人类极为安全, 是一种十分理想的杀虫基因, 也是当前使用
最为广泛的抗虫基因[ 2, 4, 8, 12, 26] .


Stahly 等[ 39]首先确定了 Bt杀虫晶体蛋白基因的位置和
可操作性. 此后,科学家们纷纷将 Bt杀虫晶体蛋白基因导入
应 用 生 态 学 报
2002年 11 月
第 13 卷
第 11 期





























CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Nov . 2002, 13( 11)∀1478~ 1482
其它微生物 ,构建或改良可产生杀虫晶体蛋白的工程菌株;
或将其改造后转入植物体, 以期获得抗虫的转基因植
物[ 32, 49] .转 Bt基因植物的首次成功报道是 1987 年 Vaeck
等[ 49]人用农杆菌介导法获得的抗烟草天蛾的转 Cry1Ab 烟
草植株,当害虫取食植物组织时, 转 Bt 基因植物能自己产生
杀虫蛋白,抑制并杀死害虫. 至 1997 年, 通过用不同的 Bt基
因和转化方法,在世界范围内已获得 50 多种抗虫转 Bt 基因
植物.目前, 转 Bt基因的抗虫棉花、玉米和马铃薯等已进入
商品化生产[ 27] .
3
Bt杀虫蛋白的检测方法
31
Western 印迹分析法


Western印迹分析是在蛋白质水平上检测转基因植物中
的目标蛋白质,可为外源目的基因在植物中的整合与表达提
供最直接的分子生物学证据. Western 印迹分析结果能证明
在转基因植株中是否表达出了杀虫蛋白质. 该方法费时、费
力,且难度较大, 定量准确性也不高[ 22, 44] .
32
生物测试法


生物测试法以目标害虫取食转 Bt 作物组织后的死亡
率、化蛹率、羽化率、体重变化等作为指标, 但需要统一虫源、
虫龄和饲养条件,且占用的空间大, 检测所需的时间长, 环境
因素干扰大,难以对大量的样品进行检测[ 13, 20, 57] .
33
SDS
PAGE 法


SDS
PAGE法通过 SDS
PAGE 电泳检测在转基因植株
中是否表达出了杀虫蛋白质,与薄层扫描测定相结合可以进
行进一步分析[ 44, 48, 53] .
34
ELISA 法


ELISA法利用抗原抗体特异性结合以及酶法测定原理,
具有所需样品少, 测定时间短, 操作标准, 检测极限高等优
点,可定量和对大量样品进行检测[ 40, 44, 45] . 国外这方面的研
究开展较早, 对转 Bt 基因的棉花已开发出相应的检测试剂
盒和试纸, 但一般作为商业机密对技术和产品进行控制. 美
国 Envioro logix 公司生产的 Cry1Ab/ Cry1Ac平板试剂盒是定
量检测 Bt杀虫蛋白的专用试剂盒, 已经在 Bt 玉米、水稻上
应用[ 57, 58] .国内在这方面起步较晚,中国农业大学作物化学
控制研究室、北京大学生命科学学院环境生物学与生态学教
研室等单位研究了 Bt 作物杀虫蛋白的免疫学检测方法, 制
备出高效的抗血清,研制出了 ELISA检测试剂盒[ 22, 52] .
4
转 Bt基因作物释放存在的潜在风险


苏云金杆菌制剂通常是细胞、孢子和多分孢子晶体的混
合物,被作为微生物杀虫剂已经有 30 多年,并没有关于非目
标性毒素的报告. Bt 毒素前体对于人畜来说是安全的, 因为
被昆虫取食到中肠内的毒素前体需要高 pH(大约 10. 5)和
特殊的蛋白酶, 才能裂解成具有活性的毒素[ 21] . 另外, 由于
苏云金杆菌在自然生境下(如土壤中 )很难存活或很好地生
长,或由于紫外线辐射而很快失活[ 8, 53] ,在自然的生境中可
能很少或没有长期存在的毒素[ 1, 33, 52, 54, 55] . 然而, 当编码合
成毒素的基因通过基因工程转入到天生或已适应某一特殊
生境而能存活并且繁殖的生物体时, 这些毒素也许能够在此
种生境下继续存在并累积. 因而当获得编码苏云金芽孢杆菌
亚种抗虫毒素的遗传修饰体 ! ! ! 转基因细菌和植物,向环境
释放时可能会对环境产生负面影响[ 13, 21] .即转 Bt 基因作物
在田间的释放, 可能使土壤中毒素浓度比使用苏云金杆菌制
剂的高, 并且存在很长时间且超过由 Bt 商业制剂导入的毒
素[ 45, 46] .如果这些毒素被结合到环境中的其它颗粒(例如土
壤矿物质) , 而不易被微生物降解, 并仍然保持毒素活性, 这
将加剧毒素的积累. 尤其是插入作物体内的修饰基因不是编
码合成非毒性的原毒素( non
toxic protox ins) , 而是编码活性
毒素的合成[ 50] ,因而活化原毒素的高肠道 pH 和专一蛋白酶
将不是其产生毒性的必需因素了. 导入土壤的毒素存活能力
主要取决于: 1)加入浓度; 2)昆虫幼体消耗和钝化的速度; 3)
微生物降解的速度. 如果毒素合成或残留的量超过了消耗、
钝化和降解的量, 则可能积累到一定浓度而导致: 1)对非目
标生物体的持续危害, 如土壤微生物区系、有益昆虫(如传粉
昆虫、捕食动物和害虫的寄生虫)和其它动物类[ 14, 17, 23] ; 2)
对目标害虫毒素抗性的选择和富集[ 14, 16, 17, 19, 24, 29] .
5
纯化毒素与土壤性质的关系
5 1
土壤矿物质


Stotzky 等[ 42]已经研究了酶和其它蛋白、细菌与土壤的
吸附和结合以及这种表面相互作用对生物降解抗性和蛋白
性物质活性的影响. V enkatesw er lu 等[ 51]研究表明, Bt 亚种
kurstaki 产生的毒素( Btk 毒素)和亚种 tenebr ionis 产生的毒
素( Btt毒素)能快速被土壤吸附并紧紧地结合, 但结合蛋白
的结构并未被修饰. T app 等[ 45, 46]研究表明, 当毒素被添加
到土壤中, 它们与土壤微粒结合,在非灭菌条件下 40d 后, 用
点印迹酶联免疫法( dot blot EL ISA )检测到具有杀虫活性.
毒素与土壤微粒的结合, 不易被微生物降解[ 25] , 且没有消除
杀虫活性[ 45, 46] . T app 等[ 44]认为, 通过污染土壤的研究也许
更能反应现实的环境条件, 因为土壤矿物质和沉积物具有混
合的阳离子补充物, 而且部分被离子、铝、锰的螯合态氧化物
以及有机质包被. 因而他们研究了 Btk 和 Btt 毒素与经阳离
子同离子化的蒙脱石和高岭石(# 干净∃土壤)或包被有两种
类型聚合态氢氧化铁( % )的蒙脱石和高岭石(# 污染∃土壤)
的吸附与结合. 结果表明, 蒙脱石和高岭石快速吸附 Btk 和
Btt毒素(即从转基因植物和微生物体中释放的毒素) , 在土
壤中仅在很短时间内呈游离态, 易被微生物降解的数量也较
少.其它研究表明,蛋白与土壤矿物质结合后对其降解具有
抗性[ 42] .虽然污染土壤比干净土壤具有更大的外表面[ 15] ,
有可能增加毒素吸附量,但二者吸附趋势基本相同, 表明吸
附的机制相同, 而且蛋白并未插入土壤表面的介于聚合态氢
氧化铁球状体或杆状体间的空间. Btk 和 Btt 毒素与土壤结
合后, 其结构无明显的变化,表现在: 1)氨化物&和∋的谱带
在位序上仅有微小位移; 2) SDS
PAGE 上解吸毒素在迁移率
上无明显改变; 3) do t
blot EL ISA 表明 , 土壤
毒素复合体被
147911 期








孙彩霞等: 转 Bt 基因作物毒素土壤存活特性及与土壤性质的关系研究进展










适当的抗体激活了,从而能检测到毒素蛋白的存在. 另外研
究结果亦表明, pH 对土壤吸附 Btk 和 Btt 毒素有明显的影
响.在 pH 低于或高于大约为 6 的条件下, 吸附下降. 在 pH6
以下,两种毒素溶解性下降[ 3, 5] . Venkateswerlu [ 51]以及 T app
等[ 48]研究了土壤矿物质与蛋白的吸附和结合,并提出了土
壤中这些毒素的存在和积累的机制.
52
土壤有机质


土壤有机物质改善了土壤结构、持水性和通气性, 是土
壤微生物和细菌的重要营养来源.由于其具有高度特殊的表
面积和离子交换能力,是植物营养素、重金属和有机物质(例
如杀虫剂)的重要吸附剂[ 41] . Dick 等[ 9]研究表明, 有机质对
土壤酶具有稳定作用. 酶通过与腐殖质以氢键、离子键或共
价键形式结合保持其催化活性,表明土壤有机质能吸附并保
护不同蛋白免受降解. Cr ecchio 等[ 6]根据 Btk 纯化毒素蛋白
与 4 种不同土壤纯化的腐殖酸的结合研究,确定土壤腐殖酸
是否和土壤活性毒素存在有关. 研究表明, Btk 毒素能迅速
与从土壤提取的腐殖酸( humic acids)结合. 结合受腐殖酸的
各种功能性基团含量的影响. 结合态毒素仍保持杀虫活性,
且与腐殖酸结合后的毒素比游离态毒素更抗降解.其研究亦
表明,转基因植物体内的毒素在土壤中以易于被生物降解的
游离态存在的时间并不长,因而,土壤中的毒素能被积累并
保持杀虫毒性,这会增加对非目标生物的危害和增加目标昆
虫的选择抗性.土壤有机质以及土壤矿质元素的构成可以减
小土壤中毒素的生物降解性和保持其活性,因而与土壤中毒
素的积累和存在有关[ 43~ 47] .
53
土壤有机矿质复合体


因为有机矿质复合体被认为比黏土或腐殖质更能代表
现实土壤,可以代替整个土壤来预测土壤环境中生物大分子
(如蛋白质、DNA)的命运.通过这种方式, 许多采用整个土壤
进行研究产生的问题能被最小化. 例如,比色分析中溶解的
有机物质的影响;高压灭菌过程中对土壤结构的改变; 生物
大分子与土壤表面的非同质性的相互作用. 而且, 在实验室
条件下, 通过对比吸附和解吸过程, 可以评价不同活性表面
土壤颗粒的贡献、有机 C 含量、离子交换能力、特殊外表面
积、代表最大吸附量的黏土膨胀度、最适 pH 和吸附机制的
不同影响. Cr ecchio 等[ 7]研究了 Btk 活性毒素与蒙脱石
腐殖
酸
Al羟基聚合体混合物的稳态吸附和结合, 以及结合态毒
素的生物降解和杀虫活性.结果表明, 在 1h 内,吸附达到总
吸附量的 70% , 在 8h 内产生了最大吸附. 毒素吸附复合物
的常量随毒素量的增加而增加, 稳态吸附的等温线为 L
型.
因毒素与土壤颗粒活跃表面的结合,通过转基因植物的释放
导致土壤中毒素的积累.而这一残留能造成对非目标生物的
伤害,增加了目标昆虫对毒素的抗性.
6
转 Bt基因作物释放的毒素与土壤性质的关系
61
根系分泌物与毒素


作物在生长发育过程中向土壤中释放一些化学物质(其
中一些具有特殊的生理功能,如铁载体、根系磷酸酶、有机酸
类、化感物质及调节共生关系的信号物质等) , 影响植物自身
的生长发育及根际生态系统的组成和功能. Sax ena 等[ 34]将
灭菌或非灭菌土壤试管中的幼苗根际土壤用缓冲提取液旋
转离心,然后用免疫法和杀虫性检测法分析上清液, 发现即
使转 Bt基因玉米生长 25d 后, 其根圈中分泌的毒素蛋白仍
具有杀虫毒性, 但是从种植非转 Bt 基因玉米的土壤中取样
测定,结果则无杀虫毒性. 用根际土壤的悬浮颗粒直接进行
生物检测,具有与上清液相当的杀死率. 虽然每克根际土壤
大约有 95!g蛋白, 但由于根际土壤缓冲提取液中的实际毒
素浓度太低, 以至不能用 SDS
PAGE 方法检测到.这些结果
与早期的关于纯化毒素快速与土壤活性表面颗粒结合,并保
持杀虫毒性, 且免于生物降解的研究结果是一致的.
6 2
花粉与毒素


绝大多数转 Bt基因玉米杂交种的花粉表达有 Bt 毒素.
玉米花粉落到玉米田附近的其它植物上, 能被非目标生物取
食[ 11] . Losey 等[ 28]研究发现, 饲喂污染有转 Bt 基因玉米花
粉的马利筋可杀死斑蝶幼虫. 花粉中毒素在土壤中的存活特
性及与土壤性质的关系研究目前尚未见报道.
6 3
转 Bt基因作物植株体与毒素


转基因作物收获后, 剩余的含有毒素的根茬和生长凋落
物等仍残留在土壤中, 因而有必要研究转 Bt 基因作物植株
体杀虫蛋白的表达量及其残余物降解后毒素的土壤存活特
性.对转 Bt基因作物植株体杀虫蛋白的表达, 吴刚等[ 57]、张
永军等[ 60]分别对# 克螟稻∃和转 Bt 基因棉花进行了研究. 结
果表明,杀虫蛋白的表达表现出了一定的时空特性. 在时间
上, 不同生育时期的表达量有所不同;在空间上, 不同组织器
官的杀虫蛋白表达量也有显著差异. 这些研究结果尚需与植
物生长凋落物中毒素存活特性进一步结合, 从而确定毒素在
植株体中存在的终时间和终状态.


Bt 玉米的根际土壤在整个生长季和其死后的几个月以
及随后的霜冻期间也存在毒素[ 35] . 当纯化的 Btk 毒素加入
到非灭菌土壤中, 234d 后对于烟草天蛾幼虫仍具有杀虫活
性[ 48] .这一存在时间长于文献报道的半减期( half time) , 即
对于纯化毒素约为 8~ 17d; 对于转基因玉米、棉花和马铃薯
生物体中的毒素为 2~ 41d[ 30, 31, 37, 38] . 不论在离体还是在土
壤中, 将结合毒素暴露于微生物,毒素仍保持杀虫活性,即使
对土壤进行 40d 冻融和干湿交替处理也是如此. 在离体条件
下,游离或结合态毒素对细菌(无论是革兰氏阳性或阴性 )、
真菌(无论是酵母菌或丝状的, 如接合菌、子囊菌、半知菌 )、
藻类(主要是绿藻和硅藻)的生长没有影响, 与现场观察到的
转 Bt 基因作物通常对微生物无持续影响的结果一致[ 10] .
Sax ena等[ 36]研究了 Bt 玉米根系分泌物和生物体中释放的
毒素对土壤蚯蚓、线虫、原生动物、细菌和真菌的影响. 离体
和现实的研究表明, Bt 玉米根系分泌物和生物体释放的毒
素快速与土壤表面活性颗粒吸附和结合并且至少保持 180d
杀虫活性(分泌物和生物体的致死率分别为 56% ( 11. 9%
和 68% ( 11. 9% ) , 但 Bt 玉米根系分泌物或 Bt 玉米生物体
降解释放的毒素对于土壤蚯蚓、线虫、原生动物、细菌和真菌
1480 应
用
生
态
学
报
















13卷
没有毒性. 在种植 Bt 玉米或以 Bt 玉米生物体改良的土壤
中,蚯蚓的中肠和排泄物中存在毒素, 但对于蚯蚓来说, 仍无
明显毒性. 这些仅是初步研究结果, 即仅仅针对蚯蚓中的 1
个种类和针对培养细菌、线虫、原生动物及真菌的总数进行
了测定,关于生物体组群的多样性和构成的详细情况仍需进
一步研究.
7
展

望


转基因作物释放后与生态环境尤其是与土壤性质的相
互关系研究 ,对于进行转基因作物生态安全性评价、确保生
物技术健康发展具有重要意义. 在上述工作的基础上, 我们
认为欲监测转 Bt 基因作物释放可能引起的风险, 尚需加强
以下几个方面的研究: 1)国外学者们的研究, 往往是针对纯
化毒素或实验室内的单因子研究,而转基因作物释放的现实
环境为大田,作物产量的形成亦是土、肥、气、热、水等多因子
综合作用的结果,因而有必要开展大田条件下的综合研究,
将室内与大田研究相结合,更能反映作物生产的实际情况.
2)转 Bt基因作物向环境释放的毒素来源于植株体, 因而有
必要对毒素在植株体内存在的状态、消长时间、毒性, 尤其是
对作物生长凋落物、残余物的化学组成(其中木质素含量、木
质素与 P及木质素与 N 的比例, C/ N )、毒素的含量及活性变
化(碱溶性、酶解性、生物活性)开展研究. 3)根际是植物、土
壤和微生物密切相关的一个区域,因而转基因作物毒素进入
土壤后与土壤特性是何种关系仍需进行大量研究,要确定毒
素与根际土壤理化性质(如 pH、CEC、机械组成、腐殖质组分
及总酸度)、土壤生物活性(如土壤中与营养物质转化密切相
关的酶活性变化)、土壤不同种类微生物种群数量的关系如
何,将为系统评价转 Bt基因作物释放可能引起的生态环境
风险提供理论依据.
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作者简介
孙彩霞, 女, 1973 年生,博士后, 主要从事土壤生
态学研究. E
mail: suncaix@ yahoo. com. cn
1482 应
用
生
态
学
报
















13卷