全 文 ：收稿日期:2012-12-27 接受日期:2013-08-21
基金项目:河南省科技厅重点攻关项目(102102310019;122102310170);
河南省教育厅科学技术研究重点项目(14B360011);郑
州市科技攻关项目(20131015);河南省青年骨干教师
计划(2012-704)
* 通讯作者 Tel:86-378-3880680;E-mail:kangweny@ hotmail． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2013，25:1748-1751
文章编号:1001-6880(2013)12-1748-04
垂丝海棠抗氧化活性的研究
孔祥密1，张 伟2，李昌勤1，魏金凤1，康文艺1，2*
1河南大学中药研究所，开封 475004;2 黄河科技学院，郑州 450006
摘 要:采用清除二苯代苦味酰基(DPPH)自由基、清除 ［2，2-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐］
(ABTS)自由基及铁离子还原 /抗氧化能力(FＲAP)测定法对不同采摘月份垂丝海棠花和叶进行体外抗氧化活
性评价，并与阳性对照二丁基羟基甲苯(BHT)进行比较。结果表明:在垂丝海棠 12 个提取物中，3 月叶正丁醇
部位清除 DPPH 自由基及还原 Fe3 +(IC50 = 35． 80 μg /mL，TEAC = 869． 73 μmol /g)最强，弱于阳性对照 BHT
(IC50 = 23． 00 μg /mL，TEAC = 1532． 70 μmol /g);3 月叶乙酸乙酯提取物清除 ABTS自由基 (IC50 = 3． 50 μg /mL)
能力最强，弱于阳性对照 BHT(IC50 = 2． 30 μg /mL)。实验表明垂丝海棠 3 月采集的叶抗氧化活性总体好于 7 月
叶，并且叶的活性强于花。
关键词:垂丝海棠;抗氧化活性;DPPH;ABTS;FＲAP
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标识码:A
Study on antioxidant activity of Malus halliana Koehne
KONG Xiang-mi1，ZHANG Wei2，LI Chang-qin1，WEI Jin-feng1，KANG Wen-yi1，2*
Institute of chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China;
2Huanghe Science and Technology college，Zhengzhou 450006，China
Abstract:To study the antioxidant activity of flowers and leaves of Malus halliana Koehne harvested in different months，
1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)radical scavenging，［2，2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulphonic acid］
diamonium salt (ABTS)radical scavenging and ferric reducing antioxidant power (FＲAP)assay were applied with BHT
as positive control． Among twelve extracts of the leaves and flowers of M． halliana，the results showed that the n-butanol
extract from March leaves had the best DPPH radical scavenging activity (IC50 = 35． 80 μg /mL)and ferric reducing an-
tioxidant power (TEAC = 869． 73 μmol /g)，which were still weaker than that of the positive control BHT (IC50 = 23． 00
μg /mL and TEAC = 1532． 70μmol /g respectively)． The ethyl acetate extract of leaves collected in March exhibited the
highest free radical scavenging activity (IC50 = 3． 50 μg /mL)，but it was still inferior to positive control BHT (IC50 =
2. 30 μg /mL)． It demonstrated that antioxidant activity of M． halliana was weak． The extract of leaves harvested in
March had better activities than that of leaves harvested in July，and the antioxidant activities of extract of leaves were
higher than that of flowers．
Key words:Malus halliana Koehne;antioxidant activity;DPPH;ABTS;FＲAP
蔷薇科苹果属落叶乔木垂丝海棠(Malus halli-
ana Koehne)别名海棠、海棠花和垂枝海棠，是中国
的特有植物。分布于四川、安徽、陕西、江苏、浙江和
云南，主要为观赏植物栽培，有重瓣、白花等变
种［1］。其味淡、苦，性平，入肝经，具有调经和血的
功效，主治血崩［2］。目前，国内外对垂丝海棠化学
及生物活性的研究报道极少，主要集中在栽培、育苗
和生物技术方面［3，4］，仅有我们课题组对垂丝海棠
花蕾和花的挥发性成分进行了研究［5］以及少量关
于保健饮品开发方面的报道［6］，但未见垂丝海棠抗
氧化等生物活性的报道。
本文首次采用清除二苯代苦味酰基(DPPH)自
由基方法、清除［2，2-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-
磺酸)二氨盐］(ABTS)自由基方法、铁离子还原 /抗
氧化力能力测定法(ferricreducing /antioxidant power
assay，FＲAP法)对垂丝海棠抗氧化活性进行了综合
考察，为全面评价垂丝海棠花和叶，合理开发利用垂
丝海棠资源提供了理论依据。
DOI:10.16333/j.1001-6880.2013.12.030
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
垂丝海棠花和叶分别于 2012 年 3 月和 7 月采
自河南大学药用植物园，经河南大学中药研究所生
药教研室李昌勤副教授鉴定为蔷薇科苹果属植物垂
丝海棠(Malus halliana Koehne)，标本存于河南大学
中药研究所;二苯代苦味酰基自由基(1，1-diphenyl-
2-picrylhydrazyl，DPPH，日本东京化成工业株式会
社);BHT(二丁基羟基甲苯，比利时 Acros organic 公
司);Fe3 + -三吡啶三哑嗪［2，4，6-Tri(2-pyridyl)-s-tri-
azine，TPTZ;比利时 Across organics 公司］;Trolox(6-
hydroloxy -2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic
acid，Aldrich) ;其他试剂均为分析纯。
UV-2000 型紫外可见分光光度计(上海尤尼科
仪器有限公司);电子天平(美国 Mettler-Toledo 公
司);旋转蒸发仪(东京理化);Multiskan MK3 酶标
仪(美国 Thermo Electron 公司);MS-H1 型混合器
(北京博励阳科技公司)等。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 活性成分的提取
自然干燥的垂丝海棠花与叶粉碎，70%乙醇浸
泡 2 次，其中，叶 50 ℃下依次浸泡 1，1 h，花依次室
温下浸泡 3，2 d，合并、过滤、浓缩，得垂丝海棠花和
叶 70%乙醇提取物，提取物分散于水中，依次用石
油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取回收溶剂，得到花
和叶的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位。
1． 2． 2 抗氧化活性筛选方法
1． 2． 2． 1 DPPH法
按照文献［7，8］，将 10 μL样品溶液和 175 μL 200
μmol /L的 DPPH溶液先后加入到 96 微孔板中，阴
暗处反应 20 min后，用酶标仪在 515 nm处测定 OD
值。每份样品平行操作 3 次，取平均值。按照公式
计算清除率:
DPPH自由基(%) = ［(Acontrol-Asample)/Acontrol］
× 100%，式中 Acontrol为 DPPH 本身在测定波长的吸
收度，Asample为样品对 DPPH 作用后的吸收度数值
(除去样品自身吸收)。
1． 2． 2． 2 ABTS法
参照文献［9］，将粉末状 ABTS用蒸馏水溶解，配
制成 7 mmol /L 的溶液，将配 2． 45 mmol /L 的
K2S2O8 溶液混合，使用前在暗处放置 12 h 以上，使
用时用甲醇稀释使吸光度在 734 nm 处为 0． 78 ～
0. 82，待用。样品初始浓度为 2． 0 mg /mL。取 10
μL样品加入 200 μL ABTS 自由基工作液混匀测定
吸光度。每份样品平行 3 次，取平均值。按照以下
公式计算清除率:
ABTS自由基清除率(%) = ［(Acontrol-Asample)/
Acontrol］× 100%，式中 Acontrol为 ABTS 自由基本身在
测定波长的吸收度，Asample为样品对 ABTS 自由基作
用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。
1． 2． 2． 3 FＲAP法
参照文献［10］，将样品用甲醇配制成一系列浓
度，取 10 μL样品加入到 96 微孔板中，加入 200 μL
新鲜配制的 TPTZ 工作液，混匀，37 ℃反应 30 min
后，用酶标仪在 593 nm测定吸光度。每份样品平行
操作 3 次，取平均值。若所测定样品吸光度值超过
线性范围，则需要进一步稀释样品。
1． 2． 2． 4 结果测定
根据计算所得的清除率，运用 origin 6． 0 软件处
理，得到样品清除 ABTS 自由基和 DPPH 自由基的
半数清除率 IC50值。
2 结果与分析
2． 1 DPPH法
表 1 为垂丝海棠各提取部位的抗氧化活性测定
结果。由表 1 可以看出，7 月采集的叶石油醚部位、
正丁醇部位、3 月采集的叶石油醚部位和 3 月采集
的石油醚部位在初筛浓度为 2 mg /mL 时的清除率
分别为 6． 91%、49． 98%、4． 48%和 8． 44%，清除率
均低于 50%，没有进入清除 DPPH 自由基的复筛标
准。不同月份的叶对 DPPH自由基的初筛清除率顺
序为 3 月叶正丁醇部位 ＞ 3 月叶 70%乙醇提取物 ＞
3 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 7 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 7 月
叶 70%乙醇提取物，其中 3 月叶正丁醇部位清除
DPPH自由基的能力最强;同月份的叶和花对 DPPH
自由基的初筛清除率顺序为 3 月叶正丁醇部位位 ＞
3 月花正丁醇部位 ＞ 3 月花乙酸乙酯部位 ＞ 3 月叶
70%乙醇提取物 ＞ 3 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 3 月花
70%乙醇提取物，可以看出同月份的花和叶的不同
提取部位清除 DPPH自由基不同。
2． 2 ABTS法
结果见表 1 和图 1。表 1 显示，在实验浓度的
范围内，垂丝海棠各部位不同溶剂提取物在初始浓
度为 2 mg /mL时，7 月叶石油醚、3 月叶石油醚部位
对 ABTS自由基的清除率均 ＜ 50%。
9471Vol. 25 孔祥密等:垂丝海棠抗氧化活性的研究
表 1 垂丝海棠各提取部位的抗氧化活性
Table 1 Antioxidant activities of different extracts of M． halliana
提取部位
Extracts
DPPH ABTS FＲAP
清除率
Scavenging rate
IC50
(μg /mL)
清除率
Scavenging rate
IC50
(μg /mL)
TEAC
(μmol /g)
7 月叶 PE 6． 91 NT 37． 42 NT NT
7 月叶 EA 62． 56 75． 80 95． 60 6． 10 405． 48
7 月叶 BU 49． 98 NT 98． 53 8． 10 426． 18
7 月叶 70%乙醇提取物 57． 77 91． 20 98． 65 11． 70 290． 78
3 月叶 PE 4． 48 NT 46． 15 NT NT
3 月叶 EA 80． 21 41． 80 99． 32 3． 50 775． 89
3 月叶 BU 85． 78 35． 80 98． 20 5． 40 869． 73
3 月叶 70%乙醇提取物 82． 73 54． 10 97． 13 7． 70 684． 87
3 月花 PE 8． 44 NT 74． 81 65． 70 NT
3 月花 EA 83． 99 45． 80 98． 33 3． 80 849． 38
3 月花 BU 84． 30 43． 60 99． 44 5． 80 724． 35
3 月花 70%乙醇提取物 76． 95 57． 90 96． 45 5． 80 559． 99
BHT 58． 35 23． 00 100． 40 2． 30 1532． 70
注:NT为未测定。
Note:NT means not measured．
150
100
50
0
A
BT
S
自
由
基
清
除
率（
%
）
A
BT
S%
fre
e%
ra
di
ca
l%
sc
av
en
gi
ng
%ra
te
0 20% 40% 60% 80 100
抗氧化质量浓度（μg/mL）
Anti鄄oxidation%concentration
7月垂丝海棠叶乙酸乙酯
7月垂丝海棠叶正丁醇
7月垂丝海棠叶 70%乙醇提取物
3月垂丝海棠叶乙酸乙酯
3月垂丝海棠叶正丁醇
3月垂丝海棠叶 70%乙醇提取物
3月垂丝海棠花石油醚
3月垂丝海棠花乙酸乙酯
3月垂丝海棠花正丁醇
3月垂丝海棠花 70%乙醇提取物
阳生对照 BHT
图 1 不同提取部位质量浓度对 ABTS自由基的影响
Fig. 1 Effects of different extracts of M． halliana on ABTS
free radical
图 1 显示，当质量浓度为 0． 125 mg /mL时，7 月
叶 70%乙醇提取物、3 月叶 70%乙醇提取物、7 月叶
正丁醇部位对 ABTS 自由基的清除率都较低，分别
为 18． 95%、39． 05%和 40． 44%，随着质量浓度的增
加，清除率也增大;当质量浓度为 2 mg /mL 时，清除
率分别为 98． 65%、97． 13%和 98． 53%。可得出提
取物清除 ABTS自由基的能力与质量浓度呈正量效
关系，随着提取用量的增加，其对 ABTS 自由基的清
除率也随之增大，当 7 月叶 70%乙醇提取物、3 月叶
70%乙醇提取物、7 月叶正丁醇部位在质量浓度 ＜ 1
mg /mL时，呈线性关系;当质量浓度 ＞ 1 mg /mL 时，
清除率几乎不变，说明抗氧化作用已经接近饱和。3
月份的叶和花的不同溶剂提取部位(除 3 月花石油
醚部位)清除 ABTS 自由基的能力均与质量浓度成
线性增加。
不同月份叶对 ABTS 自由基的清除率顺序为 3
月叶乙酸乙酯部位 ＞ 7 月叶 70%乙醇提取物 ＞ 7 月
叶正丁醇部位 ＞ 3 月叶正丁醇部位 ＞ 3 月叶 70%乙
醇提取物 ＞ 7 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 3 月叶石油醚部
位 ＞ 7 月叶石油醚部位;同月份的花和叶清除 ABTS
自由基能力的顺序为 3 月花正丁醇部位 ＞ 3 月叶乙
酸乙酯部位 ＞ 3 月花乙酸乙酯部位 ＞ 3 月叶正丁醇
部位 ＞ 3 月叶 70%乙醇提取物 ＞ 3 月花 70%乙醇提
取物 ＞ 3 月花石油醚部位。
2． 3 FＲAP法
表 1 显示，垂丝海棠石油醚部位对 Fe3 +几乎没
有还原能力，垂丝海棠其它各提取部位还原 Fe3 +能
力均弱于阳性对照 BHT，其中 3 月叶正丁醇部位还
原 Fe3 +能力最强(TEAC 为 869． 73 μmol /g)低于阳
性对照 BHT(TEAC为 1532． 70 μmol /g)。不同月份
叶各提取部位还原 Fe3 +能力顺序为 3 月叶正丁醇
部位 ＞ 3 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 3 月叶 70%乙醇提取
物 ＞ 7 月叶正丁醇部位 ＞ 7 月叶乙酸乙酯部位 ＞ 7
月叶 70%乙醇提取物;同月份的各部位的不同有机
溶剂提取物还原 Fe3 +能力的顺序为 3 月叶正丁醇
部位 ＞ 3 月花乙酸乙酯部位 ＞ 3 月叶乙酸乙酯部位
0571 天然产物研究与开发 Vol. 25
＞ 3 月花正丁醇部位 ＞ 3 月叶 70%乙醇提取物 ＞ 3
月花 70%乙醇提取物。
实验结果表明不同月份的叶各提取物的抗氧化
能力不同，3 月份叶抗氧化性明显好于 7 月，同月份
的花和叶的活性差异不大。
3 结论
本文采用了 DPPH、ABTS 和 FＲAP 三种方法对
垂丝海棠进行了体外抗氧化活性的考察。结果表
明，垂丝海棠花和叶的乙醇提取物、正丁醇部位和乙
酸乙酯的抗氧化活性好于石油醚提取物。3 月叶正
丁醇部位清除 DPPH 自由基和还原 Fe3 +能力最好，
其抗氧化活性明显优于其它提取物，3 月叶抗氧化
活性总体强于 7 月叶，并且叶的活性好于花。
叶和花的抗氧化活性不同可以从代谢组学方面
考虑，同一植物不同部位或不同时期的代谢种类和
含量有可能发生变化，Fiehn［11］利用 GC /MS 对笋瓜
的叶柄管抽提物和叶片抽提物进行了代谢物分析，
通过与质谱数据库比对，比较出了叶柄与叶片间代
谢物组分的不同。3 月叶具有很好的抗氧化活性，
可以考虑运用代谢组学方法研究叶是否具有保肝作
用及其作用机制。
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