全 文 ：应 用 生 态 学 报 叫 年 月 第 卷 第 期
〕 , 一
生抱噬纤维粘菌基因文库的构建和纤维素
酶基因的克隆
‘
张立新 中国科学院沈阳应用生态研究所
, 沈阳 “ ‘ ,
刘纯强 蒯 军 高培基 汕东大学微生物研究所脐南
摘要 】 将生抱噬纤维粘菌 户。 止 染色体用 部分酶切后 , 连接到大
肠杆菌 质粒载体 上 , 然后转化 , 从而建立 的基因文库 ,
并筛选一个含有内切葡聚糖纤维素酶 的阳性克隆 从此阳性克隆中提取质粒再
转化 , 发现所有的氨节青霭家抗性 ’ 转化子都具有 酶活性 , 证明在大肠
杆菌 中克隆到一个 的内切葡聚糖酶基因
关键词 基 因工程生态学 生抱噬纤维粘菌基因文库 基因克隆
自岁 即 皿
时。舒 , 比 , 一 ,
, 材 况讨。舒 , 如 少 ,
一 月户户 , , 一
戒 ‘
汉门
,
一 ,
,
, ,
引 言
基因工程生态学研究 作为应用生态
学的一个分支 , 目前已成为最活跃
、进展最
快的领域之一 它利用基因工程手段使生
物物种带有新的稳定遗传的生物学性状 ,
这对丰富生物 多样性 , 促进经济建设都具
有重要意义
纤维 素资源是 自然界 中分布最广 , 数
量最多的一类可再生资源 , 但在天然条件
下 , 能直接分解利用纤维素做碳源的微生
物却很少 自 年以来 , 纤维素酶基 因
克隆的研究进展很快 , 已陆续从 几种细
菌和 种真菌 中克隆到 了纤维素酶系基
因 , 其中 多种纤维素酶基因已进行了序
列测定 生抱 噬纤维粘菌 是 山东大
学微生物研究所分离得到的一株纤维素分
解菌 , 可将纤维素底物转化为粘多糖 , 具有
潜在的应用价值 生抱噬纤维粘菌 纤
维素酶基因的克隆将有助于对纤维素酶作
用机制的研究 , 有助于纤维素酶基 因工程
生态学 的研究 , 并可为构建高效纤维素工
程菌提供基础
材料与方法
菌种和质粒
, 国家 自然科学荃金资助项 目
年 月 日收到 , 年 月 日改回
期 张立新等 生抱噬纤维枯菌荃因文库的构建和纤维素醉荃因的克隆
户砰“ , 邵 和 时门 分别作
为基 因供体菌和受体菌 质粒 是从
中纯化得到 , 其上有含 酶 切位点的
基因和 , 为基因载体
培养基
一 培养基
· 一 蛋白陈 ,
酵母浸出汁 华美 一
校 甲基纤维家 琼脂培养基
培养基 一 。 琼脂
培养荃 合
成培养墓 。陀 · 氨节青霉素
试剂 限制性核酸内切酶 , 托 ,
酶和蛋白酶 等均来 自华 美公司
试验方法
碱性磷酸酷酶处理 , 连接反应 , 感受态细胞的
制备采 用 等人 的方 法 , 染 色体
片段分离收集采用透析袋琼脂糖凝胶电泳
洗脱法 ’ 试验 中所采用 的其它方法 ’ 略有改
进 含有 克隆子的检测方法见文献 ’
酸酷酶处理后 , 载体 的 自身环化率
低于 表
衰 转化结果
血 日 妞 三
。
序号
处 理
在
平板上生长
料
连接液
不能生长 , ,
所有菌落都变红
曰
变白 , 变红 ,
卜 ,
写 ,
结 果
、、产六艺︸口尸工
生抱噬纤维粘菌基因文库的构建
从 中 提 取 染 色 体 后 , 用
进行部分酶切 然后 , 通过透析袋琼
脂糖 电泳法分离收 集 一 的染色体
片段
质粒 经 完全酶切后 , 再用
碱性磷酸酷酶脱磷 在连接反应中 , 部分酶
切的 片段和 按 的比例混
合 以 为受体 , 在 含 有氨 节青霉素
仁 · 一 , 的 平板上筛
选转化子 , 〕 由于 位于
基因 内部 , 外源 片段 的插入 可导致
。 基因的失活 , 因而在 平
板上不能形成红色菌落 由于受体菌
对 敏感 , 在 平板上不
能生长 , 所 以在此选择性平板上长出的白
色菌落即为含重组质粒的转化子 实验发
现在 平板 上 生 长 的菌落
里 , 白色 菌落占 以上 , 表 明经 碱性磷
从以上 平板上挑取
个 白色 菌 落 作 为 的基 因文库 假 定
的染色体 大小与 相当
, 而插入 的外源 片段平均大
小 为 一 一 根据
和 法 可算得从此基 因文库 中得
到 任 何 特 定 基 因 的 机 率 大 于
为了进一步验证此基因文库的可靠
性 , 再随机挑选 个转化子 , 进行质粒快
速提取和凝胶 电泳分析 , 发现这些质粒大
小各不相同 , 而且都在 以上 , 说明它
们都带有不 同大小 的 片段 由此可
见 , 此基因文库符合要求 整个基因文库的
构建和纤维素酶克隆过程如图 所示
察 , 染色体
部分漪切琼脂掩
挽胶电
片段 一 七
一 平板法挑选克 隆子 个 、
一刚果红平板法挑选 阳性克陡
圈 的 墓因克隆过程
含 基因克隆的筛选
将 以上基 因文库的 个菌落分别
点种在都含有 拼 ·
一
, 的 平