全 文 ：xylE基因用于监测根瘤菌在土壤中
存活的研究*
崔明学　张成刚　靳素英　张晓东　李明祺　李　宁　蔺继尚
(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110015)
【摘要】　通过细菌接合将质粒 pLV1016(含 xylE 基因 )转移至 Rhiz obium f redii QB1130
和 Rhiz obium leguminosarum bv. v iciae B40, xy lE 基因在根瘤菌内表达活性较高. 质粒
pLV1016携带的 xylE 基因用于监测根瘤菌在灭菌和未灭菌土壤中的存活, 结果表明,在
灭菌土壤中含质粒与不含质粒菌株存活菌数量之间无显著差异( P< 0. 05) , 大接种量有利
于细菌的生长与繁殖, B40( pLV1016)质粒丢失比例很低.以低于106 CFU
g- 1干土浓度接
种时, QB1130( pLV1016)质粒丢失率随接种浓度的降低而增大.未灭菌土壤中生物因素
抑制了释放菌株的生长,大接种量有利于细菌存活. 以低浓度( 106CFU
g- 1干土)接种时,
QB1130( pLV1016)质粒丢失比例高于 B40( pLV1016) .
关键词　xylE 基因　监测标记　根瘤菌　存活
Use of a xylE marker gene to monitor the survival of rhizobia populations in soil. Cui
M ingxue , Zhang Chenggang , Jin Suy ing , Zhang Xiaodong , L i M ingqi, L i Ning and L in
Jishang( I ns titute of App lied E cology , A cademia S inica, Shenyang 110015) . -Chin. J . Ap-
p l. Ecol. , 1996, 7( 3) : 287～292.
Xy IE gene containing plasmid pLV1016 is int roduced into Rhiz obium f redii QB1130 and
Rhiz obium leguminosarum bv . v iciae B40 by bacter ial conjugation, and the expression lev-
el of x ylE gene in rhizobia is quite high. The use of x yLE gene car r ied by plasmid
pLV1016 to monitor the surv iv al o f r hizobia in ster ile and non-sterile so ils show s t hat in
ster ile so il, there is no significant differ ence ( P< 0. 05) bet ween t he sur v ival of st rains
containing and fr ee of plasmid. Larg e inoculum quantity is advanta ge t o the g rowth and
repr oduct ion o f bacter ia , and t he loss ra te of plasmid B40 ( pLV1016) is v ery low . When
the inoculat ion is made w it h a concentr ation lower t han 106 CFU
g- 1 dry so il, the lo ss
r ate of plasmid QB1130 ( pLV1016) is increased w ith decrea sing inoculation concentr a-
tion. In non-st er ile soil, biot ic factor s can inhibit t he gr ow th o f released st rains, and
larg e inoculum quantit y is advant age to t he sur vival o f bact eria. When the inoculation is
made w ith a concentr ation lower than 106 CFU
g - 1 dry soil, the loss ra te of plasmid QB
1130 ( pLV1016) is higher than that o f plasmid B40 ( pLV1016) .
Key words　xy lE gene , Monitor ing marker , Rhizobia, Sur vival.
　　* 国家自然科学基金资助项目.
　　1995年12月19日收到, 1996年2月2日改回.
1　引　　言
有意或无意地释放于自然环境的基因
工程微生物是否会对生态系统和人类健康
造成威胁在科学界引起了很大的争议. 为
解决这一问题, 各国学者对基因工程微生
物在环境中的存活等问题开展了研究[ 1, 2] ,
建立了一种灵敏的监测基因工程微生物的
方法 [ 2, 3] . 长期以来, 抗生素抗性标记被广
泛应用于监测环境中的微生物, 但是大量
存在的抗生素抗性背景使得该标记灵敏度
大大降低. W instanley 等[ 10] 曾使用 xylE
应 用 生 态 学 报　1996年7月　第7卷　第3期　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , July 1996, 7( 3)
287～292
基因标记监测假单胞菌在水中的存活. 该
标记系统依赖于对 xylE 基因及其产物(邻
苯二酚2, 3-加氧酶,可使邻苯二酚降解为
黄色 产物, 2-hydr oxymuconic semialde-
hyde)的检测,而无需单纯依赖抗生素抗性
选择. x ylE基因曾用于监测水体中的假单
胞菌[ 9] ,而有关 xylE 基因监测根瘤菌在土
壤中存活的研究还未见报道. 根瘤菌是土
壤微生物群落的重要组成成分, 以其为模
式菌的研究对未来基因工程根瘤菌大面积
释放具有十分重要的意义. 本文着重研究
了 xylE 基因在根瘤菌中的表达和稳定性
以及 xylE 基因标记的根瘤菌在土壤中的
生存模式, 以评价 xy lE 基因作为根瘤菌监
测标记的可行性.
2　材料与方法
2. 1　菌种与培养
Rhiz obium f r edii QB1130, Rhiz obium legu-
minosarum bv . viciae B40均为中国科学院沈阳应
用生态研究所保藏菌株, 带有链霉素抗性( Sm r ) .
Escher ichia coli AB1157(携带 pLV1016质粒, 具
有氨苄青霉素抗性( Apr )、卡那霉素抗性 ( Km r )和
四环素抗性 ( T cr ) ) , 由英国 L iverpoo l 大学 C.
Winst anley 博士赠送.
根瘤菌培养于 TY 培养基或 YMA 培养基
( 28℃) , 大肠杆菌培养于 LB 培养基( 37℃) . 必要
时可向培养基中加入适当浓度的抗生素, 链霉素
( Sm )、氨苄青霉素( Ap)、卡那霉素( Km)和四环素
( T c) 的使用浓度分别为500、100、50和15
g

ml- 1.
2. 2　细菌接合
　　离心收集1 ml供体菌和1 ml受体菌指数生
长后期的培养液, 将细菌沉淀再重新悬浮于50

lT Y 培养液, 混合已悬浮好的菌液, 转移到事先
放在 T Y 固体平板表面的无菌硝酸纤维素滤膜
(
= 0. 45
m)上, 于28℃下培养16 h 后用10 ml
无菌水将滤膜上的菌体洗下, 系列稀释后, 涂选择
性 YMA 平板, 置于28℃下培养5～7 d.
2. 3　土壤准备
供试土壤为沈阳生态试验站的草甸棕壤土,
取土深度为0～20 cm , pH 为6. 1～7. 0,有机碳含
量1. 0% , 全 N 为0. 08% . 将土样风干, 过筛 ( < 2
mm ) . 连续2次在121℃下干热灭菌1 h, 得到灭菌
土样. 将已知重量的土样装在耐热的无菌聚乙烯
薄膜内, 加入适量无菌去离子水, 使含水量达21%
(水势约为0. 1 MPa) , 封好袋口,混合均匀. 取100
g 调好水势的土样装500 m l三角瓶. 培养期间定
期加水以维持土壤湿度.
2. 4　邻苯二酚2, 3-加氧酶( C230)活性测定[9]
液体培养的细菌菌液在5000 rpm 下离心20
min, 收集菌体, 用 0. 1 mol
l- 1磷酸缓冲溶液
( PBS , pH= 7. 6)洗涤2次后, 再用含10%丙酮的
PBS 悬浮菌体, 使细菌浊度 OD550= 1. 5,用超声波
仪破碎细胞300 s, 然后在17000 rpm 下离心30
min, 除去细菌碎片,得无细胞抽提液( CFE) ,用于
酶活性测定. 反应系统中加10 mmol
L- 1邻苯二
酚和 CFE 各10
l,再用 PBS 补足至3 m l, 混匀,立
即在721分光光度计375 nm 处进行测定. 以0.
1OD375
min- 1值变化作为一个活力单位 U.
2. 5　平板检测计数表达 xylE 基因活性的菌落[ 9]
xylE 基因的表达产物为邻苯二酚2, 3-加氧酶
( C230) , 该酶可使邻苯二酚降解为黄色产物. 因
此可向生成单菌落的平板表面喷洒1% (W t/ Vo l)
邻苯二酚溶液, 产生黄色反应者为阳性, 即表达
xylE 基因活性, 由于 xylE 基因在 pLV1016质粒
上受温度敏感抑制蛋白 CI857控制, 在喷洒邻苯
二酚溶液之前先在42℃下培养2 h.
2. 6　细菌释放方式和取样技术
将欲释放于土壤的根瘤菌接种至 T Y 培养液
中, 28℃下培养, 待菌体生长到指数生长期的后
期, 离心收集菌体, 用无菌的0. 9% NaCl溶液洗涤
2次, 再重新悬浮于无菌去离子水, 使菌浓达1010
CFU
ml- 1, 以4种不同的比例接种土壤, 混匀后封
住瓶口, 28℃下培养35 d. 在培养前期, 取样间隔
时间要短, 以检测接种后细菌数量的急剧变化,每
次取2 g 土样,加入20 ml 0. 1 mM 磷酸钠缓冲溶
液( pH= 7. 2)中, 用振荡混合器混合1 min,静置10
min 后取上清液,系列稀释后涂布 YMA 平板,与
28℃下培养3～5 d.
对每种处理均作3次重复,所有的实验数据均
为3次重复的平均值, 2株菌之间差异显著性用 t-
288 应　用　生　态　学　报 7卷
检验计算.
3　结　　果
3. 1　xylE 基因在根瘤菌中的表达
pLV1016具有自我转移的能力, 可以
用供、受体菌的二亲本杂交进行质粒转移.
经检测2株根瘤菌均不能编码 C230酶. 以
E. coli AB1157( pLV1016)为供体,根瘤菌
为受体做接合实验,得到R . f r edii Q B1130
( pLV1016)和 R . leg uminosarum bv . viciae
B40 ( pLV1016) . pLV1016 向 QB1130和
B40转移频率(以受体计算)分别为4. 1×
10
- 3和6. 4×10- 3. 通过对 C230酶活测定,
检测 xy lE 基因在根瘤菌中的表达活性. 将
含质粒pLV1016的根瘤菌在28℃下培养于
加 Km、A p、T c和 Sm 的200 mlYM 液体培
养基约24 h,然后将培养温度提高到42℃,
在第0、2、4、6、9、12 h 分别取10 ml培养液
测定 C230酶活性(表1) . 由表1可见, x ylE
基因在根瘤菌中可高效表达.
表1　含质粒 pLV1016 菌株的C230活性
Table 1 C230 activities of rhizobia strains containing
pLV1016( U
mg- 1)
细菌菌株*
Bacterial st rain
时间 Tim e( h)
0 2 4 6 9 12
R. f r edi i QB1130 0 5. 1 15. 3 20. 9 21. 0 21. 2
R. l eg uminosarum 0 5. 4 15. 4 20. 0 20. 9 21. 8
bv. v iciae B40
E. coli AB1157 0 6. 0 18. 6 25. 4 26. 0 26. 0
* 3株菌均含 pLV1016质粒 T hree st rains containing th e
plasm id pLV 1016.
3. 2　人工培养条件下质粒 pLV1016在根
瘤菌中的稳定性
取纯化后R . f redii QB1130( pLV 1016)
和 R . l egum inosar um bv. viciae B40
( pLV1016) , 在不加任何抗生素的 YMA
培养基上转接2次,经系列稀释后,在YMA
平板上得到单菌落,各挑100个单菌落( 100
×2) 点接 YMA+ Km+ Ap+ Tc 平板, 结
果表明全部具有 Km r、Ap r 和 T cr , 且表达
xylE 基因活性. 以上结果表明在人工培养
条件下 pLV 1016在 R. f redii和 R . legumi-
no-sarum bv. ciciae中均十分稳定.
3. 3　xylE 基因标记菌在灭菌土中的存活
3. 3. 1 R . f redii QB1130 ( pLV 1016)　在
YMA 平板上回收释放于灭菌土中的 R.
f r edii QB1130 ( pLV1016) (图1a) . 培养35
d 后, 与4种不同的接种浓度 ( 104～107
CFU
g - 1干土)相对应的种群密度均在2×
10
5～1×108 CFU
g- 1干土之间. 细菌的种
群密度在前8 d下降较快, 8 d 后回升.当以
2×107 CFU
g- 1干土为接种浓度时, 35 d
后只有极少部分细菌细胞失去 C230+ 表
型,细菌总数与表达 C230活性菌数之间无
显 著 差 异 ( P < 0. 05 ) . 以 低 于 106
CFU
g - 1干土浓度接种时, C 230+ 表型丢
图1　含质粒 pLV1016的菌株在灭菌土壤中的存活(以4
种不同的浓度释放细菌)
Fig. 1 Su rvival of s t rains containing pLV1016 in nons ter-
ile soil( T he st rains were released at four diff erent inocu-
la) .
a: R. f red ii QB1130 ( pLV 1016) , b : R . l eguminosarum
bv. v iciae B40 ( pLV1016) .——总细菌数 Hard l ines in-
dicate the total populat ion,⋯⋯表达C 230活性的细菌数
Dot ted l ines in dicate th e numbers of C 230 colones .
2893期　　　　　　　崔明学等: x y lE 基因用于监测根瘤菌在土壤中存活的研究　　　　
失率随接种浓度的降低而增大.
3. 3. 2 R . leguminosarum bv. viciae B40
( pLV1016)　在 YMA 平板上回收释放于
灭菌土中的 R. leguminosarum bv. viciae
B40( pLV1016) (图1b ) . 培养35 d 后, 与4
种不同的接种浓度( 104～107 CFU
g - 1干
土)相对应的种群密度均在1×106～9×109
CFU
g - 1干土之间. 细菌的种群密度在前3
d略有下降后即回升. 4种接种浓度的生长
趋势大致相同, 35 d 后只有极少部分细菌
细胞失去 C230+ 表型, 细菌总数与表达
C230活性菌数之间无显著差异 ( P < 0.
05) ,且质粒丢失率和接种浓度之间无相关
性.
3. 3. 3 无质粒 pLV 1016的野生型菌株　从
图2可以看出,有质粒和无质粒菌株的存活
菌数之间无显著差异( P< 0. 05) . R. f redi i
QB1130 和 R . l eguminosar um bv. viciae
B40相比, R . f redii QB1130 的存活
图2　不含质粒 pLV1016的菌株在灭菌土壤中的存活
(以4种不同的浓度释放细菌)
Fig. 2 Survival of plasmid-f ree s t rains in sterile soil ( Th e
st rains w ere released at four dif ferent inocu la) .
a: R . f r edi i QB1130; b: R . leg uminosarum bv. v ic iae
B40.
能力较差,释放于土壤后的恢复期较长.
3. 4　xylE 基因标记菌在未灭菌土中存活
图3表明, 当以107 CFU
g - 1干土接种
时, 2株菌的种群密度均呈下降趋势, R.
leguminosarum bv. viciae B40( pLV1016)
在28 d内下降约4个对数单位, 直到第35 d
种群密度维持在104 CFU
g - 1干土水平上,
R . f redi i QB1130( pLV 1016)的种群密度
在18 d 内即下降到104 CFU
g - 1干土, 直到
第35 d 种群密度维持在103 CFU
g- 1干土
水平上,当接种浓度小于106 CFU
g - 1干土
时,在18 d 后种群密度下降至检测极限以
下( 10 CFU
g- 1干土) .
图 3　含质粒 pLV1016的菌株在未灭菌土壤中的存活
(以4种不同的浓度释放细菌)
Fig. 3 Su rvival of s t rains containing pLV1016 in nons ter-
ile soil( T he st rains were released at four diff erent inocu-
la) .
a: R . f red ii QB1130; b : R. l egum inosarum b v. v i ciae B40
( pL V1016) .——总细菌数 Har d l ines indicate the total
populat ion, ⋯⋯表达 C 230活性的细菌数 Dot ted lines
indicate the n umbers of C230 colones.
培养35 d后, R . leguminosarum bv . vi-
ciae B40 ( pLV1016) 接种的土样中只有极
少部分细菌细胞失去 C230+ 表型, 表达链
290 应　用　生　态　学　报 7卷
霉素抗性的 B40总数与表达 C230活性菌
数之间无显著差异( P< 0. 05) (图3a) . 但
R. f redii QB1130 ( pLV 1016) 以低于106
CFU
g - 1干土浓度接种时, C230+ 表型丢
失率随接种浓度的降低而增大, 表达链霉
素抗性的 B40总菌数与表达 C230 活性菌
数之间差异显著( P> 0. 05) (图3b) .
4　讨　　论
4. 1　xylE 基因作根瘤菌监测标记可行性
C. Winstanley 等 [ 10]研究 xylE 基因时
发现其可在 E. coli 、Pseudomonas spp.、
K lebsiella spp. 和 Acinetobacter spp. 等革
兰氏阴性菌中表达. 本项研究结果证明
pLV1016质粒携带的 xylE 基因在根瘤菌
内也可高效表达, 在连续培养50代后,
pLV1016 质粒仍可稳定存在于根瘤菌中,
由于受温度敏感抑制蛋白 CI857的控制,
x ylE 不会对所标记的菌株造成代谢负担,
为 xylE 基因作为根瘤菌监测标记奠定了
基础.用 pLV1016 质粒成功地监测了根瘤
菌在土壤中的存活模式. R . leguminosarum
bv. viciae B40 ( pLV1016)培养于灭菌和
未灭菌土的过程中, 表达链霉素抗性的
B40总菌数与表达 C230活性菌数之间无显
著差异( P< 0. 05) , pLV1016 携带的 xylE
基因可用于监测 R. leguminosarum bv. vi-
ciae 在土壤中 的存活. 但 是 R . f redi i
QB1130 ( pLV1016)以低浓度接种于土壤
时,质粒丢失率较高,不利于对弗氏根瘤菌
在土壤中的长期监测.为克服质粒的不稳
定性所带来的不利影响,构建将 xylE 基因
插入被标记菌染色体的自杀性载体质粒的
工作正在进行.
4. 2　根瘤菌在土壤中存活模式
细菌在土壤中的存活是基因工程菌释
放于自然环境后风险评价的一个重要内
容[ 3] ,直接关系到该菌的应用前景.在自然
界,任何微生物个体都极少单独存在几乎
都是以种群的形式存在于一定的空间, 所
以对细菌存活研究也就是研究细菌种群动
态. 本实验中供试的2株根瘤菌接种土壤
后,种群密度即呈下降趋势,野生型菌株表
现出同样趋势.在研究 Pseudomonas spp.
和其它菌属在土壤中存活时, 也发现了类
似的实验结果[ 4, 6～8] .土壤与人工培养基相
比是一营养极贫乏的基质, 由营养丰富的
培养基转移到土壤后,部分细菌细胞会由
于培养条件的变化而死亡或进入休眠状
态, 导致在接种初期菌体种群密度下
降 [ 7, 8] .
当根瘤菌释放于未灭菌土壤时, 在培
养初期种群密度下降明显. 当接种浓度高
于106 CFU
g - 1干土时, 15 d 后下降速率减
慢或减为零. 与在灭菌土中的实验结果相
比,它们的存活趋势之间存在显著差异,表
明了未灭菌土中生物因素抑制外来菌的生
长繁殖.
在实验中, 当使用小接种量时, 出现缺
乏生长或迟缓期延长; 当加大接种量时,迟
缓期缩短或接种成功率增加.有3种原因可
导致这种结果: 1)种群内个体之间相互供
应必需代谢产物和生长因子, 在种群密度
低时,这些代谢物和生长因子被很快稀释
而消失在环境中, 部分细胞会由于没有能
力去吸收这些极低浓度的代谢产物和生长
因子而死亡; 2)加大接种量增加了生存能
力较强的菌株的数量; 3)大接种量的初始
接种物中死亡的细胞碎片为周围细胞的生
长繁殖提供了大量潜在的基质[ 4] .
参考文献
1　张尚通、许崇任. 1994. 转基因微生物生态学及大田
释放风险评价研究.应用生态学报, 5( 3) : 325～
330.
2　蔺继尚、崔明学、靳素英等. 1994.以转座子 T n5 作
弗氏中华根瘤菌的可识别生态学标记的研究——
2913期　　　　　　　崔明学等: x y lE 基因用于监测根瘤菌在土壤中存活的研究　　　　
Tn5的水平转移及其对 R. f r edi i T n5突变株运动的
影响.应用生态学报, 5(3) : 292～298.
3　蔺继尚、崔明学、靳素英等. 1995.温度胁迫对弗氏
根瘤菌 Tn5突变株在土壤中存活及其表型表达的
影响.应用生态学报, 6(4) : 411～416.
4 Araaujo, M . A . V . , M endon a-hagler, L. C. Hagler,
A . N. et al. 1994. S urvival of genetical ly m odified
Pseud omonas f lur escens int roduced into su bt ropical
soil microcosms . FEM S Mic robiology E cology, 13:
205～216.
5 Cruz-C ruz, N. E. et al . 1988. In s itu su rvival of plas-
mid-bearin g and plasmidles s P seu domonas aerug i-
nosa in pris t ine t ropical w aters. App l . Env ir on. M i-
crobiol. , 54: 2574～2577.
6　Davan as , B. D. an d S tosky, G. 1986. Fate in soil of a
recombinant plasm id carrying a Drosop hila gen e.
Curr ent M icr obiology, 13: 279～283.
7　El lis , W. R. , Ham, E. and S chmidt, E. L. 1984. Per-
sis tence an d recovery of Rhiz obium j ap onicum in-
oculum in a f ield soil . Ag ronomy Journal , 76: 573
～576.
8　van Els as , J. D . , Duk st ra, A. F. et al. 1986. Survival
of P seud omonas f luorescens and Baci llus subtil is in-
t roduced into two soils of dif f erent textur e in f ield
microplot s. FEMS Micr obiol . Ecol. , 38: 446～453.
9　Morg an, J. A. W. , Win stan ley, C. , et al. 1989. Di-
rect ph enotypic and g enotypic detect ion of a recom-
binant ps eudomonad r eleas ed into lake w ater. App l.
Env i ron. M icrobiol. , 55: 2537～2544.
10　Winstanley,C . , Morgan, J. A . W . , Pick up, R. W . et
al. 1989 Dif feren tial regulat ion of lambda pL and pR
promoter s by a cI r epress or in a b road-h os t-ran ge
thermoregu lated plasmid m ark er s ystem . App l. En-
v iron. Micr obiol . , 55: 771～777.
292 应　用　生　态　学　报 7卷